筛选诱导的多能干细胞的方法
【专利摘要】本发明提供使用认定为特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系的lincRNA或mRNA的标志物筛选展现分化抗性的iPS细胞的方法，和这样的标志物。
【专利说明】筛选诱导的多能干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及筛选诱导的多能干细胞的方法。更特别地，本发明涉及在诱导的多能干细胞中通过确认大的基因间的非编码RNA (large intergenic non-coding RNA,lincRNA)或mRNA的表达筛选不展现分化抗性的诱导的多能干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，已相继建立了小鼠和人诱导的多能干细胞(iPS细胞)。Yamanaka等人通过将0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc基因导入小鼠来源的成纤维细胞以启用这些基因的强制表达诱导了 iPS 细胞(W02007/069666A1 和 Takahashi, K.和 Yamanaka, S.，Cell, 126:663-676(2006))。接着，已经表明iPS细胞也能用以上因子的3个来制备(除了 c-Myc基因)(Nakagawa, M.等人，Nat.Biotechnol.，26:101-106 (2008))。而且，Yamanaka 等人通过将以上4个基因导入人皮肤来源的成纤维细胞，成功建立了 iPS细胞，与涉及小鼠的情况相似(W02007/069666A1 和 Takahashi, K.等人，Cell, 131:861-872 (2007))。同时，Thomson 等人的小组使用Nanog和Lin28代替Klf4和c_Myc制备了人iPS细胞(W02008/118820A2和Yu, J.等人，Science, 318:1917-1920 (2007))。iPS细胞能解决生物伦理问题例如胚胎的破坏，能在维持其多能性的同时生长，使得iPS细胞被预期作为再生医学的移植材料。
[0003]同时，即使当这样建立的iPS细胞被诱导以分化为特异性的组织细胞时，产生的细胞可能包括具有增殖能力的未分化(或未充分分化的)细胞(Miura K.等人，NatBiotechnol.，27:743-745 (2009))。在这种情况下，有移植后肿瘤发生的顾虑。因此，在这样建立的iPS细胞系中筛选不含有对分化诱导展现抗性的细胞的iPS细胞系的方法是希望得到的。
[0004]发明概述
[0005]技术问题
[0006]本发明的目标是有效地选择适合临床应用的安全的iPS细胞(诱导的多能干细胞)。特别地，本发明的目标是提供筛选不展现分化抗性的细胞系的方法。
[0007]问题解决方案
[0008]为达到以上目标，本发明人使用展现分化抗性的iPS细胞系和不展现分化抗性的iPS细胞系研究了特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系的RNA或特异性表达于不展现分化抗性的iPS细胞系的RNA。因此确认，由特定基因组区编码的大的基因间的非编码RNA(IincRNA)或mRNA特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系或不展现分化抗性的iPS细胞系中。
[0009]基于以上结果，本发明人已经发现，通过使用由特定基因组区编码的大的基因间的非编码RNA (IincRNA)或mRNA作为指示物(标志物)可筛选展现分化抗性的iPS细胞，因此完成了本发明。
[0010]特别地，本发明包括下列[I]到[9]。
[0011][I] 一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，包含如下步骤:[0012](i)测定选自A组和/或B组的至少一个大的基因间的非编码RNA (IincRNA)或mRNA的表达，
[0013](ii)选择其中选自A组的I incRNA或mRNA表达或其中选自B组的I incRNA或mRNA不表达的人诱导的多能干细胞系；
[0014]A组由以下组成:
[0015](Al) lincRNA: chrl: 852245-854050 反向链，
[0016](A2)GPR177,
[0017](A3) VTCNl,
[0018](A4) lincRNA: chrl:142803013-142804254 反向链，
[0019](A5)AP0A2,
[0020](A6)WNT6,
[0021](A7) EPASl，
[0022](A8)C0L3A1,
[0023](A9)SLC40A1,
[0024](AlO) S1`00P,
[0025](All)HOPX,
[0026](A 12)⑶ CYI A3，
[0027](A13)CDH10，
[0028](A 14) HAPLNl,
[0029](A 15) PITXl，
[0030](A 16) HANDl,
[0031](A 17) CGA,
[0032](A 18) AQPl，
[0033](A19)DLX6,
[0034](A20)DLX5,
[0035](A21) SOXl7，
[0036](A22)FLJ45983,
[0037](A23) PLCEl,
[0038](A24)H19,
[0039](A25) lincRNA: chrll:2016408-2017024 反向链，
[0040](A26) lincRNA: chrl 1:2017517-2017651 正向链，
[0041](A27)IGF2,
[0042](A28)P2RY6,
[0043](A29) SLN,
[0044](A30)NNMT,
[0045](A31) APOA I,
[0046](A32)ERP27,
[0047](A33) LUM，
[0048](A34)CCDC92，
【权利要求】
1.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，所述方法包含如下步骤: (i)测定选自A组和/或B组的至少一个大的基因间的非编码RNA(IincRNA)或mRNA的表达， (ii)选择其中选自A组的所述IincRNA或mRNA表达或其中选自B组的所述IincRNA或mRNA不表达的人诱导的多能干细胞系； A组由以下组成
(Al) lincRNA: chrl: 852245-854050 反向链，
(A2)GPR177,
(A3)VTCNl,
(A4) lincRNA:chrl: 142803013-142804254 反向链，
(A5)APOA2,
(A6)WNT6,
(A7)EPASl，
(A8)C0L3A1,
(A9)SLC40A1,
(AlO)S100P,
(All)HOPX,
(A 12)⑶ CYI A3，
(A13)CDH10,
(A14)HAPLNl,
(A15)PITX1,
(A16)HANDl,
(A17)CGA,
(A18)AQP1,
(A19)DLX6,
(A20)DLX5,
(A21)S0X17,
(A22)FLJ45983,
(A23)PLCEl,
(A24)H19,
(A25) lincRNA: chrll:2016408-2017024 反向链，
(A26)lincRNA:chrll:2017517-2017651 正向链，
(A27)IGF2,
(A28)P2RY6,
(A29)SLN,
(A30)NNMT,
(A3I)APOA I,
(A32)ERP27,
2.根据权利要求1所述的方法，其中选自A组的所述IincRNA或mRNA选自由以下组成的组中:
(A20)DLX5,
(A50)MEIS2,
(A53) lincRNA: chrl7:21434064-21435857 反向链，以及
(A58)GREBILo
3.根据权利要求1所述的方法，其中选自B组的所述IincRNA或mRNA选自由以下组成的组中:
(B4)C4orf51,
(B9)C7orf57,
(BlO) lincRNA: chr7:124873114-124899839 反向链，
(B12)0C90,(B13) lincRNA: chr8:133071643-133092468 反向链，
(BI4) lincRNA: chr8:133073732-133075753 反向链，
(BI5)HHLAl，
(B16) lincRNA: chr8:133076031-133093351 反向链，
(B17) I incRNA:chr8:133090096-133097869 反向链，
(B22)ABHD12B,
(B23) lincRNA: chr 18:54721302-54731677 反向链，
(B27)ZNF541,
(B28)TBX1, (B29)CXorf61,以及
(B30)DB090170TESTI4 人类 cDNA 克隆 TESTI40389975’，mRNA 序列[DB090170]。
4.根据权利要求1所述的方法，其中选自B组的所述IincRNA或mRNA选自由以下组成的组中；
(B4)C4orf51,
(B15) HHLAl,以及
(B22)ABHD12B。
5.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，所述方法包含如下步骤:
(i)测定位于选自由(B4)C4orf51、(B15)HHLAl和(B22)ABHD12B组成的组中至少一个基因中的LTR区或其附近的DNA-甲基化状态，以及 (ii)选择其中所述LTR7区域处于DNA-甲基化状态的人诱导的多能干细胞系。
6.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，所述试剂含有具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或IincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的试剂，所述试剂是通过固定与具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或IincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸互补的多核苷酸作为探针制备的微阵列。
8.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，所述试剂含有识别由显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA编码的蛋白的抗体。
9.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂盒，所述试剂盒含有根据权利要求6到8的任一项所述的试剂。
【文档编号】G01N33/50GK103703130SQ201280036781
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月25日 优先权日:2011年7月25日
【发明者】山中伸弥, 高桥和利, 小柳三千代, 大贯茉里 申请人:国立大学法人京都大学