构筑具有所 设计代谢基因型的菌株来确认。所述代谢改造细胞或生物体还可经过适应性进化以进一步 增进4-耶、4-耶 &1、4-耶0^、800和/或腐胺生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。
[0101] 在某些实施例中，所设计菌株的4-HB、4-HBal、4-HBC〇A、BD0和/或腐胺生物合成 特性使其遗传稳定且特别可用于连续生物工艺。通过向大肠杆菌或其它宿主生物体中纳入 不同的非天然或异源反应能力来鉴别单独菌株设计策略，从而从非CoA依赖性琥珀酸半醛 脱氢酶、琥珀酰基-CoA合成酶和CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或谷氨酸酯：琥珀酸半醛转 氨酶获得产生4-HB和1，4-丁二醇的代谢途径。鉴别在大肠杆菌与酵母菌物种二者中从所 述代谢途径中的每一者生物合成4-HB的计算机代谢设计。1，4_ 丁二醇中间体丁内酯 可在pH< 7. 5的条件下，尤其在酸性条件下，例如低于pH5. 5,例如，pH< 7,pH< 6. 5,pH < 6,并且尤其在pH< 5. 5或更低下在培养中通过自发环化生成。
[0102] 经由平台的计算组件鉴别的菌株可通过遗传改造生物合成产生4-HB、l，4- 丁二 醇或其它中间体和/或下游产物的任一预测代谢改变来实际地产生。在另一实施例中，展 现生物合成产生所述化合物的菌株可进一步经过适应性进化以进一步增进产物生物合成。 适应性进化后的产物生物合成产量还可通过系统的计算组件预测。
[0103] 在其它具体实施例中，构筑微生物以表达编码从琥珀酸酯到4-HB和到4-HB-CoA 的酶促步骤的4-HB生物合成途径。相较于缺乏4-HB生物合成途径的宿主微生物，在宿主 微生物中共表达琥珀酸酯辅酶A转移酶、CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、NAD-依赖性4-羟 基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸酯辅酶A转移酶显着产生4-HB。在其它具体实施例中，通过引 入编码a-酮戊二酸脱羧酶和依赖NAD的4-羟基丁酸脱氢酶的核酸来生成利用a-酮戊 二酸酯作为底物的产生4-HB的微生物。
[0104] 在另一具体实施例中，构筑含有1，4_ 丁二醇（BD0)生物合成途径的微生物，在 4-HB存在下培养时，其生物合成BDO。BD0生物合成途径是由编码多官能醛/醇脱氢酶的 核酸或编码醛脱氢酶和醇脱氢酶的核酸组成。为了支持在4-HB底物上生长，所述产生BD0 的微生物还表达4-羟基丁酸CoA转移酶或4- 丁酸激酶以及磷酸转移羟基丁酰基酶。在另 一具体实施例中，生成经由外源性表达编码功能性4-HB生物合成途径和功能性BD0生物合 成途径的核酸来合成BD0的微生物。4-HB生物合成途径是由琥珀酸酯辅酶A转移酶、CoA 依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、依赖NAD的4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸酯辅酶A转移酶 组成。BD0途径是由多官能醛/醇脱氢酶组成。本文进一步描述用于产生BD0的其它途径 (参见图8-13)。
[0105] 在又一实施例中，本文描述在4-羟基丁醛、4-羟基丁酰基-CoA或1，4_ 丁二醇 代谢途径中发挥功能的羧酸还原酶的克隆和表达。采用羧酸还原酶而非酰基-CoA还原酶 来形成4-羟基丁醛（4-羟基丁醛）的优点包括伴随BD0产生的较低乙醇和GBL副产物形 成。本文还揭示，应用羧酸还原酶作为其它诸多途径中的一部分从三羧酸（TCA)循环代谢 物（例如，琥珀酸酯、琥珀酰基-CoA和/或a-酮戊二酸酯）产生1，4_ 丁二醇和腐胺。 [0106] 本文所用术语"非天然"在参考本发明微生物或微生物使用时打算意指，微生物具 有至少一个并非通常在参考物种的天然菌株（包括参考物种的野生型菌株）中发现的遗传 改变。遗传改变包括（例如）引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸添加、核酸 缺失和/或对微生物的遗传材料的其它功能破坏。所述修饰包括（例如）与参考物种异源、 同源或异源和同源的多肽的编码区和其功能片段。其它修饰包括（例如）修饰改变基因或 操纵子的表达的非编码调节区。实例性代谢多肽包括4-HB、4-HBal、4-HBC〇A、BD0或腐胺家 族化合物生物合成途径内的酶或蛋白质。
[0107] 代谢修饰是指从天然状态改变的生物化学反应。因此，非天然微生物可具有对编 码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。本文揭示实例性代谢修饰。
[0108] 本文所用术语"经分离"在参考微生物使用时，打算意指实质上不含在自然界中发 现参考微生物时所存在的至少一种组分的生物体。所述术语包括从在微生物天然环境中发 现其时所存在的一些或全部组分移出的微生物。所述术语还包括从在非天然环境中发现微 生物时所存在的一些或所有组分移出的微生物。因此，经分离微生物与在自然界中发现其 时或当其在非天然环境中生长、储存或存活时所存在的其它物质部分或完全分开。经分离 微生物的具体实例包括部分纯的微生物、实质上纯的微生物和在非天然培养基中培养的微 生物。
[0109] 本文所用术语"微生物（microbial) "、"微生物（microbialorganism) "或"微生 物（microorganism) "打算意指包括在古细菌域、细菌域或真核生物域内作为显微细胞存在 的任何生物体。因此，所述术语打算涵盖具有微观大小的原核或真核细胞或生物体且包括 所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，例如酵母菌和真菌。所述术语还包括可 经培养用于产生生物化学物质的任一物种的细胞培养物。
[0110] 本文所用术语"4-羟基丁酸"打算意指丁酸的4-羟基衍生物，其具有化学式C4H803 且分子质量为104. 1lg/mol(126. 09g/mol，对于其钠盐来说）。化学化合物4-羟基丁酸在相 关技艺还称为4-HB、4-羟基丁酸酯、羟基丁酸或GHB。所述术语在本文中使用时，打算 包括化合物的各种盐形式中的任一者且包括（例如）4-羟基丁酸盐（4-hydroxybutanoate) 和4-羟基丁酸盐（4-hydroxybutyrate)。4-HB的盐形式的具体实例包括4-HB钠和4-HB 钾。因此，术语4-羟基丁酸、4-HB、4_羟基丁酸酯（4-hydroxybutyrate)、4-羟基丁酸酯 (4-hydroxybutanoate)、Y-羟基丁酸和GHB以及其它相关技艺认可的名称在本文中作为 同义词使用。
[0111] 本文所用术语"单体"在参考4-HB使用时，打算意指呈非聚合或未衍生化形式的 4-HB。聚合4-HB的具体实例包括聚-4-羟基丁酸和例如4-HB与3-HB的共聚物。4-HB的 衍生化形式的具体实例是4-HB-C〇A。4-HB的其它聚合4-HB形式和其它衍生化形式也为相 关技艺已知。
[0112] 本文所用术语" 丁内酯"打算意指具有化学式C4H602且分子质量为86. 089g/ mol的内酯。化学化合物丁内酯在相关技艺还称为GBL、丁内酯、1，4_内酯、4-丁内酯、 4_羟基丁酸内酯和羟基丁酸内酯。所述术语当其在本文中使用时，打算包括所述化合 物的各种盐形式中的任一者。
[0113] 本文所用术语" 1，4- 丁二醇"打算意指丁烷的携带有两个羟基的醇衍生物，其具有 化学式C4H1(l02且分子质量为90. 12g/mol。化学化合物1，4_ 丁二醇在相关技艺还称为BD0 且是在本文中称作BD0化合物家族的化合物家族的化学中间体或前体。
[0114] 本文所用术语"4-羟基丁醛"打算意指具有化学式C4H802且分子质量为 88. 10512g/mol的醛。化学化合物4-羟基丁醛（4-HBal)在相关技艺还称为4-羟基丁醛。
[0115] 本文所用术语"腐胺"打算意指具有化学式C4H12N2且分子质量为88. 15148g/mol 的二胺。化学化合物腐胺在相关技艺还称为1，4-丁二胺、1，4-二氨基丁烷、亚丁基二胺、四 亚甲基二胺、四甲基二胺和1，4-亚丁基二胺。
[0116] 本文所用术语"四氢呋喃"打算意指对应于芳香族化合物呋喃的完全氢化类似物 的杂环有机化合物，其具有化学式C4H80且分子质量为72. 1lg/mol。化学化合物四氢呋喃在 相关技艺还称为THF、四氢呋喃、1，4_环氧丁烷、环氧丁烷、氧化环四亚甲基、氧杂环戊烷、 氧化二亚乙基、氧戊环、呋喃烧（furanidine)、氢呋喃、氧化四亚甲基。所述术语当其在本文 中使用时，打算包括所述化合物的各种盐形式中的任一者。
[0117] 本文所用术语"CoA"或"辅酶A"打算意指有机辅因子或辅基（酶的非蛋白质部 分），其存在为许多酶（脱辅基酶）形成活性酶系统的活性所需。辅酶A在某些缩合酶中发 挥功能，在乙酰基或其它酰基转移以及脂肪酸合成和氧化、丙酮酸酯氧化以及其它乙酰基 化中起作用。
[0118] 本文所用术语"实质性厌氧性"在参考培养或生长条件使用时，打算意指氧量小于 液体培养基中饱和溶解氧的约10%。所述术语还打算包括利用小于约1%氧的气氛维持的 液体或固体培养基的密封室。
[0119] 本发明的非天然微生物可含有稳定遗传改变，这是指可培养大于5代而不损失所 述改变的微生物。通常，稳定遗传改变包括持续存在大于10代的修饰，特定来说，稳定修饰 将持续存在超过约25代，并且更特定来说，稳定遗传修饰将大于50代，包括无限代。
[0120] 在基因破坏的情况下，特别有用的稳定遗传改变是基因缺失。使用基因缺失来引 入稳定遗传改变特别可用于降低在遗传改变前表型发生逆转的可能性。例如，如果需要，生 物化学物质的稳定生长偶合性产生可通过（例如）缺失一组代谢修饰内编码催化一或多个 反应的酶的基因来实现。生长偶合产生生物化学物质的稳定性可进一步经由多个显着降低 针对各受破坏活性发生多个补偿逆转的可能性的缺失来增强。
[0121] 所属领域技术人员应理解，遗传改变（包括本文所例示代谢修饰）是参考以下来 描述：适宜来源或宿主生物体（例如大肠杆菌、酵母菌或本文所揭示其它生物体和其相应 代谢反应）或所需遗传材料（例如编码所需代谢途径的相应代谢反应的酶的基因）的适宜 来源生物体。然而，鉴于已对众多种生物体进行完全基因组定序且极其熟习基因组学领域， 所属领域技术人员应能够容易地将本文所提供的教示和指导应用于基本上所有其它生物 体。例如，可通过纳入来自除参考物种外的物种的相同或类似编码核酸容易地将本文所例 示的大肠杆菌代谢改变应用于其它物种。所述遗传改变包括（例如）物种同源物的遗传改 变，一般来说且特定来说为直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因替换。
[0122] 直系同源物是一或多个因垂直传递（verticaldescent)而相关且在不同生物体 中负责实质上相同或一致的功能的基因。例如，可将小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物 水解酶视为水解环氧化物的生物功能的直系同源物。当例如基因共有足以指示其同源的 量的序列相似性时，其是因垂直传递而相关，或其是因从共同祖先进化而相关。如果基因 共有三维结构但未必共有足以指示其已从共同祖先进化到不可鉴别主要序列相似性的程 度的量的序列相似性，那么还可将其视为直系同源物。直系同源基因可编码具有约25%到 100%氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有小于25%的氨基酸相似性 的蛋白质的基因的三维结构也显示相似性，那么还可将其视为是通过垂直传递产生。将丝 氨酸蛋白酶家族成员（包括组织纤维蛋白溶酶原活化剂和弹性蛋白酶）视为是因垂直传递 从共同祖先产生。
[0123] 直系同源物包括结构或总体活性经由（例如）进化已有差异的基因或其所编码基 因产物。例如，如果一个物种编码展现两种功能的基因产物且如果所述功能已在第二个物 种中分离成不同基因，那么将所述三种基因和其相应产物视为直系同源物。对于生物化学 产物的产生（包括生长偶合产生）来说，所属领域技术人员应理解，将选择具有要引入或破 坏的代谢活性的直系同源基因来构筑非天然微生物。展现可分离活性的直系同源物的实例 是其中不同活性已在两个或更多个物种之间或在单一物种内分离成不同基因产物。具体实 例是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解分离（两种类型的丝氨酸蛋白 酶活性）分离成作为纤维蛋白溶酶原活化剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个实例是霉浆 菌5'-3'外切核酸酶和果蝇（Drosophila)DNA聚合酶III活性的分离。可将来自第一个物 种的DNA聚合酶与来自第二个物种之外切核酸酶或聚合酶中的任一者或二者视为直系同 源物，并且反之亦然。
[0124] 相比之下，旁系同源物是通过（例如）重复、之后进化趋异而相关的同源物且具有 相似或共同但不相同的功能。旁系同源物可起源于或源自（例如）相同物种或不同物种。 例如，可将微粒体环氧化物水解酶（环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶（环氧化 物水解酶II)视为旁系同源物，这是因为其代表在同一物种中催化不同反应且具有不同功 能的两种从共同祖先共进化的不同酶。旁系同源物是彼此具有显着序列相似性的来自同一 物种的蛋白质，从而表明其同源，或因从共同祖先共进化而相关。旁系同源性蛋白质家族群 组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶和其它。
[0125] 非直系同源基因替换是来自一个物种的非直系同源基因可取代不同物种中的参 考基因功能。取代包括（例如）相较于不同物种中的参考功能能够在起源物种中进行实质 上相同或相似的功能。尽管通常可将非直系同源基因替换鉴别为与编码参考功能的已知基 因在结构上相关，但结构上较不相关但功能相似的基因和其相应基因产物将仍属于所述术 语在本文中使用时的含义内。相较于编码寻求取代的功能的基因，功能相似性需要（例如） 在非直系同源基因产物的活性位点或结合区具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源 基因包括（例如）旁系同源物或无关基因。
[0126] 因此，在鉴别和构筑具有4-耶、681、4-耶&1、4-耶(：(^、800和/或腐胺生物合成能 力的本发明的非天然微生物时，所属领域技术人员通过将本文所提供的教示和指导应用于 特定物种应理解，代谢修饰的鉴别可包括直系同源物的鉴别和纳入或不活化。如果旁系同 源物和/或非直系同源基因替换存在于参考微生物中且编码催化相似或实质上相似的代 谢反应的酶，那么所属领域技术人员还可利用所述在进化上相关的基因。相似地，对于基因 破坏来说，在进化上相关的基因还可在宿主微生物中受到破坏或缺失以降低或消除靶向破 坏的酶促活性的功能冗余。
[0127] 直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因替换可通过所属领域技术人员所熟知 的方法测定。例如，对核酸序列或两条多肽的氨基酸序列的检查可揭示比较序列之间的序 列一致性和相似性。基于所述相似性，所属领域技术人员可测定相似性是否高到足以指示 蛋白质因从共同祖先进化而相关。所属领域技术人员所熟知的算法（例如Align、BLAST、 ClustalW和其它算法）比较并测定原始序列相似性或一致性，并且还测定序列中可指配 权重或评分的空位的存在或显着性。所述算法也为相关技艺已知且同样可适用于测定核苷 酸序列相似性或一致性。确定相关性的足够相似性的参数是基于计算统计学相似性（或在 随机多肽中找到相似匹配的机率）和所测定匹配的显着性的熟知方法来计算。如果需要， 所属领域技术人员还可对两个或更多个序列的计算机比较进行视觉优化。可预计，相关基 因产物或蛋白质具有高度相似性，例如，25 %到100 %序列一致