脑瘤靶向肽和方法

脑瘤靶向肽和方法
【专利摘要】本发明公开了在受试者中诊断和治疗人多形性成胶质细胞瘤(GBM)脑瘤的方法。所述方法包括给予所述受试者有效量的包含肽的组合物，所述肽长度为12-20个氨基酸残基并针对其优先结合到经鉴定为脑瘤起始细胞(BTIC)或高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)的人GBM细胞亚型的能力而进行选择。
【专利说明】脑瘤靶向肽和方法
[0001]相关申请的交叉引用
本申请是2011年6月2日提交的美国申请号13/152，214的继续部分申请，后者是2010年11月19日提交的美国申请号12/950,855的继续部分申请，其要求2009年11月24日提交的美国临时申请号61/264，064的权益，所有这些都通过引用全部结合到本文中。
发明领域
[0002]本发明涉及肽领域，所述肽能够靶向恶性胶质瘤细胞、尤其是人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型和人GBM细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型；并且涉及使用所述肽的方法。
[0003]参考文献:
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多形性成胶质细胞瘤(GBM)是一种复杂和多样化的疾病，在经手术、放疗和替莫唑胺治疗时具有普遍的短期复发，中值生存期大约I年[1-3]。按照转录簇(transcriptionalcluster)分为原神经(proneural)亚型(较好的患者生存概况)、不确定亚型(“神经(neural)”)亚型、间质(与NF-1损失相关)亚型和增殖型(“传统型”;与EGFR突变或扩增有关)亚型(综述见[I])，这样的分类强调了个性化的患者概况在确定预后以及靶向治疗药的合理选择方面的有用性，然而需要开发临床上靶向这些亚型的实用方法。
[0004]尽管有强化放疗和化疗，但是肿瘤再生长事实上是不可避免的，通常在切除边缘几厘米内发生[4]。有两种潜在的疾病库(disease reservoir)可导致治疗失败。第一,近来的临床和体外研究已经表征了侵袭性胶质瘤，表明遗传上和表型上不同的细胞可形成从主肿瘤块向外延伸若干厘米的长卷须，或者形成弥散性扩散的、侵袭性肿瘤亚群，因为它们远离主肿瘤部位的位置[4-6]，以及抗药性基因的表达和增强的DNA修复能力[7-10]而抵抗化疗和放疗。这些细胞在本文中被称为高度侵袭性胶质瘤细胞或HIGC。
[0005]第二推定的库是基于癌症干细胞(CSC)的概念，其出现是因为没有终末分化的自我更新机制类似于干细胞和癌细胞之间[11]。癌症干细胞假说提出稀有的经转化干细胞群体、或具有获得性自我更新特性的祖细胞是肿瘤细胞更新的来源。在多种血液恶性肿瘤[12-14]和新近的多种实体瘤[14-18]中都提出了癌症干细胞存在的证据。
[0006]目前不断积累的体外和体内数据支持CSC参与成胶质细胞瘤[19-25]。脑瘤干细胞(或如它们在本文中被称为的脑肿瘤-起始细胞或BTIC)的概念可能是重要的，因为它们将限定肿瘤的行为，包括增殖、进程和对治疗的反应。BTIC的一个最重要特性就是它们非常类似人类疾病并因此可作为理解脑瘤生物学和开发治疗药的最佳系统[23]。另外，BTIC具有较少的细胞遗传的和分子的异常[21，23]，这应当使得鉴定脑瘤形成中的有原因的事件(即并非作为转化的结果而发生的变化)更容易。应当清楚表明，BTIC的存在和准确的操作性定义和术语的使用是争论很大的问题。因为CD133作为“干性(sternness) ”的指示物是争议性的[26-28]，所以本文中提出BTIC被定义为患者-来源的细胞，其具有自我更新、分化为多个谱系和在体内形成肿瘤的能力[28]。
[0007]发明概述
本发明一方面包括肽组合物，所述组合物用于靶向以下之一:(i)人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型，其特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，和(ii)人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型，其特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的(immunocompromised m ice)脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性。所述组合物包含分离的肽，所述肽具有12-20个氨基酸并含有用于靶向HIGC的选自SEQ ID NO:
1-10、13和17的序列，和用于靶向BTIC的选自SEQ ID NO: 11-16的序列。
[0008]所述组合物可包含多种GMB-结合肽，例如,优先结合到HIGC的至少一种肽和优先结合到BTIC的至少一种肽。
[0009]所述组合物的肽可以由L-氨基酸、D-氨基酸、L-和D-氨基酸的混合物组成、或者是以逆序排列的D-氨基酸形成的逆-倒位肽。
[0010]为了用于在人GBM肿瘤受试者中定位HIGC或BTIC，所述组合物可包含偶联到所述肽的造影剂。
[0011]为了用于在人GBM肿瘤受试者中抑制或杀伤HIGC或BTIC，所述组合物可以进一步包含偶联到所述肽的抗肿瘤药。
[0012]为了用于靶向HIGC，所述肽可含有选自SEQ ID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17 (修饰的H10)和优选地SEQ ID NO: 17 (修饰的H10)的序列。
[0013]为了用于靶向BTIC，所述肽可含有选自SEQ ID NO: 11 (7A)、14 (3F)、16 (3B)和13 (ElO)和优选地 SEQ ID NO: 11 (7A)的序列。
[0014]为了用于跨越血脑屏障递送到人GBM肿瘤患者，分离的肽可以偶联到具有由SEQID NO: 18或19所确定的序列的载体肽，和在另一个实施方案中，分离的肽可以包封在由聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、环糊精或鲸蜡醇/聚山梨酯所形成的纳米粒内。
[0015]还公开了以上肽组合物在检测人GBM肿瘤患者中HIGC或BTIC细胞亚型的存在情况的用途，其中所述组合物包含偶联到所述肽的可检测的造影剂。用于检测HIGC细胞亚型的存在情况的示例性组合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 7或17，和可额外地包括由SEQID NO: 18或19确定的肽。用于检测BTIC细胞亚型的存在情况的示例性组合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 11，和可额外地包括由SEQ ID NO: 18或19确定的肽。
[0016]进一步公开了以上肽组合物用于在人多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤患者中抑制或杀伤HIGC或BTIC细胞亚型的用途，其中所述组合物包含偶联到所述肽的抗肿瘤药。用于抑制或杀伤HIGC细胞亚型的一个示例性组合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 7或17。用于抑制或杀伤BTIC细胞亚型的示例性组合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 11。
[0017]另一方面，本发明包括在患者中表征多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤的方法，通过以下步骤:
(a)在给予患者肽组合物之后，产生所述患者的脑瘤的图像，所述肽组合物含有(i)第一肽和偶联到第一肽的第一造影剂，所述第一肽长度为12-20个氨基酸并针对其优先结合到人GBM细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型而进行选择，所述人GBM细胞的特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，所述第一造影剂允许第一肽当结合到所述患者肿瘤区的细胞时在体内成像；
(b)在给予患者肽组合物之后，产生所述患者的脑瘤的图像，所述组合物含有(i)第二肽和偶联到第二肽的第二造影剂，所述第二肽长度为12-20个氨基酸并针对其优先结合到人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型而进行选择，所述人GBM细胞的特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性，所述第二造影剂允许第二肽当结合到所述患者肿瘤区的细胞时在体内成像；和
(c)根据在步骤(a)和(b)中产生的图像中观察到的第一和第二肽以及它们所缔合的造影剂的分布，确定以下至少一个:
(ci)肿瘤的边界，用于手术切除所述肿瘤的目的，
(Cii)肿瘤的边界，用于所述肿瘤放疗的目的，
(Ciii)肿瘤内不同肿瘤-细胞表型的表达谱，用于定制治疗所述肿瘤的化疗方案的目的；和
(Civ)在给定时间进程内，第一和第二肽以及它们所缔合的造影剂的分布变化，其中步骤(a)和(b)随时间而重复。
[0018]步骤(a)和(b)可以通过以下之一来进行:(i)MRI，其中所述造影剂选自基于钆的造影剂、氧化铁造影剂和锰造影剂；
(?)正电子发射断层扫描(PET)或闪烁扫描术，其中所述造影剂选自64Cu 二乙酰基-双(N4-甲硫基缩氨基服)、18F_氟脱氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脱氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F-氟米索硝唑、镓、锝-99m和铊；和
(iii)X-射线成像，其中所述造影剂选自钡、泛影钠-泛影葡胺合剂(gastrografin)和碘造影剂。
[0019]所述肽组合物可以经静脉内给予。在一个实施方案中，步骤(a)和(b) —起进行并且第一和第二造影剂允许独立地测定结合的第一和第二肽的分布。在另一个实施方案中，(a)和(b)序贯进行。
[0020]所给予的第一肽可含有选自SEQ ID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17 (修饰的H10)的序列。所给予的第二肽可含有选自SEQ ID NO: 11 (7A)、13 (ElO) ,14 (3F)和16 (3B)的序列。
[0021]再一方面，本发明包括在人多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤患者中表征细胞表型的基因表达谱的方法，通过以下步骤:
(a)在所述肿瘤中鉴定对应于以下之一的细胞:(i)分化的GBM肿瘤细胞，(ii)人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型，其特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，和(iii)人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型，其特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性，和 (b)将所鉴定的细胞类型与该细胞类型的已知基因表达模式关联。
[0022]当阅读了以下的发明详述以及附图之后，本发明的这些和其它目标和特征将会更加完全地显而易见。
[0023]附图简述
图1A是选择噬菌体的示意性范例，所述噬菌体优先结合到高度侵袭性胶质瘤细胞群体，该群体是由被称为U87R的体内连续传代而发展。在两步法中使用一系列生物淘选步骤进行肽选择，其中PhD-12 M13组合噬菌体展示文库首先扣除结合到非靶细胞(非侵袭性U87T细胞)的噬菌体，以去除各细胞类型中常见的任何噬菌体。然后，对于优先结合到靶细胞U87R的噬菌体进行阳性选择。丢弃任何未结合的噬菌体，将其余噬菌体在一系列步骤中扩增，所述步骤富集靶特异性噬菌体，称为12R文库。
[0024]图1B显示检测结合到细胞表面的噬菌体的全细胞ELISA测定。将12R噬菌体文库与侵袭性U87R或非侵袭性U87T细胞一起孵育，去除任何未结合的噬菌体并使用HRP-抗M13抗体和TMB底物(蓝色)来检测结合的噬菌体。12R文库优先结合到高度侵袭性U87R细胞。
[0025]图2A显示12R文库亚克隆HlO选择性地抑制胶质瘤侵袭的抑制能力。将系列稀释的噬菌体与宿主细菌在琼脂糖板上铺板，以分离噬菌体亚克隆。分离各个克隆，扩增并在体夕/侵袭测定中测试它们的抑制能力。称为HlO的噬菌体特异性地和显著地阻断侵袭性U87R细胞通过脑-样基质包被的transwell膜的迁移(3 x 101° pfu ;4小时，在37°C)。评价LPS或随机噬菌体的作用，控制宿主细菌培养导致的潜在污染；
图2B显示除了 HlO噬菌体之外，HlO合成肽(50uM)有效地和选择性地抑制高度侵袭性U87R细胞、以及用p75N? (显示出介导胶质瘤侵袭的一种蛋白质)转染的U87MG细胞的迁移；
图2C证明了 HlO肽的临床相关性，因为HlO肽抑制了来自成胶质细胞瘤患者的7种脑瘤起始细胞(BTIC)分离物中的5种的迁移。星号表明与未经处理的对照的统计显著性差异；Dunnett 氏检验(p ^ 0.05)；
图3A是柱状图，显示胆固醇氧化酶抑制细胞迁移。将侵袭性U87R细胞铺板到基质包被的transwell膜上并用胆固醇氧化酶(1.8 U/mL)处理4小时。迁移到transwell膜底面的细胞用结晶紫染色并通过光学显微术计数；
图3B显示胆固醇氧化酶阻止脂筏标记物GMl的内在化。将U87R细胞铺板到基质包被的transwell膜上并用胆固醇氧化酶和Alexa 555-霍乱毒素B亚基处理120分钟，以评价其受体GMl的摄取和/或周转(turn over)的差异。白色箭头表示GMl的膜积累；
图4A显示在HlO存在时的GMl的积累。将侵袭性U87R细胞铺板到基质包被的transwell膜上并在Alexa 555-霍乱毒素B亚基存在下与HlO噬菌体一起孵育30分钟，以评价脂筏标记物GMl的摄取和/或周转的差异。用HlO处理的细胞显示出GMl染色的广泛积累，其特征在于球状的内部结构和膜定位(白色箭头)；
图4B是蛋白质印迹，显示用HlO或胆固醇氧化酶处理侵袭性胶质瘤细胞导致p75N?(一种在脂筏中发现的已知促进细胞迁移的膜蛋白)的更高分子量复合物的积累。从U87R细胞制备密度梯度级分，所述细胞被铺板到胶原上并用PBS (对照)、HlO噬菌体、F2噬菌体、或胆固醇氧化酶处理2小时，然后通过蛋白质印迹分析p75N?。白色箭头指示含有更高分子量p75NTK的复合物。图下的线指示常见细胞器通常被发现的级分；
图4C显示用HlO处理胶质瘤细胞导致p75NTK在质膜上积累。将BTIC 25细胞(无GFP)铺板在基质包被的transwel`l膜并用噬菌体处理2小时。在HlO处理之后，p75N?受体(其在p75N?信号转导期间通常被裂解)在细胞膜上极大增加。p75NTK看来不在HlO-影响的GMl区室中积累，表明HlO可能对不止一类膜结构起作用；
图5显示来自用生物素化7A肽染色的BTIC分离物的共聚焦显微照片的单个Z-堆积投影。使用生物素化7A肽(红色)，然后通过共聚焦成像，用非靶(U87MG;NSC)和靶(BTIC)细胞评价7A肽的结合特异性。
[0026]图6A显示HlO在体内的归巢能力。侵袭性U87R或非侵袭性U87T细胞在SCID小鼠右脑半球生长。一旦建立了肿瘤，将小鼠麻醉并灌注HlO噬菌体10分钟。用PBS将未结合的噬菌体从系统中冲洗掉。将脑冷冻切片并对M13噬菌体或人核抗原(hNA)进行免疫组织化学染色。与用U87T细胞建立的肿瘤相比，HlO噬菌体更有效地归巢到U87R肿瘤细胞，这通过在U87R细胞体上和沿着异种移植块边缘的染色增加而证明。
[0027]图6B显示7A在体内归巢到BTIC12和BTIC25异种移植物。将细胞注射到SCID小鼠的右脑半球并让其建立3个月。然后给小鼠灌注7A或Al (随机对照)噬菌体达10分钟。噬菌体结合的分布在两个BTIC异种移植物间是独特的并且再次揭示样品内的异质性。在携带产生自U251N细胞系的肿瘤的小鼠中未观察到7A归巢。用随机选择的噬菌体Al灌注BTIC 25异种移植物，显示出最低限度的染色；
图7A-7D证明7A肽可区分具有确定细胞行为的BTIC分离物内的亚群。在图7A中，通过有限稀释而将BTIC25亚克隆并针对与生物素化7A肽的结合而筛选。结合到7A的亚群在培养中具有更高的形成神经球的倾向性，作为SCID小鼠中的异种移植物并不是高度增殖的，并且被发现优先靠近脑室。将人异种移植物植入小鼠的右脑半球并通过抗人核抗原的抗体来显现(棕色)。切片用甲苯胺蓝复染色，以显现所有细胞核。图7B显示小鼠脑薄切片中BTIC25亚克隆的生长模式，显示出结合7A肽的高倾向性。图7C显示非7A肽结合BTIC25亚克隆的生长模式。通过用DAB对人核仁蛋白的免疫组织化学染色，在小鼠脑中检测人肿瘤细胞。使组织结构成像的复染剂是甲苯胺蓝。图7D中的图概述了在7A结合变体的22个单独植入、和7A未结合变体的21个单独植入的小鼠脑中的所观察到的生长模式。总之，数据证实通过其结合到7A的能力所确定的2个亚群，在再引入脑环境时，在生长模式和行为方面是不同的。
[0028]图8是表，显示了 BTIC-选择性肽对BTIC分离物的代表性选择的结合特异性；
图9A是p75N?转染的胶质瘤细胞(U87p75)的共聚焦图像，其针对FITC-转铁蛋白的
摄取而成像。当细胞铺板到胶原包被的transwell膜之后2小时,评价了在HlO和胆固醇氧化酶存在下生长的U87p75NTK的FITC-转铁蛋白摄取。HlO和胆固醇氧化酶对转铁蛋白或转铁蛋白受体(网格蛋白-包被小泡的标记物)的分布没有影响；
图9B显示使用碘克沙醇梯度分离对侵袭性U87R细胞的细胞分级分离。U87R细胞用H10、F2、胆固醇氧化酶或对照PBS处理2小时。将细胞裂解，用碘克沙醇梯度分级分离，并对转铁蛋白受体进行蛋白质印迹分析；
图1OA显示抗p75NTK蛋白质印迹和全长p75NTK，在用HKKMbOT或ΗΙΟ+Mb⑶处理之后显现C-端片段(α -分泌酶)和胞内域(Y -分泌酶)裂解产物； 图1OB显示在暴露于HlO达4小时和I周之后的全长ρ75.的蛋白质印迹分析；
图1OC显示在胆固醇氧化酶和甲基-β -环糊精(methyl-β-cyclodextran)存在时进行的体外侵袭测定。胆固醇氧化酶和甲基-β -环糊精都明显抑制U87p75胶质瘤细胞的细胞迁移；
图11显示一组患者-来源的BTIC分离物(行)的共聚焦图像，所述分离物已针对其与多种生物素化合成肽(列)的结合特异性而筛选。经噬菌体展示而分离的候选肽被制备成带生物素标签的合成肽。在体外与靶细胞孵育之后，过量的肽用冷PBS洗去并用Alexa568(荧光红)链霉抗生物素缀合物(紧密结合到生物素)检测仍然结合到细胞表面的那些肽。用荧光显微镜捕获图像。
[0029]图12A和12B显示在不同的胞外基质存在下的体夕/ transwell迁移测定。脑基质的存在对于HlO-介导的在体外的U87R细胞迁移的终止是必不可少的(图12A)，其中胶原I介导大部分作用(图12B)。
[0030]图12C图示了在HlO肽存在下，有和无外源胶原时，7A+BTIC细胞(#2、#4和#5)和BTIC 7A-细胞(#3、#6和#7)的迁移。可见，在胶原不存在时，HlO有效抑制BTIC 7A+细胞的迁移，但对于7A-BTIC细胞，HlO需要外源胶原以抑制迁移，类似于图12B中所示的U87R细胞所观察到的模式；
图13A和13B是来自5个小鼠脑的薄切片的高放大倍数图像，所述小鼠脑是在接近肿瘤-植入部位二等分切开的(13A)，并用生物素化7A肽染色，以及来自注射非7A结合亚克隆的5个小鼠脑的薄切片(13B)；
图14A显示荧光标记的7A肽在活小鼠内归巢到从BT025细胞生长的大的植入肿瘤的能力(14A)。图14B和14C是在接近肿瘤植入部位二等分切开并对人核抗原(绿色)和总DNA染色(蓝色)染色以示出细胞位置之后，取自图14A中的脑的薄切片的分别较低和较高放大倍数。在紧挨着主肿瘤块以及弥散性扩散在周围组织中的细胞上可见红色肽信号。
[0031]图15A显示当小鼠经由颈动脉注射荧光标记的3B肽之后，携带BT025-植入的肿瘤的完整小鼠脑；图15B是15A中的脑的荧光染色的薄切片，显示红色肽信号同时出现在主肿瘤块的内外；
图16A显示在肿瘤注射部位二等分切开的完整小鼠脑并且切面朝上；图16B和16C分别是接受颈动脉内注射3F肽的动物的脑切片的较低和较高放大倍数显微图，显示3F主要结合到主肿瘤块外的弥散性扩散的细胞；
图17A和17B显示，当通过尾静脉注射、而非颈动脉内注射给予肽时，可观察到图16B和16C所示的类似结果；
图18A显示完整小鼠脑和肿瘤注射位置；图18B和18C是接受颈动脉内注射HlO肽的动物的脑切片的显微照片，显示HlO主要结合到主肿瘤块外的弥散性扩散的细胞；图18D显示当通过尾静脉给予肽时的类似结果；
图19A显示完整小鼠脑和肿瘤注射部位；图19B和19C是接受颈动脉内注射ElO肽的动物的脑切片的显微照片，显示ElO结合到肿瘤块内的部分细胞(19B)，和结合到主肿瘤块外的细胞(19C);当ElO肽经由尾静脉注射时观察到类似结果(图19D)； 图20显示分离自3个独立分离的7A结合细胞亚克隆和3个独立分离的7A非结合亚克隆(在图12C中鉴定的亚克隆)的mRNA所产生的微阵列数据的基因簇(geneclustering)；
图21A-21C是MRI图像，显示BTIC25肿瘤植入小鼠脑，其已注射了 ElO肽修饰的铁纳米粒，其中在研究的24时间进程中观察到肿瘤图像的渐进性增大；
图22A-22B是MRI图像，显示在注射了带FLAG (DYKDDDDK)-标签的ElO肽修饰的铁纳米粒之后,更大的BTIC25植入肿瘤和MRI成像，其中在研究的I小时时间进程中观察到肿瘤图像的渐进性增大；
图23是已经MRI成像并对FLAG-ElO肽的存在进行染色之后的BTIC25植入小鼠的脑的薄切片，其中深染色肯定地表明主肿瘤块中存在着FLAG-标签(即FLAG-ElO肽修饰的铁纳米粒)。
[0032]图24A-24D是来自研究的图像，在该研究中给小鼠植入BTIC134s并注射绿色、红色和远红荧光标记的肽的混合物(cocktail):E10 (绿色，见图24A和24B)、HlO +IOC(红色，见图24C)、和7A + 3F (远红，见图24D)。图24E是对人核仁蛋白染色的免疫组织化学图像(经DAB成像，深染色)，其证实了小鼠脑内人体细胞的存在和位置。
[0033]发明详述.1.定义
“人多形性成胶质细胞瘤(GBM) ”是指在人类中最常见的具攻击性的原发性脑瘤类型。GBM肿瘤的特征在于存在小范围的坏死组织，其周围是退行性细胞(假栅栏坏死)。该特征、以及增生性血管的存在，将所述肿瘤与没有这些特征的3级星形细胞瘤区别开来。
[0034]“高度侵袭性胶质瘤细胞”或“HIGC”是人GBM细胞亚型(亚群)，其特征在于从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力。HIGC的一个实例是U87MG人成胶质细胞瘤细胞的U87R亚型。
[0035]“脑瘤起始细胞”或“BTIC”是人GBM细胞亚型(亚群)，其特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性。
[0036]“肽-展示噬菌体”是指这样的噬菌体:其已经工程化而在其表面上表达外源肽文库、通常是组合文库，允许根据噬菌体表面上存在的外源文库肽而进行噬菌体选择。
[0037]“HIGC-特异性肽”是指通常与肽-展示噬菌体结合的肽，其在下文VIIIC部分中所述的噬菌体-展示淘选条件下优先结合到HIGC。
[0038]“BTIC-特异性肽”是通常与肽-展示噬菌体结合的肽，其在下文VIIID部分中所述的噬菌体-展示淘选条件下优先结合到BTIC。
[0039]如果噬菌体在下文VIIIC和VIIID部分中所述的噬菌体-淘选洗涤条件下仍然分别结合到固定化HIGC或BTIC靶细胞，肽-展示噬菌体“优先结合到HIGC或BTIC”。
[0040]氨基酸残基在本文中按照它们的标准单字母代码而显示(参见例如，www.mun.ca/biochem/courses/3107/aasymbols.html)。
[0041]“造影剂”是指与成像技术联用的成像剂，所述成像技术例如磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描术、计算机断层扫描(CT)和X-射线成像，以增加从图像可得到的信息，尤其是当它涉及到成像剂与靶解剖结构或细胞结合时。示例性的造影剂包括⑴基于钆的造影 剂、氧化铁造影剂和锰造影剂，用于MRI ;64Cu 二乙酰基-双(N4-甲硫基缩氨基服)、18F_氟脱氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脱氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F_氟米索硝唑、镓、锝-99m和铊，用于PET或闪烁扫描术；以及钡、泛影钠-泛影葡胺合剂和碘造影剂，用于X-射线成像。
[0042]如果一种作用剂以允许该作用剂被肽携带的方式(例如在血流中作为稳定的双组分组合物)直接或间接连接到所述肽，则该作用剂“偶联”到肽。该作用剂可共价偶联到肽，或在某结构(例如螯合物、穴状配体(cavitand)、纳米粒或脂质颗粒)中被携带,所述结构本身共价偶联到肽，或者可以被肽携带在稳定结构(例如纳米粒或脂质结构)中。
[0043]I1.U87R-细胞特异性肽
依照本发明，最近已对侵袭性胶质瘤和BTIC区室(compartment)建模，允许详细检查潜在的可靶向组分。开发了本文所述的侵袭性胶质瘤模型，通过在体内经小鼠脑连续传代GFP neo-转染的U87MG人成胶质细胞瘤细胞，以便从注射部位对侧的脑半球分离侵袭性亚群(U87R，远离原发性肿瘤)[5，6]。当在体外培养并与它们的非侵袭性对应物(U87T，肿瘤形成的)相比较时，这些细胞在体外和在重新注入小鼠脑后都保持了更高的侵袭倾向性。微阵列分析显示与U8"7T细胞相比,在U87R细胞中许多基因或者被下调或者被上调,包括增加的P75NTK表达。使用功能性的、生化的和临床的研究的组合，已经发现p75NTK在高度侵袭性成胶质细胞瘤患者标本中极大地增强了遗传上独特的胶质瘤细胞的迁移和侵袭并且频繁地表现出稳健的表达[6]。这些观察结果表明U87R亚群是后续肽筛选的合适的模型细胞系。U87R亚型是高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)的实例。
[0044]BTIC模型由源自新鲜切除的人脑瘤标本的一系列原代细胞培养物组成。针对一组常规抗体检测原始肿瘤，以证实GBM的诊断，然后通过亚群在培养中形成自我更新的神经球、以及分化成星形细胞谱系、少突胶质细胞谱系或神经元谱系的能力，来选择亚群。注射少至10个细胞到小鼠脑之后,这些脑瘤起始细胞(BTIC)趋向于重演(recapitulate)原发性肿瘤以及稳健地侵袭，类似于用临床GBM标本所观察到的那样[28]。尽管不清楚BTIC是否是脑癌症干细胞的最佳代表，但是它们仍然是描述人类疾病行为的优良模型。
[0045]依照本发明，已经鉴定了可用于靶向、表征和操纵来自疾病库(其涉及到治疗后GBM复发)的细胞的肽。通过在其它研究中已证明成功的噬菌体展示技术来完成肽选择。例如，生物淘选针对靶细胞或纯化的分子的噬菌体展示文库已经导致对确定的细胞亚群(例如血管地址系统[30，31])具有独特性的细胞表面蛋白质的表征，对特定蛋白功能具有重要性的基序(例如整联蛋白结合(engagement)所需的RGD基序[32-34])的鉴定，以及具有功能性效用的肽试剂的分离[35-38]。在实践中，仅可在离体时进行可用于诊断或治疗患者成胶质细胞瘤的独特的噬菌体展示的肽序列的选择，使得必需开发我们独特的、临床相关的模型系统，所述系统重演了导致治疗困难的GBM的具体特征，允许单独研究成为原因的细胞类型。
[0046]本文所述的所选肽的最终成员(final panels)已显示可用于证明细胞群体间和给定的细胞群体内的分子异质性，并且可使得进一步精修成胶质细胞瘤亚型的表征，这可允许将肿瘤表型与患者后果或与特定治疗方案相匹配，这是癌症治疗中个性化医学的必要组分。或者，因为所显示的体内效用，这些肽可用作临床成像工具，或将化疗靶向特定肿瘤亚型的试剂。未修饰的肽也存在固有的治疗潜力，因为它们中的一种显著地抑制U87R细胞以及表现出侵袭性特性的患者分离物的迁移和侵袭性的能力。
[0047]A.噬菌体展示文库的选择性生物淘选导致抑制胶质瘤细胞迁移的U87R-特异性肽序列的分离
本发明人早前已经描述了高度侵袭性的人胶质瘤细胞群体(U87R)的体内选择[6]。为了分离可特异性结合到这些高度侵袭性胶质瘤细胞的肽，采用应用组合噬菌体展示文库的生物淘选实验。最初用非侵袭性的U87细胞(U87T)进行扣除性生物淘选(subtractivebiopanning),接着用U87R细`胞进行选择性生物淘选，以分离卩遼菌体文库(图1A),通过全细胞ELISA证实其优先与U87R细胞相互作用(图1B)。通过将系列稀释的噬菌体与宿主细菌铺板在琼脂糖板上将这些噬菌体亚克隆，然后测定肽插入物的序列，并且列于表1，其从左到右显示:(i)所述肽标识符，(?)肽序列，(iii) SEQ ID NO，和(iv)含有该序列的细胞-结合卩遼菌体的数量(number cell-binding phages containing that sequence)。
[0048]为了选择噬菌体亚克隆用于进一步生化和体内评价，测试噬菌体功能性地影响U87R细胞行为的能力。发现HlO噬菌体-展示的序列(SEQ ID NO:7)使U87R细胞通过包被脑-样胞外基质的膜的迁移(图2A)终止。其它噬菌体肽，例如M32和M24，也显示出与HlO类似的抑制性趋势，尽管作用并没有那么强。还通过测试LPS和20X体积的随机选择的噬菌体的作用，排除了以下可能性:来自宿主培养物的细菌组分可导致该抑制。HlO肽的合成形式也能抑制U87R细胞的迁移，以及p75N?感染的U87MG细胞的迁移(图2B)，该p75N?经证明是在脑瘤异种移植物中足以赋予迁移表型的一种分子[6]。这些结果证实了在不存在噬菌体颗粒时的这种肽的抑制性特性。
[0049]表1:U87R_ 结合肽
A2 SVSVGMKPSPRP (SEQ ID NO:1)21/100
M32 GISLSSYLQSTQ (SEQ ID NO: 2)20/100C12 EHMALTYPFRPP (SEQ ID NO: 3)13/100
M5 HWAPSMYDYVSff (SEQ ID NO: 4)7/100
M43 RTVPDYTAHVRT (SEQ ID NO: 5)5/100
M19 SGHQLLLNKMPN (SEQ ID NO: 6)4/100
HlO TNSIffYTAPYMF (SEQ ID NO: 7)3/100
F2 GMSLSRQMLffSL (SEQ ID NO: 8)2/100
M24 HLFPQSNYGGHS (SEQ ID NO: 9)2/100
M23 CIQLANPPRLXG (SEQ ID NO: 10)2/100
在transwell测定中，通过使用从单个患者标本建立而来的BTIC细胞系,测试了 HlO肽的总体效用。这些由具有8.0um微孔的膜组成，可通过其测量细胞运动。因为BTIC系直接分离自切除的肿瘤，认为它们将给出真实的HlO的临床潜力的指示。所测的大约70%(5/7) BTIC系的迁移被显著地抑制，尽管所有7个都显示出某些抑制趋势(图2C)。在HlO没有显著作用的实验中，细胞一开始并不是高度侵袭性的。F2对照肽用作比较物以证明不是任何12聚体肽都会引起该抑制。星号指示与“无处理”对照的统计学差异，其Dunnett氏多范围比较检验的P值为0.05。这些数据证实了 HlO抑制人成胶质细胞瘤-来源的细胞迁移的能力。
[0050]B.HlO影响含GMl的结构和其它脂筏组分的周转
为了测定HlO肽抑制胶质瘤侵袭的分子机制，所述肽的生物素化形式用于将可能的结合配偶体拉下(pull down)，然后通过质谱对其进行分析。所测的许多蛋白质都具有某些作用或者与内体或囊泡转运相关(表2)。
[0051]因为脂筏参与某些胞吞过程[39-44]，检查了 U87R细胞对用胆固醇氧化酶(一种已知的脂後破坏剂)处理的反应[45，46]。在transwell测定中细胞迁移被终止(图3A),并且观察到GMl (非-胞膜窖脂筏和胞膜窖两者的一种组分)[47，48]在细胞内、尤其在质膜上积累(图3B)。在3个独立细胞系中，当细胞用HlO处理时观察到类似作用(与对照噬菌体比较)(图4A)。
[0052]表2:质谱目标命中(Hits of Interest)
【权利要求】
1.肽组合物，所述肽组合物用于靶向以下之一:(i)人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型，其特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，和(ii)人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型，其特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性；所述组合物包含: 分离的肽，所述肽具有12-20个氨基酸，并含有用于靶向HIGC的选自SEQ ID NO:1-10、13和17的序列，和用于靶向BTIC的选自SEQ ID NO: 11-16的序列。
2.权利要求1的肽组合物，其中所述肽由L-氨基酸、D-氨基酸、L-和D-氨基酸的混合物组成、或者是以逆序排列的D-氨基酸形成的逆-倒位肽。
3.用于在人GBM肿瘤受试者中定位HIGC或BTIC的权利要求1的肽组合物，所述组合物进一步包含连接到所述肽的造影剂。
4.用于在人GBM肿瘤受试者中抑制或杀伤HIGC或BTIC的权利要求1的肽组合物，所述组合物进一步包含连接到所述肽的抗肿瘤药。
5.用于靶向HIGC的权利要求1的肽组合物，其中所述肽含有选自SEQID NO: 7(HlO) ,13 (ElO)和17 (修饰的H10)的序列。
6.用于靶向HIGC的权利要求1的肽组合物，其中所述肽含有SEQID NO: 17 (修饰的H10)所确定的序列。
7.用于靶向BTIC的权利要求1的肽组合物，其中所述肽含有选自SEQID NO: 11(7A)、13 (ElO)、14 (3F)和 16 (3B)的序列。
8.权利要求7的肽组合物，其中所述肽具有SEQID NO: 11 (7A)所确定的序列。
9.用于穿过血脑屏障递送到人GBM`肿瘤患者的权利要求1的肽组合物，其中所述肽偶联到具有由SEQ ID NO: 18或19所确定的序列的载体肽。
10.权利要求1的肽组合物，其中所述肽包封在由聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、环糊精或鲸蜡醇/聚山梨酯所形成的纳米粒内。
11.权利要求1的肽组合物，所述组合物包含至少一种优先结合到HIGC的肽和至少一种优先结合到BTIC的肽。
12.权利要求1的组合物用于检测GBM肿瘤患者中HIGC或BTIC细胞亚型的存在情况的用途，其中所述组合物包含偶联到所述肽的可检测的造影剂。
13.权利要求1的肽组合物用于在GBM肿瘤患者中抑制或杀伤HIGC或BTIC细胞亚型的用途，其中所述组合物包含偶联到所述肽的抗肿瘤药。
14.在患者中表征多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤的方法，所述方法包括: (a)在给予所述患者肽组合物之后，产生所述患者的脑瘤的图像，所述肽组合物含有(i)第一肽和偶联到第一肽的第一造影剂，所述第一肽长度为12-20个氨基酸并针对其优先结合到人GBM细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型而进行选择，所述人GBM细胞的特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，所述第一造影剂允许第一肽当结合到所述患者肿瘤区的细胞时在体内成像； (b)在给予患者肽组合物之后，产生所述患者的脑瘤的图像，所述组合物含有(i)第二肽和偶联到第二肽的第二造影剂，所述第二肽长度为12-20个氨基酸并针对其优先结合到人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型而进行选择，所述人GBM细胞的特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性，所述第二造影剂允许第二肽当结合到所述患者肿瘤区的细胞时在体内成像；和 (C)根据在步骤(a)和(b)中产生的图像中观察到的第一和第二肽以及它们所缔合的造影剂的分布，确定以下至少一个: (ci)肿瘤的边界，用于手术切除所述肿瘤的目的， (Cii)肿瘤的边界，用于所述肿瘤放疗的目的， (Ciii)肿瘤内不同肿瘤-细胞表型的表达谱，用于定制治疗所述肿瘤的化疗方案的目的；和 (Civ)在给定时间进程内，第一和第二肽以及它们所缔合的造影剂的分布变化，其中步骤(a)和(b)随时间而重复。
15.权利要求14的方法，其中步骤(a)和(b)通过以下之一来进行: (i)MRI，其中所述造影剂选自基于钆的造影剂、氧化铁造影剂和锰造影剂； (ii)正电子发射断层扫描(PET)或闪烁扫描术，其中所述造影剂选自64Cu二乙酰基-双(N4-甲硫基缩氨基服)、18F_氟脱氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脱氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F-氟米索硝唑、镓、锝-99m和铊；和 (iii)X-射线成像，其中所述造影剂选自钡、泛影钠-泛影葡胺合剂和碘造影剂。
16.权利要求14`的方法，其中步骤(a)和(b)—起进行并且第一和第二造影剂允许独立地测定结合的第一和第二肽的分布。
17.权利要求14的方法，其中步骤(a)和(b)序贯进行。
18.权利要求14的方法，其中第一肽含有选自SEQID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17(修饰的H10)的序列。
19.权利要求14的方法，其中第二肽含有选自SEQID NO: 11 (7A)、13 (ElO) ,14 (3F)和16 (3B)的序列。
20.权利要求14的方法，其中所述肽组合物经静脉内给予。
21.在患者中表征人多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤的细胞表型的基因表达谱的方法，所述方法包括: (a)在所述肿瘤中鉴定对应于以下之一的细胞:(i)分化的GBM肿瘤细胞，(ii)人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的高度侵袭性胶质瘤细胞(HIGC)亚型，其特征在于它们从注入细胞的一个脑半球迁移到对侧半球的能力，和(iii)人GBM细胞的脑瘤起始细胞(BTIC)亚型，其特征在于它们能够自我更新、在不添加外源促分裂原和生长因子时产生球体、以及当放入免疫妥协小鼠的脑内时在体内诱导肿瘤形成的干细胞样特性，和 (b)将所鉴定的细胞类型与该细胞类型的已知基因表达模式关联。
【文档编号】G01N33/574GK103874511SQ201280036808
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年6月2日
【发明者】S.M.罗宾斯, J.拉恩, D.L.森格尔 申请人:阿奇癌症治疗公司