所有探针分子与它们的组成员是毗连的。根据一实施方式，28S rRNA探针集合的诸组中所 含的所有探针分子的至少75 %、至少80 %、更优选至少85 %、更优选至少90 %、最优选至少 95%与它们的组成员是毗连的。28S rRNA探针集合中所含的探针分子的长度优选为50nt 或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。28S rRNA 探针集合优选包含表1所示28S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两 组，至少四组，至少六组，更优选至少八组，至少十组，最优选所有组。根据一实施方式，除上 述28S探针集合外，试剂盒优选装有18S rRNA探针集合，其中，该18S rRNA探针集合中所 含的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组、最优选所有组的探针分子包含 两种或多种毗连的探针分子。在该实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子 是毗连的。此外，优选在18S rRNA探针集合的至少两组中，更优选至少三组中，包含的所有 探针分子与它们的组成员是毗连的。优选地，18S rRNA探针集合的诸组中包含的探针分子 的至少75 %、至少80 %、更优选至少85 %、更优选至少90 %、最优选至少95 %与它们的组成 员是毗连的。18S rRNA探针集合中所含的探针分子的长度优选为50nt或更小、优选35nt 或更小、更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。18S rRNA探针集合优选包含 表1所示18S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两组，更优选至少三 组，至少四组，最优选所有组。此外，该试剂盒可以包含上文结合方法描述的5. 8S rRNA组， 上文结合方法描述的5S rRNA组，上文结合方法描述的12S线粒体rRNA探针集合和/或上 文结合方法描述的16S线粒体rRNA探针集合。通过利用相应的试剂盒，可以获得消除了可 能干扰后续分析的最常见rRNA的靶RNA消除组合物。根据一实施方式，包含在试剂盒中的 探针分子是长度为35nt或更小，优选30nt或更小的单链DNA分子。优选地，包含在试剂盒 中的抗杂交体结合剂是RNA/DNA杂交体特异性的抗杂交体抗体。
[0128] 如实施例所示，联用杂交体捕获技术与本文所述的特异性探针设计能实现更完整 的靶RNA的更完整消除，相比于现有技术方法更好的保护以免降解，以及相比于现有技术 方法更好的保护以免非特异性消除。如上所述，本发明方法的特异性更高，因为特异性是在 两个水平上获得，即，组设置中所含短探针的特异性和抗杂交体结合剂的捕获，因为抗杂交 体结合剂只将具有显著匹配序列的那些探针识别为底物。因此，采用本发明方法不会捕获 大多数的非特异性结合事件。本发明技术可自动化进行，因此，非常适合于高通量应用。关 键优点是高效率除去最高99. 5%以上，甚至99. 9 %的不希望的靶RNA，例如所有类型的核 糖体RNA，其它RNA类型的无偏差保留，优选消除各物种，包括人、小鼠和大鼠的靶RNA，例如 rRNA，改进信噪比以便灵敏地检测低丰度RNA。
[0129] 本申请要求2012年9月18日提交的在先申请US 61/702, 594和2012年9月18 日提交的EP 12 006 534. 7的优先权，它们的全部公开内容通过引用并入本文。
[0130] 本发明不限于本文公开的示范性方法和材料，与本文所述那些相似或等价的任何 方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式。数字范围包括定义该范围的数字。本 文提供的标题不是对本发明各方面或实施方式的限制，这些标题可参考说明书作为整体阅 读。
[0131] 本文所用的术语"溶液"尤其是指液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅有一 相的均质混合物，但包含固体组分（如沉淀物）的溶液也属于本发明的范围。
[0132] 本文参考核苷酸nt显示的尺寸，相应尺寸范围是指链长，因此用于描述单链以及 双链分子的长度。所述核苷酸在双链分子中是成对的。因此，如果本文描述一双链分子具 有l〇〇nt的链长，所述双链分子包含100bp。
[0133] 根据一实施方式，本文所述的主题是指由相应步骤或成分构成的主题，在方法的 情况下包括某些步骤，在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包括某些成分。最好选择和结 合本文所述的优选实施方式，优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本发明。
[0134] 附图简述
[0135] 图1显示了为制备靶RNA消除的RNA组合物以供下一代测序应用的本发明方法与 现有技术方法之间的差异，本发明方法基于联用多组短探针与杂交体捕获，而现有技术方 法采用直接捕获方法，利用标记的长探针分子。在左手侧，显示了本发明方法。右手侧的方 法对应于现有技术。
[0136] 在步骤A中，所述探针分子与靶RNA杂交。在图1所示的本发明方法中（左侧）， 利用包括两组探针分子的探针集合。各组靶向同一靶RNA中的不同靶区域。各组包括三种 短的、峨连的单链DNA探针分子。当与它们的靶区域杂交时，因包含在一组中的毗连探针分 子的序列特异性退火而形成较长的双链杂交体。在其中包含在一组中的所有探针分子呈毗 连状的所示实施方式中，形成双链杂交体，其中各组中的探针分子之间不存在核苷酸间隙。 然而，邻近探针分子的毗连核苷酸之间不存在磷酸二酯键。相应的缺口示于图1。毗连设计 因上文解释的毗连探针分子之间的堆积作用而稳定所形成的双链杂交体。还显示了单一的 探针分子，其错配（由X表示）地非特异地结合于非靶RNA。然而，由于利用短探针分子，单 探针分子与非靶RNA的非特异性结合事件不产生稳定的杂交体，因为短分子的退火温度通 常太低，从而不能在错配的情况下产生稳定的杂交体。因此，可以采用严格的杂交条件除去 非特异性结合的短探针分子。在利用生物素标记的较长探针的现有技术方法中（右手侧）， 与非靶RNA形成更稳定的杂交体，因为探针长度较长而对不匹配具有更好的耐受性。因此， 与现有技术方法相比，在探针杂交的水平上，本发明方法因利用了短探针分子而显著更具 有特异性。
[0137] 在步骤B中，为捕获探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体，本发明方法利用抗 杂交体结合剂，此处为抗杂交体抗体（由Y表示）。抗杂交体抗体结合的表位的大致尺寸通 常约为20nt。通常，RNA/DNA杂交体越长，抗杂交体抗体的结合效率越好，相应地，靶RNA的 捕获和由此的消除更有效。此外，抗杂交体抗体不耐受或只耐受少数的错配。因此，形成的 双链杂交体越完美，抗杂交体抗体的结合效率越好。靶RNA和一组探针分子之间形成的较 长完美杂交体的识别优于形成的短杂交体，如果单个探针含错配地与非靶RNA杂交的话。 因此，特异性因进行的杂交体捕获步骤而进一步提高。现有技术方法不包括此类中间选择 步骤，因此，在现有技术中，特异性仅源自探针。此外，由于利用一组探针分子靶向靶RNA内 的特定祀区域，其中，所述革E区域优选具有l〇〇nt和250nt之间的长度，多种抗杂交体抗体 可结合所得到的双链杂交体，其具有优选在l〇〇nt和250nt之间的相应长度。这使去除效 率得以提高。
[0138] 在步骤C中，分离所形成的杂交体/结合剂复合物，以除去靶RNA。在图1所示的 本发明实施方式中，利用G蛋白官能化的珠（G-B)，其结合抗杂交体抗体，由此结合并从而 捕获所形成的杂交体/结合剂复合物。然而，因单个探针分子与非靶RNA的非特异性结合 而可能形成的双链杂交体，出于上述原因，抗杂交体抗体不与之结合、不会被捕获，因此不 会在步骤C中与剩余样品分离。因此，采用本发明方法，非特异性形成的双链杂交体不在步 骤C中除去，所以不会被消除。因此，本发明获得的靶RNA消除组合物保留所需RNA类型的 多样性，例如在消除rRNA作为不需要的靶RNA之时保留了其它polyA mRNA、非腺苷酸化的 mRNA、非编码RNA和调控RNA，等等。此外，与现有技术中采用的亲和标签方法不同，根据本 发明方法，只有杂交的探针被抗杂交体抗体识别，因此被捕获。这导致非常高的消除率和快 速反应时间。然而，在利用链霉亲和素官能化的珠（S-B)的现有技术方法中，非特异性产生 的杂交体也被消除，因为它们也为分离所用的亲和标签（此处是生物素）所标记。本发明 方法的优异效率和优良特异性还表现在随后的实施例中。如其中所示，即使本发明方法对 于消除靶RNA，例如rRNA是高效的，非特异性消除的所需RNA显著较低，从而无偏差地保留 了其它的RNA种类。
[0139] 图2显示了本发明方法获得的18S消除RNA组合物得到的Agilent?数据，其中利 用长度为25nt (蓝线）或50nt (红线）的探针分子（参见实施例1I)。a)对照RNA，其显 示18S和28S rRNA的两个峰（无消除）；b) 250 y L 1 % he (杂交体捕获）珠得到的结果。 C) 500 y 1 1 % he珠得到的结果。
[0140] 图3显示了采用本发明方法进行18S RNA消除的RT-PCR结果。随着珠用量的增 加，形成的杂交体/结合剂复合物的去除得以改善，18S rRNA显著消除。18S rRNA消除样 品中保留的原始18S rRNA不到0. 5% (参见实施例1I)。
[0141] 图4显示了 28S rRNA的相应PCR结果，它不受杂交体捕获过程的影响，证明该方 法的特异性（参见实施例1I)。
[0142] 图5显示了两个测序运行（参见实施例VII)的结果。在第一测序运行中，比较了 Ribo-Zero (Epicenter)、RiboMinus (英杰公司-Invitrogen)、采用以下实施方式的本发明 方法和polyA富集：a)其中抗体共价连接于磁性珠的实施方式（发明A)，和b)其中利用 游离抗-杂交体抗体和G蛋白珠进行捕获的实施方式（发明B)，图5a)显示了所获得的生 物型分布。可以看出，与现有技术rRNA消除方法相比，本发明方法最佳地保留了蛋白编码 mRNA。此外，引入的偏倚较少，RNA样品的天然多样性得到保留。图5b)显示第二测序运行 的结果。在此，RiboMinus未重新测试，因为第一测序运行的结果表明其性能不高。相反， 测试了两种不同的Ribo-Zero试剂盒（Ribo-Zero and Ribo-Zero gold)，并与本发明方法 的实施方式进行比较。在此，利用游离的抗杂交体抗体和G蛋白官能化珠进行捕获，其中在 一个实施方式中，利用磁体进行分离并且在其它实施方式中，利用旋转过滤器。此外，polyA 富集作为对照。
[0143] 图6显示了与polyA-富集方法的结果相比，各消除方法（本发明，两种现有技术 方法）测序后，绘制成蛋白质编码基因的读取数值，以确定消除方法的特异性（参见实施例 VIII)。浅灰色圆点表示在p〇ly-A富集中丢失的无polyA-尾的mRNA的读取值（例如组 蛋白）。结果表明，与现有技术的rRNA消除方法相比，本发明方法保留了原始样品中表现 出的mRNA概况，因为相比于现有技术方法（0. 31和0. 27)，获得了接近1的显著较高R2值 (0? 86)〇
[0144] 图7显示了 rRNA消除的特异性以便更好地表示蛋白质编码基因（参见实施例 VIII)。将采用本发明方法（见右列）或现有技术消除方法（RZ = RiboZero,见左列；RM = RiboMinus，见中间列）消除rRNA后存在于样品中的蛋白质编码基因的数量与polyA富集 作比较。消除基因的数量和消除的幅度均显著低于本发明。
[0145] 图8显示本发明方法能消除总RNA中含量低至10ng的靶RNA，同时保持消除性能 (参见实施例X)。通过消除与阳性对照之间的delta Ct检测到，本发明方法观察到等效性 能。不应消除的RNA(此处为：beta肌动蛋白）即使在低浓度下也得到了保留。
[0146] 图9显示了利用长度为12/13nt的探针分子得到的结果（参见实施例XI)。图9 证明，如果将探针分子置于彼此相邻，特别是如果利用多个探针分子，消除结果得到改善。 结果证实了上文解释的增加邻近性的益处，并显示使用更多的探针也更有利。
[0147] 图10显示不同水平毗连性对b-肌动蛋白的特异性（参见实施例XII)。 实施例
[0148] I.材料与方法
[0149] 1. 5S、5. 8S、18S、28S 的 DNA 寡核酸探针
[0150] 通过取得人、小鼠、大鼠核糖体RNA的参比序列并将它们在ClustalW2 (http: // www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)中比对来设计探针。分析得到的文件中在3个 物种之间具有100%同源性的区域，并设计相应探针。虽然人、小鼠和大鼠用作主要的设计 标准，但这些探针与各种其它物种中的rRNA高度同源，其中在其它哺乳动物中的同源性最 高，但在所有真核生物中发现显著的同源性。因此，可同时为更多的物种设计多组探针分 子和探针集合，而不限于此处所显示的。植物、细菌和其它生物都可以具有所设计的特异 性探针集合，它们将是同样有效的。还可以为任何意欲消除的特定核酸序列，例如球蛋白 RNA(例如，在全血制剂中）设计探针。可以相同的方式消除线粒体和质体rRNA。
[0151] 探头设计的首要考虑是提供包含连续（"堆叠"）探针分子的各组。一组的探针分 子靶向的靶区域的尺寸约为总计100-150nt。对于较长的rRNA(18S，28S)，制备包含多组探 针分子的探针集合，其中各组靶向靶RNA内的不同靶区域。将靶区间隔开，以便尽可能均匀 地覆盖所述靶核糖体RNA，从而能有效除去片段化以及完整的rRNA。探针设计的次要考虑 是GC(优选40-60% )。实施例中设计并测试了长度介于10nt和50nt之间的探针。优选 25nt的长度，从而在较小的探针长度（增加特异性和确保随后干扰较少）和消除性能（较 长探针的效率略高）之间作出平衡。这种结合确保非常高的消除性能，同时确保高特异性， 特别是如果利用本文所述的毗连探针设计的话。当为本文所述原因利用抗杂交体抗体时， 尤其能实现这点。
[0152] 所用的25聚体示于表1。显示了靶向靶RNA中靶区域的探针分子组。探针名称 提供靶RNA(例如，5S rRNA)，物种（HMR =人、小鼠、大鼠），靶rRNA上的核苷酸位置（例如 2)和探针长度（25)的信息。可以看到，为消除短RNA(5S RNA和5. 8S RNA)，每种靶RNA利 用一组探针分子。为靶向5S RNA，该组中包含的四种探针分子均是毗连的。靶向5. 8S RNA 的组中包含的第一和第二以及第三和第四探针分子是毗连的，同时3nt的缺口隔开第二和 第三探针分子。为靶向18S RNA，利用由五组探针分子构成的探针集合，其中各组包含6种 探针分子。除了第一组，所有组的探针分子是毗连的，其中lnt的缺口隔开第一探针分子与 第二探针分子。因此，包含在18S rRNA探针集合中的95%以上的探针分子与它们的组成 员是毗连的。为消除长28S rRNA，利用包含13组探针分子的探针集合。可以看到，除了组 III，利用的各组探针分子中整组中的所有探针分子均是毗连的。在组III中，利用邻近的 探针分子，然而，其中当杂交于靶区域时，探针分子之间存在20nt或更小的缺口，藉此形成 双链杂交体。
[0153] 表1 :探针分子
[0154]
【主权项】
1. 一种从初始的含RNA组合物制备祀RNA消除组合物的方法，包括； a) 使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在祀RNA和探针分子之间产生 双链杂交体，其中的探针分子组具有W下特征： i) 该组包括长度为lOOnt或更小的两种或多种不同的探针分子； ii) 包含于所述组中的探针分子与祀RNA中的祀区域互补； iii) 当与所述祀区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中 处于彼此邻近定位； b) 利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合 物； C)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供祀RNA消除的组合物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，当杂交到所述祀区域时，一组中的两种或多 种探针分子在形成的双链杂交体中彼此邮连，或者其中，一组中的所有探针分子在形成的 双链杂交体中彼此邮连。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述探针分子的长度选自35nt或更小、 30nt或更小或25nt或更小，优选长度在10nt-35nt或15nt-3化t的范围内。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，利用探针集合消除特定的祀 RNA，其中探针集合包含两组或多组探针分子，并且其中包含在该探针集合中的各组探针分 子祀向于祀RNA中的不同祀区域。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在特定的祀RNA中，所述祀区域位于50化t 或更小、450nt或更小、400nt或更小、350nt或更小、300nt或更小、250nt或更小、200nt或 更小或150nt或更小的距离内。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，包含在探针集合中的至少85%、至少 90%或至少95%的探针分子与它们的组成员邮连。
7. 如权利要求1-6中一项或多项所述的方法，其特征在于，具有W下一种或多种特征： i) 所述祀区域基本上对应于所述祀RNA的全长； ii) 所述祀区域是在所述祀RNA中保守的区域； iii) 所述祀区域是在不同物种中保守的区域； iv) 所述祀区域是在所述祀RNA中保守的且至少在人、小鼠和大鼠中保守的区域； V)与一组探针分子杂交的祀区域的尺寸选自；50nt至50化t、50nt至350、50nt至 250nt、75nt 至 225nt、100nt 至 200nt 和 lOOnt 至 175nt ; Vi)利用探针集合消除特定祀RNA，其中探针集合包括两组或多组探针分子，其中各组 探针分子祀向祀RNA中的不同祀区域，并且其中所述祀区域分布在祀RNA的全长上；和/或 vii)其中所述祀RNA消除效率为至少95%、优选至少98%、优选至少99%、更优选至 少99. 5 %、最优选至少99. 9 %。
8. 如权利要求1-7中一项或多项所述的方法，其特征在于，从初始的含RNA组合物中消 除多种祀RNA。
9. 如权利要求1-8中一项或多项所述的方法，其