用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒的制作方法

用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种通过质谱法定量目标分析物的方法，所述方法包括获得质谱信号，所述质谱信号包括第一校准物信号、包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且潜在包含目标分析物。所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。所述方法还包括使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。
【专利说明】用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒
[0001]相关申请
本申请要求2011年6月6日提交的欧洲专利申请第11168854.5号，以及2012年5月21日提交的美国临时申请第61/649，413号的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
[0002]
发明领域
[0003]本发明通常涉及用于定量样品中一种或更多种目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置。本发明更特别地涉及质谱法分析，其中存在的单个样品包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，并且其中第一校准物、第二校准物，以及相应的目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。
[0004]发明背景
质谱法(MS)是生命科学中的主要发现工具。通过使用该分析技术，有可能通过离子化所述样品中含有的样品或分析物分子，并且然后测量所得到的离子的质荷比来分析样品的分子组成。通过MS实验获得的质谱可用于鉴别、表征，以及定量感兴趣的分析物的丰度。特别地，液相色谱-质谱法(LC-MS)最近已经被用于药物和生物活性化合物的定量，主要由于LC/MS/MS赋予的高选择性、灵敏度、速度，和简单。
[0005]对于样品中目标分析物的定量，通常必须首先建立校准曲线，所述校准曲线表示由所用的特定分析方法获得的分析信号(例如，MS光谱或质谱图中的峰面积或峰高)与目标分析物的量之间的关系。因此，在分析样品之前，必须测定一系列校准标准的分析信号(例如，六个不同浓度的分离目标分析物)并且必须定期(例如，每天)进行该外部校准。然而，该程序降低生产率，增加每个样品的成本，并且此外，使得仅一个样品的分析无效。
[0006]发明概述
本发明提供用于通过质谱法定量样品中的目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置，而不依赖于常规校准及其相关的的缺点和劣势。通常，本发明提供MS分析，其中存在包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物的单个样品，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。
[0007]除了消除常规校准品的无效以外，本发明提出基质效应的问题，所述问题造成在样品中目标分析物的定量分析中使用MS的主要问题(例如，因为与目标分析物共同提取的基质可能改变信号响应，导致差的分析准确度、线性和重现性)。例如，不同个体的样品可能在所用的分析体系中具有不同的行为并且可能与校准标准的行为不同。因此，使用常规方法的准确分析需要提供基于基质的校准标准，例如，不含目标分析物并且含有校准标准的基质。然而，可能难以获得此类不含目标分析物的基质，特别是对于通常预期存在于该基质中的目标分析物(例如，血浆中的甾体)。
[0008]此类基于基质的校准物标准的其它问题包括:(i)需要获得常规质量和组合物中大量不含目标分析物的基质；(ii)病原体测试，如果基质为人或动物来源；(iii)基质的处理、贮藏和稳定性；和(iv)基质中校准物的处理、贮藏和稳定性。此外，待分析样品可能性质非常多样化，例如，不同身体样品(例如，毛发和血浆)。因此，此类多样化样品的基质也可显著不同，从而需要两个不同组的校准标准，一个组匹配身体样品，并且一个组匹配环境样品。因此，适用于多种样品的校准标准和定量方法是有利的，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，或食品工业领域相关的样品(例如，用于研究食品样品的保留样品，例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。
[0009]然而常规方法可能需要将内标物加至样品(例如，因为常规校准物不在样品中并且，因此，须经与目标分析物不同的基质)，本发明不需要内标物因为内部校准物须经与目标分析物完全相同的基质。基本上出于相同原因，本发明可采用比常规方法更少的校准物，并且可能会获得相同的或更好的准确度和/或精密度。
[0010]因此，本发明的物质、方法、试剂盒和装置符合样品中目标分析物的有效定量的需求，特别是如果待分析样品的数量少于校准标准的数量。此外，本发明还符合对普遍适用于多种样品的校准标准和定量方法的需要，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，和食品工业领域相关的样品(例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。
[0011]通过提供以不同浓度包括两种(或更多种)内部校准物的可用于定量样品中的目标分析物的组合物，本发明符合这些，以及其它需要。内部校准物和目标分析物可根据它们在质谱仪中的行为而彼此区分。该校准标准可以稳定、易于处理和/或适用于高通量分析。
[0012]本发明提供的一个优势是可进行样品分析内的内部校准，从而避免对外部校准的需要。因此，通过使用内部校准有可能通过进行一个样品的单次分析来定量分析物，使得每次分析得到结果从而增加生产率并且降低每个样品的成本。本发明的至少一些实施方案的进一步优势在于校准标准存在于与目标分析物完全相同的基质中并且因此，每个样品具有其自身基质完全匹配的校准标准，从而减少或消除基质效应。与常规方法相比，本发明的又一优势是降低产生结果的时间并且增加生产量的潜力。
[0013]本发明的内部校准物组合物、试剂盒和方法广泛适用于多种样品，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，和食品工业领域相关的样品(例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。此外，因为内部校准物被加至待分析样品中，可以与处理目标分析物完全相同的方式处理它们，并且因此可被用于补偿样品制备期间的样品和/或分析物损失。
[0014]内部校准物包括这样的化合物，所述化合物在化学组成、结构和理化性质方面类似于相应的目标分析物，但是根据内部校准物和目标分析物在质谱仪中的行为可与目标分析物区分开。例如，内部校准物可模拟相应的目标分析物使得内部校准物的理化性质的至少一种基本上与目标分析物相应的理化性质相同。在各种实施方案中，通常在质谱仪中分析之前通过用于处理样品的一种或更多种技术，内部校准物及其相应的目标分析物无法有效地彼此区分。例如，内部校准物及其相应的目标分析物无法根据以下的一种或更多种而区分:溶解度(在溶剂，例如，水或有机溶剂，或溶剂的混合物中)、保留时间(在分离技术，例如液相色谱中)、亲和力(例如，对所述目标分析物的特异性抗体的亲和力)、解离常数、对于酶(例如，水解酶、转移酶)的反应性和/或特异性。在一些实施方案中，内部校准物通常不存在或以可忽略不计(或者说是可补偿的)的初始量存在于待分析样品中。在一些实施方案中，内部校准物通常为合成化合物，例如，不是天然存在(例如，在样品中)的化合物或其天然丰度低于质谱仪的检测限。
[0015]基于在质谱仪中的行为可区分的性质包括以下情况:其中两种或更多种化合物(例如第一或第二内部校准物和目标分析物；或第一和第二内部校准物)由于它们的质量差异(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)、碎片图，或其组合的差异，可通过质谱仪彼此区分。这两种化合物之间质量的差值可来源于不同同位素(例如，两种化合物中的一种中的低丰度同位素对比两种化合物中的另一种中的高丰度同位素)或不同化学部分(例如，不同实验式)的存在。
[0016]两种或更多种化合物的任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)可由于它们的碎片图中的差异通过分质谱仪彼此区分。两种或更多种化合物(例如一种内部校准物及其相应的目标分析物；或两种内部校准物)可在质谱分析期间基本上以相同方式成为碎片，从而对于同位素类似物，生成化学组成和结构类似的碎片(对于化学类似物，碎片可以是不相似的)。在一些情况下，两种或更多种化合物可具有相同质量和实验式，但是不同质量的碎片(例如,4D维生素D和2D、213C维生素D)。
[0017]例如，两种或更多种化合物的任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)由于它们的质量差异(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)可通过质谱仪彼此区分。两种化合物的质量(例如，第一内部校准物和目标分析物)可相差至少1(或2、3、4、5，…)质量单位，其中两种化合物是同位素类似物。其中化合物是化学类似物(例如，不同于经验式)，所述类似物可相差低于一个质量单位和/或非整数量。
[0018]一方面，本发明的特 征为用于通过质谱法定量目标分析物的方法。所述方法包括获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物。第一已知量和第二已知量不同，并且单个样品中的第一校准物、第二校准物以及目标分析物可通过质谱法各自区分。所述方法还包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。
[0019]在另一方面，本发明的特征为用于通过质谱法定量目标分析物的组合物。组合物包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。
[0020]在又一方面，本发明的特征为用于通过质谱法来定量目标分析物的试剂盒。试剂盒包括第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。试剂盒还包括对以下的说明:(i)获得质谱信号，包括来自单个样品的第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物和(ii)使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。
[0021]在又一方面，本发明的特征为计算机可读介质，包括计算机可执行指令(例如，本发明的方法的物理实施方案)。计算机可执行指令适于获得包括来自单个样品的第一校准物信号，包括第二校准物信号，并且可能包含目标分析物信号的质谱信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物。第一已知量和第二已知量不同。单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。计算机可执行指令还适于使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。
[0022]在再一方面，本发明的特征为用于通过质谱法来定量目标分析物的装置。所述装置包括被配置成通过合并可能包含目标分析物的单个样本中第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备所述单个样品的样品处理器。所述装置还包括被配置成生成的质谱信号包括第一校准物信号，包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号的质谱仪，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。此外，装置包括数据处理器，其被配置成使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。
[0023]在各种实施方案中，本发明还包括(i)通过在可能包含目标分析物的单个样本中合并第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品；以及(ii)使用质谱仪由单个样品生成质谱信号。
[0024]在一些实施方案中，本发明还包括在获得质谱信号之前分离第一校准物、第二校准物，以及来自单个样品的其它组分的目标分析物。分离可包括色谱法以及第一校准物、第二校准物，以及目标分析物共洗脱。分离可包括色谱法和第一校准物、第二校准物，以及目标分析物分别洗脱。分离可包括固相提取法、液相色谱法、气相色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法，以及超临界流体色谱法的至少一种。
[0025]在某些实施方案中，本发明还包括(i)由第一校准物信号和第二校准物信号获得校准曲线；以及(ii)使用校准曲线以及目标分析物信号来定量目标分析物。本发明可包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来代数地定量目标分析物。
[0026]在各种实施方案中，第一校准物和第二校准物各自为目标分析物的不同类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。第一校准物和第二校准物可各自为目标分析物的不同稳定同位素类似物。例如，一组或多组内部校准物的内部校准物(例如，所有组的内部校准物的内部校准物)可以是相应的目标分析物的同位素标记的类似物、相应的目标分析物的衍生物，或相应的目标分析物的代谢产物，优选相应的目标分析物的同位素标记的类似物。适合的同位素包括 2H、nB、13C、15N、170、180、33S、34S、36S、74Se、76Se、77Se、78Se 和 82Se0
[0027]本发明包括具有用于目标分析物的一种或更多种其它内部校准物(例如，除了第一和第二校准物以外，用于目标分析物的1、2、3、4、5、6、7、8、9等内部校准物)的实施方案。类似地，本发明包括分析单个样品中两种或更多种分析物的小组的实施方案(例如，对于第二目标分析物、任选的第三目标分析物、任选的第四目标分析物、任选的第五目标分析物、任选的第六目标分析物、任选的第七目标分析物、任选的第八目标分析物、任选的第九目标分析物等的每一个用两种或更多种其它内部校准物)。
[0028]在一些实施方案中，本发明还包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及(ii)使用第三校准物信号，第四校准物信号，以及其它目标分析物信号来定量单个样品中的其它目标分析物。本发明可进一步包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号，所述单个样品包含第五已知量的第五校准物，包含第六已知量的第六校准物，并且可能包含第二其它目标分析物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及(ii)使用第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号来定量单个样品中的第二其它目标分析物。
[0029]在某些实施方案中，本发明还包括⑴由质谱信号获得来自单个样品的第三校准物信号，所述单个样品进一步包含第三已知量的第三校准物。第一已知量、第二已知量和第三已知量不同。第一校准物、第二校准物、第三校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。定量目标分析物进一步包括使用第三校准物。本发明可进一步包括由质谱信号获得来自单个样品的第四校准物信号，所述单个样品进一步包含第四已知量的第四校准物。第一已知量、第二已知量、第三已知量，以及第四已知量不同。第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物和目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。定量目标分析物进一步包括使用第四校准物。
[0030]在各种实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物以及第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。本发明可进一步包括第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。
[0031]在一些实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物，其中第一已知量、第二已知量，和第三已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。本发明可进一步包括第四已知量的第四校准物，其中第一已知量、第二已知量、第三已知量，以及第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。
[0032]在某些实施方案中，本发明还包括限定至少一种样品接受器的样品架，其中第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物均包含在至少一种样品接受器内。
[0033]在各种实施方案中，本发明还包括限定至少一种样品接受器的样品架，其中第一已知量的第一校准物、第二已知量的第二校准物、第三已知量的第三校准物，以及第四已知量的第四校准物均包含在至少一种样品接受器内。
[0034]在各种实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及对以下的说明:(i)由质谱仪获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物，以及(ii)使用第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号来定量单个样品中的其它目标分析物。
[0035]在一些实施方案中，本发明还包括适于以下的计算机可执行指令:(i)引导自动代码阅读器以基于与所述给定样本有关的代码测定给定样本中的一种或更多种待测试分析物的列表；以及(ii)引导自动校准物系统以合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。
[0036]在某些实施方案中，本发明还包括被配置成在获得质谱信号之前分离来自单个样品的其它组分的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物的分离系统。分离系统可包括固相提取、液相色谱、气相色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱，以及超临界流体色谱设备中的至少一种。提取、色谱，或电泳装置可耦接于质谱仪(在线模式)或不耦接于质谱仪(离线模式)。
[0037]在各种实施方案中，样品处理器进一步包括(i)自动代码阅读器，其被配置成基于与给定样本有关的代码测定给定样本中一种或更多种待测试分析物的列表；以及(ii)自动校准物系统，其被配置成合并给定样本与一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。自动校准物系统可被配置成递送给定样本至样品接受器，所述样品接受器包含一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。自动校准物系统可被配置成为一种或更多种分析物的每一种递送第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物至包含给定样本的样品接受器。
[0038]在某些实施方案中，目标分析物是包含至少3个碳原子的有机分子。目标分析物可以是留体(例如，留体激素或性激素，例如睾酮、皮质醇、雌酮、雌二醇、17-0H-孕激素或醛固酮)；免疫抑制药物(例如，环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，或霉酚酸)；甲状腺标志物(例如，促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、游离T3、甲状腺素(T4)、游离T4，或铁蛋白)；维生素或其代谢产物(例如，维生素D2或维生素D3的25-羟基_、1，25-二羟基-或24，25-二羟基-形式)；心脏标志物(例如，肌钙蛋白或脑钠肽)；α -胎蛋白；或滥用药物(例如，阿片剂)。
[0039]在各种实施方案中，样品可包括身体样品、环境样品、食品样品、合成样品或其组合。身体样品可包括体液(例如，血浆或尿液)、粪便、身体组织(例如，活检样品)，或其提取物。环境样品的实例包括水(例如，饮用水、江河水、表面水、地下水、可饮用水、污水、流出物、废水，或浙出液)、土壤、空气、沉积物、植物群、动物群，或其提取物。食品样品可包括动物或植物来源的食品(例如，乳、面包、蛋或肉)或其提取物。合成的样品的实例为来自工业工艺、其过程中样品或其提取物的反应混合物的样品。所述工业工艺可以是生物工业工艺(例如，使用含有遗传信息并且自身能够再生或在生物系统中再生的生物材料的工艺，例如使用转染的细胞的发酵工艺)或非生物工业工艺(例如，诸如药物的化合物的化学合成或降解)。
[0040]在一些实施方案中，通过用于目标分析物的内部校准物定义的范围(例如，量或浓度)可跨越样品中目标分析物的分析范围，或预期的分析范围。(i)以最高量存在的内部校准物和(ii)以最低量存在的内部校准物之间的比例可以是至少2(例如，2: 1、3: 1、4: 1、5: 1、6: 1、7: 1、8: 1、9: UlO: I 等)。
[0041]下面的附图和实施例更详细地描述了本发明，使用附图和实施例仅用于说明目的而非限制。
[0042]附图详述
图1示出了用于选择内部校准物和以适用于分析的比例合并它们的示例性方法。
[0043]图2示出了用于定量一种或更多种样品的示例性方法。
[0044]图3显示了根据本发明的一方面的实例装置。
[0045]图4显示了使用本发明的内部校准方法分析样品的典型色谱图的实例。
[0046]图5显示了由图4中显示的数据生成的样品特异性校准曲线的实例。
[0047]图6显示了使用内部校准方法测量的睾酮QC数值与已知睾酮浓度的对比。
[0048]图7显示了 TargetLynx生成的睾酮的外部校准线。
[0049]图8显示了分析的46个血清样品中的每一种的单个内部校准线，包括样品46的五个相同样品。
[0050]图9显不了对应于观察到的最小和最大斜率的血清样品22和42的单个内部校准线。
[0051]图10显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物的内部校准测定的睾酮浓度的对比。
[0052]图11显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物加上原点的内部校准测定的睾酮浓度的对比。
[0053]图12显示了使用表11和12描述的LC和MS/MS条件的来自实验2的实例质谱图。上面给出了通过TargetLynx测定的各内部校准物和分析物的色谱峰的积分的峰面积。
[0054]图13显示了来自实施例2中的实验I的十个IPT样品的单个内部校准线。图例指示IPT样品的鉴别。回归计算中包括原点。
[0055]图14显示了来自实施例2中实验2的十九个IPT样品的单个内部校准线。图例指示IPT样品的鉴别。回归计算中包括原点。
[0056]图15显示了用于定量实施例3中尿液中的氢吗啡酮的内部校准线。
[0057]图16显示了通过实施例3中的内部校准和外部校准测定的3个QC和UTAKQC的平均氢吗啡酮浓度值的相关性。
[0058]图17显示了用于实施例3中实验2中的QC复制的内部校准分析的单个校准线。
[0059]图18显示了通过外部和内部校准测定的氢吗啡酮浓度值之间的相关性。
[0060]本发明的其它特征和优点根据以下详细描述和权利要求是显然的。
[0061]发明详述
本发明提供用于定量样品中的目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置。本发明采用第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在样品中各自区分，以定量样品中的目标分析物。第一校准物、第二校准物，和/或目标分析物例如可根据同位素取代和/或化学官能团取代来区分。以下详细描述提供关于以下的其它详情:分析物和校准物，然后是组合物、试剂盒、方法和装置，并且最后是说明性实例。
[0062]分析物
继续上文的概述，分析物或目标分析物可基本上包含质谱仪中可检测的感兴趣的任何分子。目标分析物可以是临床化学、医学、兽医、法医化学、药理学、食品工业、工作安全，和环境污染感兴趣的一种或更多种。通常，目标分析物是包括至少I个碳原子，例如1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10或更多个碳原子的有机分子。目标分析物可包括直至1，000、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20，或15个碳原子。分析物也可包括无机分析物(例如，磷化合物、硅化合物、无机聚合物等)。
[0063]临床化学目标分析物可包括生物体(例如，人体、动物体、真菌、细菌、病毒等)中存在的任何有机化合物。例如，临床化学目标分析物包括但不限于核苷碱基(例如，腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)，它们的类似物(例如，7-脱氮鸟嘌呤)，以及衍生物(例如，单、二、三磷酸盐或环磷酸盐)；激素(例如，留体激素)；氨基酸；蛋白(例如，脑钠肽)；代谢产物(例如，肌酸酐、胆红素)；心脏标志物(例如，肌酸激酶-MB);肝标志物(例如，天冬氨酸盐转氨酶)；神经递质(例如，GABA、甘氨酸、生物胺(例如多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、组胺、血清素)，乙酰胆碱、腺苷、大麻素)；药物以及它们的代谢产物(例如，镇静剂、镇定剂、抗高血压剂、麻醉剂)。
[0064]人类医学和兽医目标分析物可包括任何有机化合物，所述有机化合物在受试者中可用于疾病或病状的诊断、预防或治疗。例如，人类医学和兽医目标分析物包括但不限于疾病标志物(例如，肿瘤相关抗原)；紫外线屏蔽剂，造影剂；预防性或治疗剂(例如，变态反应原、抗生素、抗真菌剂、抗细菌剂、抗组胺剂、抗肿瘤剂、镇痛剂、减食欲剂、抗蠕虫剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗组胺剂、抗炎剂、抗偏头痛制剂、止恶心剂、抗帕金森病药物、止痒剂、抗精神病剂、解热剂、镇挛剂、抗胆碱剂、拟效感神经剂、黄嘌呤衍生物、包括钙通道阻滞剂、β阻滞剂、抗心律不齐剂、抗高血压剂、利尿剂、血管舒张剂的对心血管有效的试剂；CNS兴奋剂、抗咳嗽和感冒的试齐?、解充血剂、激素、安眠剂、免疫抑制剂、驱虫剂、肌肉松弛剂、抗副交感神经剂、拟副交感神经剂、神经兴奋剂、镇静剂、镇定剂、生理活性肽和蛋白)。
[0065]法医化学目标分析物可包括取自犯罪现场的样品中存在的任何有机化合物，例如来自受害者尸体的样品(例如，组织或液体样品、毛发、血液、精液、尿液等)。例如，临床化学目标分析物包括但不限于毒性剂、药物以及它们的代谢产物(例如，镇静剂、镇定剂、抗高血压剂和麻醉剂)、核酸、DNA、RNA、杀虫剂、天然产品、污染物和工业化合物。
[0066]药理学目标分析物可包括药物或其代谢产物或可用于药物的设计、合成和监测的任何有机化合物。例如，药理学目标分析物包括但不限于预防性和/或治疗剂，它们的前药、中间体和代谢产物。
[0067]食品工业和农业目标分析物可包括与食品、饮料，和/或其它食品工业/农业产品的安全性的监测相关的任何有机化合物。来自食品工业领域的目标分析物的实例包括但不限于留体、增塑剂、病原体标志物、杀虫剂、杀真菌剂、污染物、变态反应原(例如谷蛋白和坚果蛋白)、真菌毒素、海洋毒素，和抗生素(例如，虾中的氯霉素)。
[0068]工作场所安 全性目标分析物可包括可能存在于工作场所的任何有机可能危害化合物。例如，工作场所安全性目标分析物包括但不限于已经设定其职业暴露限度(例如，由商业、政府、管理，或行政机构)的溶剂、低挥发性物质、污染物、致癌物、毒素、杀虫剂、杀真菌剂，和任何有机物质。
[0069]环境污染(或工业)目标分析物可包括可危害环境的任何有机化合物(例如，环境中的生物体)。例如，环境污染(或工业)目标分析物包括但不限于持久性有机污染物(例如艾氏剂、氯丹、DDT、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、六氯苯、灭蚁灵、多氯化联苯、多氯化二苯并-对-二恶英、多氯化二苯并呋喃，和毒杀芬)、聚环状芳香烃(例如苯并[a]蒽和窟)、挥发性有机化合物，和环境异生物质(例如镇痛剂，例如，醋氨酚、乙酰水杨酸、双氯芬酸、可待因、布洛芬；抗生素，例如，大环内酯抗生素、磺酰胺、氟喹诺酮、氯霉素、泰洛星、甲氧苄啶、红霉素、林可霉素、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶；抗痉挛剂、例如，卡马西平、扑米酮；阻滞剂，例如，美托洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、纳多洛尔；Χ射线介质，例如，碘普罗胺、碘帕醇、碘海醇、泛影酸；细胞抑制剂；留体和激素，例如，17c1-炔雌醇、美雌醇、19-炔诺酮)。分析物也可包括无机分析物(例如，磷化合物、硅化合物、无机聚合物等)。分析物也可包括油和石油化学品(例如，矿物油等)。
[0070]目标分析物可包括氨基酸(例如，Gly、Ala、Val、Leu、lie、Pro、Phe>Trp> Cys,Met、Ser> Thr> Tyr> His、Lys、Arg、Asp、Glu、Asn、Gin、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、轻脯氨酸、甲基赖氨酸、羧基谷氨酸)、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白；核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、DNA、RNA、肽-核酸；糖、单糖、二糖、寡糖、多糖、淀粉、复合碳水化合物；脂质、月旨肪酸、脂肪、复合脂质、留体；维生素(A'BpByBpByBmC'D'DyE'FUpig ;激素(例如肽激素(例如，TRH和加压素)、脂质激素(例如，留体激素和类花生酸)、单胺来自芳香氨基酸(例如，甲状腺素和肾上腺素))、雄激素类(例如，合成代谢留体、雄烯二酮、脱氢表雄酮、双氢睾酮、睾酮)、雌激素类(例如，雌二醇、雌三醇、雌酮、17 α -炔雌醇、美雌醇)、孕激素类(例如，孕激素、19-炔诺酮)、孕激素类(例如，炔雌酮、异炔诺酮、炔雌酮乙酸盐、双醋块诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、甲基炔诺酮、去氧孕烯、孕二烯酮、诺孕酯、屈螺酮、地诺孕素、屈螺酮、烯诺孕酮(nestOTone)、醋酸诺美孕酮和曲美孕酮)；留体、例如昆虫甾体(例如，蜕皮留酮)、脊椎动物留体(例如，性留体/激素、皮质类固醇(包括糖皮质激素和盐皮质激素(例如，氢化可的松、可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、曲安奈德、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟轻松、氯氟舒松、倍他米松、地塞米松、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸阿氯米松、氟尼缩松、二丙酸倍氯米松))、合成代谢留体(例如，睾酮、去甲睾酮、以及它们的衍生物(例如在17-α位烷基化(例如，甲基或乙基)、或在17-β位酯化))、胆固醇及其衍生物(例如，羟固醇和胆汁酸))、植物留体(例如植物留醇类和油菜类固醇(例如，谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇))、真菌类甾体(例如麦角甾醇)；工业聚合物(该聚氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯酰胺)以及它们的单体；小有机分子例如药物和类药分子或其碎片。
[0071]在各种实施方案中，特别感兴趣的目标分析物包括留体(优选留体激素或性激素，例如睾酮、皮质醇、雌酮、雌二醇、17-0Η-孕激素或醛固酮)；免疫抑制药物(例如环孢菌素Α、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，或霉酚酸)；甲状腺标志物(例如促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、三碘甲状腺原氨酸(Τ3)、游离Τ3、甲状腺素(Τ4)、游离Τ4，或铁蛋白)；维生素或其代谢产物(例如维生素D2或维生素D3的25-羟基-、I, 25- 二羟基-或24，25-二羟基-形式)；心脏标志物(例如肌钙蛋白或脑钠肽)；α-胎蛋白；载脂蛋白，或滥用药物(例如氢吗啡酮、其它阿片药物，或治疗性药物)。
[0072]样品
通常，样品是包括至少一种目标分析物(例如，以上所公开的分类或类别的分析物，以及基质)的组合物。样品可包括固体、液体、气体、混合物、材料(例如，中间体一致性的材料，例如，提取物、细胞、组织、生物体)或其组合。在各种实施方案中，样品是身体样品、环境样品、食品样品、合成样品、提取物(例如，通过分离技术获得)，或其组合。
[0073]身体样品可包括来自个体身体的任何样品。在该上下文中，个体可以是动物，例如哺乳动物，例如人。其它实例个体包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、牛，或马。个体可以是患者，例如，患有疾病或疑似患有疾病的个体。身体样品可以是例如为了科学或医学测试目的，例如用于研究或诊断疾病(例如，通过检测和/或鉴别病原体或生物标记物的存在)而取得的体液或组织。身体样品也可包括细胞，例如，个体身体样品的病原体或细胞(例如，肿瘤细胞)。这些身体样品可通过包括组织活检(例如，钻取活检)的已知方法和通过取得血液、支气管吸出物、痰、尿液、粪便，或其它体液而获得。示例性的身体样品包括体液(humor)、全血、血浆、血清、脐带血(特别地，通过经皮脐带血取样(PUBS)获得的血液、脑脊液(CSF)、唾液、羊水、母乳、分泌物、败液、尿液、粪便、胎便、皮肤、指甲、毛发、脐、胃内容物、胎盘、骨髓、外周血淋巴细胞(PBL)，和固体器官组织提取物。
[0074]环境样品可包括来自环境，例如天然环境(例如，海洋、土壤、空气和植物群)或人造环境(例如，运河、隧道、建筑物)的任何样品。该环境样品可用于发现、监测、研究、控制、减轻，以及避免环境污染。示例性的环境样品包括水(例如，饮用水、江河水、表面水、地下水、可饮用水、污水、流出液、废水，或浙出液)、土壤、空气、沉积物、生物群(例如，土壤生物)、植物群、动物群(例如,鱼)，和土体(例如,开挖料)。
[0075]食品样品可包括来自食品(包括饮料)的任何样品。此类食品样品可用于各种目的，包括例如，(I)检查食品是否安全；(2)检查在食用食品时食品是否含有有害的污染物(保留的样品)或食品是否不含有害的污染物；(3)检查食品是否仅含许可的添加剂(例如，法规遵从性)；(4)检查它是否含有准确水平的强制性成分(例如，食品标签上的声明是否准确)；或(5)分析食品中含有的营养素的量。示例性的食品样品包括动物、植物或合成来源的食品(例如，乳、面包、蛋或肉)、肉、饮料，及其部分，例如保留样品。食品样品也可包括水果、蔬菜、豆类、坚果、含油种子、含油水果、谷类、茶、咖啡、中草药浸泡液(herbalinfusions)、可可、啤酒花、草药、调味料、含糖植物、肉、脂肪、肾、肝、内脏、乳、蛋、蜂蜜、鱼，和饮料。
[0076]合成的样品可包括来自工业工艺的任何样品。所述工业工艺可以是生物工业工艺(例如，使用含有遗传信息并且自身能够再生或在生物系统中再生的生物材料的工艺，例如使用转染的细胞的发酵工艺)或非生物工业工艺(例如，诸如药物的化合物的化学合成或降解)。合成的样品可用于检查和监测工业工艺的进展，以测定期望的产品的产率，和/或测量副产品和/或起始材料的量。
[0077]校准物
继续上文的概述，校准物或内部校准物是这样的化合物:在化学组成(例如，经验式)、结构(例如，原子排布和键合)，和/或理化性质方面类似于相应的目标分析物，但是可通过内部校准物和目标分析物在质谱仪中的行为而区分。校准物和分析物可具有至少相同的共有基本结构(例如，特征性的单环或多环结构，例如留烷)。
在很多实施方案中，化合物仅在它们的化学组成和/或分子量方面略有不同。例如，组合物和/或质量的差异可能是由于α)用同系物基团替代一种基团(例如，同系物基团可具有多一个或少一个碳原子(例如，可将乙基(亚乙基)视为甲基和丙基(亚甲基和亚丙基))的同系物)；m)官能团的修饰(例如，氨基的乙酰化；酯化；甲基化；轻化；水合；生物素化；酰胺、酯、硫酯、缩醛、缩酮基团的裂解；脱羧作用；脱甲基化；脱水)；αω将原子替代为元素周期表的相同族的另一原子(例如，将一种卤素替代为另一种卤素)；以及(iv)将原子替代为所述原子相应的同位素(例如，将1H替代为2H)。
[0078]此外，内部校准物可模拟相应的目标分析物使得内部校准物的理化性质的至少一种基本上与目标分析物相应的理化性质相同。理化性质可包括任何可测量的性质，所述性质的数值描述了化合物的物理和/或化学状态。例如，理化性质包括但不限于尺寸、质量、吸光度、发射、电荷、电势、等电点(PI)，流速(例如，保留时间)、磁场、自旋(spin )、溶解度、粘度、对其它物质(例如，抗体、酶)的反应性或亲和力、毒性、在给定环境中的化学稳定性，在特定物理条件下、在另一化学物质的存在下进行一系列特定转化(例如，分子解离、化学组合、氧化还原反应)的能力、极性，和疏水性/亲水性。
[0079]在各种实施方案中，通过在质谱分析之前通常用于处理样品的一种或更多种技术，内部校准物及其相应的目标分析物无法有效地彼此区分。例如，基于溶解度(在溶剂，例如，水或有机溶剂，或溶剂的混合物中)、保留时间(在分离技术，例如液相色谱中)、亲和力(例如，对所述目标分析物的特异性抗体的亲和力)、解离常数、对于酶(例如，水解酶、转移酶)的反应性和/或特异性，无法区分内部校准物及其相应的目标分析物。
[0080]内部校准物通常不存在或以可忽略不计(或者说是可补偿的)的初始量存在于待分析样品中。内部校准物可以是合成的化合物，例如，不是天然存在(例如，在样品中)的化合物或其天然丰度低于质谱仪的检测限。例如，内部校准物可以是相应的目标分析物的同位素标记的类似物，相应的目标分析物的衍生物，或相应的目标分析物的代谢产物。
[0081]同位素涉及具有相同质子数但中子数不同的核素(即，它们具有相同的原子数，并因此是相同的化学元素)。相同化学元素的不同同位素通常具有基本上相同的化学特征，并且因此在化学和/或生物系统中表现基本相同。因此，相应的目标分析物的同位素标记的类似物包括在化学组成和结构方面基本上与目标分析物相同的化合物，区别在于目标分析物的至少一个原子被其同位素替代。
[0082]在各种实施方案中，目标分析物的至少一个原子是最丰富的天然存在的同位素，并且校准物的取代的同位素是最不丰富的同位素。例如，目标分析物可包括具有1h(12c、14n、160，或8°Se)的位置并且校准物可将该位置的原子替代为2H(分别为13C、15N、170、180、33S、36S和74Se)。同位素的天然丰度可低于49%(例如，低于所有现有同位素的总量的40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、
0.07%,0.06%,0.05%,0.04%,0.03%,0.02%，或0.01%)。同位素标记的类似物可使用稳定同位素。
[0083]原子的稳定同位素可以是非放射性的或放射性的。如果稳定同位素是放射性的，它的半衰期太长以至于无法测量，例如比宇宙年龄更长的半衰期，例如，13.75xl09年或更长的半衰期。稳定同位素包括但不限于 2H、6L1、nB、13C、15N、17o、18o、25Mg、26Mg、29Si、3°S1、33S、34S、36S、37C1、41K、42Ca、43Ca、44Ca、46Ca、48Ca、46T i、47Ti、49Ti、50T i、50V、50Cr、53Cr、54Cr、54Fe、57Fe、58Fe、60Ni、61Ni、62N1、64N1、65Cu、66Zn、67Zn、68Zn、70Zn、71GaJ3Ge、76Ge、74Se、76Se、77Se、78Se、82Se、81Br,84Sr,96Zr,94Mo,97Mo,100Mo,98Ru,102Pd,106Cd,108Cd,113In, 112Sn,112Sn,114Sn,115Sn,120Te,123Te,130Ba, 132Ba, 138La,136Ce,138Sn,148Nd,150Nd, 144Sm, 152Gd, 154Gd, 156Dy,158Dy,162Er,164Er, 168Yb, 170Yb,176Liu174Hf、18ClnilTa、18CIW、1840s、1870s、19°Pt、192Pt、196Hg，和 2CI4Pb。优选的稳定同位素的实例包括2H、11B、13C、15N' 170、180、33S、34S、36S、74Se、76Se、77Se、78Se，和 82Se。
[0084]同位素标记的类似物可将一个至η个原子替代为同位素，其中η是目标分析物分子中原子的个数。在各种实施方案中，同位素标记的类似物可包括1、2、3、…、η个取代基，然后所述取代基可形成一组内部校准物。例如，第一校准物可以是具有一个取代基的类似物，第二校准物可以是具有两个取代基的类似物，第三校准物可以是具有三个取代基的类似物，以此类推。同位素标记的类似物可变化一个或更多个(例如，其中在类似物之间进行超过一次取代和/或其中同位素与最常见的天然存在的同位素相差超过一个质量单位)质量单位。给定类似物在取代位置的原子方面可以是同位素纯的。
[0085]同位素纯可意指化合物(例如目标分析物)中所含有的至少95%给定类型的原子(例如，高丰度同位素例如1H)已经被另一种(优选较不丰富的)相同元素的同位素(例如，2H)取代。例如，至少 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%、99.8%,99.9%,99.91%、99.92%、99.93%、99.94%、99.95%、99.96%、99.97%、99.98%,或 99.99%或更多种给定类型的原子可被另一种(优选较不丰富的)相同元素的同位素替代。
[0086]目标分析物的衍生物包括在化学组成方面类似于目标分析物的化合物，区别在于它们是衍生的。衍生或衍生化涉及化学化合物(起始材料)转化为产物，即，具有类似于起始材料的结构的衍生物。衍生物可呈现一种或更多种改变的(例如，相对于起始材料)理化性质，例如改变的反应性、溶解度、沸点、熔点、聚集状态，或化学组成。改变的理化性质可用于衍生物和/或起始材料的定量和/或分离。衍生化的实例包括还原(含有或不含酶)、氧化(含有或不含酶)、酰化(例如，乙酰化)、烷基化(例如，甲基化)、水解(例如，酯、酰胺、环氧化物基团)、加成(例如，双键或三键的氢化)、缩合(例如，生成亚胺键)、消除(例如，还原消除或水的消除)，和取代(例如，亲核取代或亲电取代)。
[0087]代谢产物包括中间体和代谢产物，例如有机化合物通过天然(或设计的)生物化学过程转化、降解和消除。代谢产物可以是，例如，具有低于1500Da的分子量的小分子。代谢产物可以是，或来源于，内源或外源性(例如，药物)化合物。
[0088]基于在质谱仪中的行为区分的性质包括以下情况:其中两种或更多种化合物(例如第一和第二内部校准物；第一或第二内部校准物和目标分析物；或第一内部校准物、第二内部校准物，以及目标分析物)可由于它们的质量(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)和/或碎片图的差异，通过质谱仪彼此区分。
[0089]例如，两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)可由于它们质量的不同通过质谱仪彼此区分。两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)的质量可相差至少1(或2、3、4、5，…)个质量单位，其中所述化合物是同位素类似物。质量的差值可低于一个质量单位，或者是大于一的非整数质量单位。根据仪器分离度和/或所需的分离度截断，质量的差值可以是±0.U0.01,0.001,0.0001,0.0001质量单位的差值。这些两种化合物之间质量的差值可来源于的存在不同同位素(例如，两种化合物的一个中的低丰度同位素对比两种化合物的另一个中的高丰度同位素)和/或不同化学部分。
[0090]任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)也可由于它们的碎片图的不同通过质谱仪彼此区分。化合物的碎片图涉及质谱仪中由化合物生成的化合物特异性的碎片组(例如，产物/子离子)。在MS分析期间，两种或更多种化合物(例如，校准物和相应的目标分析物、两种校准物)可以基本上以相同的方式成为碎片，从而生成化学组成和结构类似的碎片。然而，由一种化合物(例如，校准物)生成的碎片可以与由其它化合物(例如，相应的目标分析物)生成的相应的结构类似碎片不同，不同之处在于使用的仪器(或通过预定的截断)可分辨的质量差异。
[0091]可用作内部校准物的很多分子可商购获得或者可使用已知的有机合成化学方法制备。例如，可根据以下一般方案来选择内部校准物:(a)使给定目标分析物在质谱仪中成为碎片以便获得它的碎片图；(b)选择所述碎片图的特定碎片；(c)基于步骤(b)中选择的碎片来设计同位素标记的碎片，所述同位素标记的碎片与步骤(b)中选择的碎片的区别在于可分辨的质量差别并且与步骤(a)中获得的碎片图的其它碎片和离子可区分；(d)设计同位素标记的内部校准物，所述同位素标记的内部校准物将在质谱仪中产生步骤(C)中设计的同位素标记的碎片；以及(e)制备所述同位素标记的内部校准物。
[0092]图1显示了流程图，所述流程图概述了用于选择根据本发明用于MS基测定的内部校准物的另一示例性方法。
[0093]步骤1.1包括选择分析物。可基于用户的需求和/或根据本文所述的分析物的目录和列表选择分析物。
[0094]步骤1.2包括测定选择的分析物的MS行为。例如，可通过使用选择用于最终测定(例如，MS, MS/MS，高分辨率等)的MS方法分析所选择的分析物来测定MS行为，以确定诸如分析物质量、离子化特征、碎片特征等的一种或更多种性质。
[0095]步骤1.3并入来自步骤1.2的信息以拟定一种或更多种内部校准物结构。例如，当内部校准物是稳定同位素标记的类似物时，适合的标记位置可被鉴别为在前体离子和产物离子(如适用)中提供足够的附加质量，使得分析物和所有内部校准物可彼此区分并且它们的响应可通过MS独立测量。
[0096]步骤1.4包括筛选干扰的典型样品，其使用拟定内部校准物的预测MS参数。例如，该步骤可包括分析典型样品(例如，经处理的血浆、尿液、饮用水)的子步骤1.4.1使用拟定内部校准物的拟定MS参数(例如，使用以MRM模式与串联四极MS联用的LC)以监测拟定的内部校准物的特定前体 > 产物跃迁。该分析可鉴别典型样品中预期的干扰，所述干扰也会干扰测定。因此，如果预期在最终测定中有干扰，则在购买或合成内部校准物之前可以重新设计拟定的内部校准物，从而将开发测定的时间和成本降至最低，并且将开发稳健的、成功的测定的几率最大化。
[0097]步骤1.5包括测定是否对一种或更多种内部校准物存在干扰。如果存在干扰，则测定的开发方应当返回步骤1.3，以拟定预期避免干扰的新内部校准物结构。如果不存在材料干扰(或如果可以补偿干扰)，则测定的开发方可进行下一步骤。
[0098]步骤1.6包括获得步骤1.5中选择的内部校准物。所选择的内部校准物可获自商业来源或通过定制合成。对于稳定同位素标记的内部校准物，合成可提供在分子的适合部分的适合的同位素标记。对于类似物内部校准物，合成可提供修饰的氨基酸序列，例如用于肽或蛋白分析物的分析。合成可提供一种或更多种期望的性质，允许分析物和内部校准物彼此区分，并使用质谱法独立测量它们的响应。
[0099]步骤1.7包括使用优化的MS参数对比分析物的标准参考来分析所选择的内部校准物。例如，该步骤可包括测定各内部校准物对比分析物标准的相对响应的子步骤1.7.1。
[0100]步骤1.8包括将相对响应因子或浓度值分配至内部校准物储备物质。由于原子被稳定同位素标记取代(例如，1H被2H取代)，或在类似物内部校准物、氨基酸的取代；官能团的取代等情况下，内部校准物可具有与母体分析物相比略微不同的离子化效率或碎片效率。或者，在其中仅少量内部校准物可用的情况下，可能无法制备具有准确已知浓度的溶液。因此在特定情况下，有必要测量内部校准物的MS响应对比感兴趣的分析物的已知浓度的响应。在一些实施方案中，已知浓度将起源于参考标准，例如，来自NIST。测量可用于计算相对响应因子和/或将明显的分析物浓度值分配至内部校准物溶液。例如，对于具有90%的相对响应的内部校准物，在特定情况下有利的是，通过将结果除以0.9来校正样品中测定的分析物浓度，或将浓度值分配至内部校准物(即0.9x内部校准物的真实浓度)。
[0101]步骤1.9包括以限定的比例制备内部校准物的混合物，使得当并入测定时各校准物表现出分析物的不同已知浓度，并且内部校准物共同形成涵盖适合的范围的校准。可通过各种方法将内标物混合物并入测定，所述方法例如:在样品制备期间手动添加校准物溶液；将限定体积的样品添加至预先装载内部校准物的试管或其它容器；通过样品制备装置将内部校准物溶液自动添加至样品，所述样品制备装置可以直接或间接(例如，经由色谱装置)耦接到质谱仪或可以是集成的分析仪的一部分。也有可能通过以上方法的任一种加入多组内部校准物至单个样品，使得单次测定可生成多种分析物的结果。在上文的概述和下文的组合物部分中讨论了校准物组合物的进一步描述和实例。
[0102]表I列出了应用结合图1讨论的方法的结果，以开发稳定同位素标记的和/或类似物内部校准物用于五个不同应用领域中各种分析物的定量。
【权利要求】
1.一种通过质谱法定量目标分析物的方法，所述方法包括: 获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物， 其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括: 通过合并在可能包含所述目标分析物的单个样本中的所述第一已知量的所述第一校准物和所述第二已知量的所述第二校准物来制备所述单个样品；和使用质谱仪由所述单个样品生成所述质谱信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括: 在获得所述质谱信号之前，将所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物与所述单个样品的其它组分分离。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括色谱法和所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目 标分析物共洗脱。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括色谱法和所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物分别洗脱。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括固相提取法、液相色谱法、气相色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法，以及超临界流体色谱法中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中定量所述目标分析物包括: 由所述第一校准物信号和所述第二校准物信号获得校准曲线；和 使用所述校准曲线和所述目标分析物信号来定量所述目标分析物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中定量所述目标分析物包括: 使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来在代数上定量所述目标分析物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括: 由所述质谱信号获得第三校准物信号、第四校准物信号，以及来自所述单个样品的其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物， 其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及所述其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 使用所述第三校准物信号、所述第四校准物信号，以及所述其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述其它目标分析物。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括: 由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号，所述单个样品包含第五已知量的第五校准物，包含第六已知量的第六校准物，并且可能包含第二其它目标分析物， 其中所述第五已知量和所述第六已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述第五校准物、所述第六校准物、所述目标分析物、所述其它目标分析物，以及所述第二其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 使用所述第五校准物信号、所述第六校准物信号，以及所述第二其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述第二其它目标分析物。
13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括: 由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第三校准物信号，所述单个样品进一步包含第三校准物的第三已知量， 其中所述第一已知量、所述第二已知量，以及所述第三已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分，和 其中定量所述目标分析物进一步包括使用所述第三校准物。
14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括:` 由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第四校准物信号，所述单个样品进一步包括第四已知量的第四校准物， 其中所述第一已知量、所述第二已知量、所述第三已知量，以及所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物和所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分，和 其中定量所述目标分析物进一步包括使用所述第四校准物。
15.一种用于通过质谱法定量目标分析物的组合物，其包含: 第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物、类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。
17.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含: 第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及所述其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。
18.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包括: 第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中所述第五已知量和所述第六已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述第五校准物、所述第六校准物、所述目标分析物、所述其它目标分析物，以及所述第二其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。
19.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含: 第三已知量的第三校准物，其中所述第一已知量、所述第二已知量，以及所述第三已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。
20.根据权利要求19所述的组合物，其进一步包含: 第四已知量的第四校准物，其中所述第一已知量、所述第二已知量、所述第三已知量，以及所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。
21.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含: 限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。
22.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包括: 限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物、所述第二已知量的第二校准 物、所述第三已知量的第三校准物，以及所述第四已知量的第四校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。
23.一种用于通过质谱法定量目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括: 第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 对以下的说明:(i)获得质谱信号，所述质谱信号包括来自单个样品的第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号，所述单个样品包含所述第一已知量的第一校准物、包含所述第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，以及(ii)使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物、类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，其进一步包括: 第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 对以下的说明:(i)由质谱仪获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含所述第三已知量的所述第三校准物，包含所述第四已知量的所述第四校准物，并且可能包含所述其它目标分析物，以及(ii)使用所述第三校准物信号、所述第四校准物信号，以及所述其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述其它目标分析物。
26.根据权利要求23所述的试剂盒，其进一步包括: 限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。
27.根据权利要求25所述的试剂盒，其进一步包括: 限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物、所述第二已知量的第二校准物、所述第三已知量的第三校准物，以及所述第四已知量的第四校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。
28.一种计算机可读介质，其包含适于以下的计算机可执行指令: 获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物， 其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和 使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的目标分析物。
29.根据权利要求28所述的计算机可读介质，其进一步包含适于以下的计算机可执行指令: 引导自动代码阅读器以基于与所述给定样本有关的代码确定给定样本中待测定的一种或更多种分析物的列表；和 引导自动校准物系统以合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。
30.一种用于通过质谱法定量目标分析物的装置，所述装置包括: 样品处理器，其被配置成通过在可能包含目标分析物的单个样本中合并第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品； 质谱仪，其被配置成生成包括第一校准物信号、包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号的质谱信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分;和 数据处理器，其被配置成使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。
31.根据权利要求30所述的装置，其进一步包括: 分离系统，其被配置成在获得质谱信号之前从所述单个样品的其它组分分离所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物。
32.根据权利要求30所述的装置，其中所述分离系统包括固相提取、液相色谱、气相色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱，以及超临界流体色谱设备中的至少一种。
33.根据权利要求30所述的装置，其中所述样品处理器进一步包括: 自动代码阅读器，其被配置成基于与所述给定样本有关的代码确定在给定样本中的一种或更多种待测试分析物的列表；和 自动校准物系统，其被配置成合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。
34.根据权利要求33所述的装置，其中所述自动校准物系统被配置成递送所述给定样本至样品接受器，所述样品接受器包含所述一种或更多种分析物的每一种的所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物。
35.根据权利要求33所述的装置，其中所述自动校准物系统被配置成递送所述一种或更多种分析物的每一种的所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物至包含所述给定样本的样品接受器。`
【文档编号】G01N30/86GK103782166SQ201280036810
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2011年6月6日
【发明者】D.P.库珀 申请人:沃特世科技公司