专利名称：Rna断裂试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及第ニ代高通量测序，特别是RNA测序领域，更具体地本发明涉及ー种RNA断裂试剂及应用。
背景技术：
随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析的重要新手段，转录组是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。目前RNA-Seq的主要的流程包括，首先，用Poly⑴寡聚核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly (A)尾的RNA，其中主要是编码基因所转录的mRNA，将所得RNA随机打断成片段，こ醇沉淀回收RNA片段，再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段，然后，对cDNA片段进行末端修复并连接测序接头(adapter)，得到将用于测序的cDNA。在这ー过程中，之所以选择先将RNA打断，而不是在cDNA合成后打断cDNA，是因为RNA打断操作相对简单、快捷，并且打断的随机性和均一性良好。目前，对于片段化RNA, Illumina/Solexa测序平台提供的试剂是AppliedBiosystem(ABI)公司的 RNA 断裂试剂(RNA FragmentationReagents, AM8740),具体打断的操作过程如下在9iil含有RNA的体系中，加入IiU IOX断裂缓冲液(10X FragmentationBuffer)，混匀，将反应管置于70°C 15分钟，然后加入I 终止反应液(Stop Solution)终止反应，立即将反应管置于冰上，此反应条件能将< IOii g的RNA随机打断成60-200nt大小的片段。该断裂试剂为含Zn2+的缓冲液，终止反应液为200mM EDTA pH8.0溶液。该断裂缓冲液打断RNA的效果不错，但是较为繁琐的步骤影响了实验效率，比如得加入金属螯合剂来终止片段化反应，打断后需要用こ醇沉淀回收样品才能进行后续的逆转录反应，这些步骤不仅减慢了实验速度，増加了操作的复杂性，而且也不适合批量样品建库操作，不利于整个方法流程的自动化。
发明内容
为克服上述市售的RNA断裂试剂的缺陷，我们利用高温下ニ价阳离子溶液能将RNA打断的性质，结合考虑逆转录过程的必要条件，提供了ー种RNA断裂试剂及利用该试剂构建RNA-seq文库的方法。本发明一方面提供了ー种RNA断裂试剂，包括維持pH值在7至9之间的生物缓冲液，ー价金属离子和ニ价金属离子；其中所述生物缓冲液、ー价金属离子和ニ价金属离子均处于有效浓度。本发明的ー价金属离子为cDNA—链合成所必需。本发明的ニ价金属离子为打断RNA所必需。本发明所指有效浓度是指能够达到本发明效果的浓度范围，本发明效果主要指不需要加反应终止剂，也不需要任何纯化步骤便能直接进行后续的反应，例如逆转录反应，以便于自动化。在本发明的一个优选实施例中，所述生物缓冲液为Tris缓冲液，其浓度为100-350mM，优选150_300mM，更优选200_250mM ;维持pH值在7至9之间。
在本发明的一个优选实施例中，所述ー价金属离子为K+和/或Na+，优选K+ ;—价金属离子浓度为80-400mM，优选地90-300mM，更优选100_250mM。在本发明的一个优选实施例中，所述ニ价金属阳离子为Mg2+和/或Zn2+，优选地Mg2+和Zn2+ ；Mg2+离子的浓度为8-100mM，优选10_80mM，更优选15_60mM ；Zn2+离子的浓度为8-100mM，优选 10-80mM，更优选 15_60mM。在本发明的RNA断裂试剂，其中所述RNA来源于原核或真核生物。可以来源于单个细胞，多个细胞，单种细胞，多种细胞，单个组织，多个组织，单种组织，多种组织，ー个生物，多个生物，ー种生物或多种生物。本发明另一方面提供了上述RNA断裂试剂的应用，包括使用上述RNA断裂试剂断裂RNA的步骤。具体地，该应用可以是ー种构建RNA测序文库的方法，其包括使用上述RNA断裂试剂断裂RNA的步骤。 在本发明的一个优选实施例中，提供了一种构建RNA测序文库的方法，包括以下步骤(a)使用所述的RNA断裂试剂断裂RNA得到RNA片段；(b)在步骤(a)后的反应体系中直接加入逆转录酶和随机引物，进行逆转录合成cDNA第一链；(c)在步骤(b)后的反应体系中加入聚合酶和cDNA ニ链合成缓冲液，合成cDNA第ニ链；(d)纯化步骤(C)所得双链cDNA ；(e)对双链cDNA进行末端修复，加“A”和连接测序接头，得到连接产物；(f) PCR扩增(e)所得连接产物以产生文库。在本发明的一个优选实施例中，其中所述RNA断裂试剂打断RNA的作用温度是70-100°C，优选85-95°C，更优选94°C ;作用时间是3_12min，优选6_10min，更优选lOmin。在本发明的一个优选实施例中，其中所述步骤(a)断裂RNA产生的RNA片段含有60-1500nt，优选 150-700nt，更优选 150_500nt。本发明另一方面提供了ー种RNA测序文库，其由上述方法制得。本发明另一方面还提供了一种测序方法，其包括构建权利要求10所述RNA测序文库，并对该测序文库进行测序的步骤。在本发明中，对依照所述构建RNA测序文库的方法获得RNA测序文库进行测序的方法，所述测序可通过任何测序方法进行，包括但不限于双脱氧链终止法；优选高通量的测序方法，包括但不限于第二代测序平台或者是单分子测序平台。所述第二代测序平日(Metzker ML. Sequencingtechnologies-the next generation. Nat Rev Genet. 11 (I)31-46,2010)包括但不限于 Illumina/Solexa (GATM, HiSeq2000TM 等)、ABI Solid 和Roche454(焦磷酸测序)测序平台；单分子测序平台(技木)包括但不限于Helicos公司的真实单分子测序技术(True Single Molecule DNA sequencing) ,Pacific Biosciences公司单分子实时测序(single molecule real-time (SMRT )),以及 Oxford NanoporeTechnologies 公司的纳米孔测序技术等(Rusk, Nicole. Cheap Third-GenerationSequencing. Nature Methods. 6(4) :244-244,2009)。本发明的有益效果
该RNA 断裂试剂和 ABI 公司提供的 RNA Fragmentation Reagents (AM8740)打断效果相当，并且调整打断温度和打断时间，能满足对不同片段大小的需求。将该试剂应用于RNA测序文库构建表现出的另外ー个优势在于断裂RNA后，不需要加反应终止剂，也不需要任何纯化步骤便能直接进行后续的逆转录反应，即在特定的逆转录反应体系中，该断裂试剂能替代ー链合成缓冲液，不必另外加入ー链合成缓冲液，且获得的数据与根据Illumina mRNA-Seq 文库制备标准流程(mRNA SequencingSample Preparation Guide,part#1004898)所得到的数据一致。说明使用该RNA断裂试剂构建RNA测序文库的方法简化了操作步骤，节约时间，降低成本，在不影响结果的基础上，为自动化操作创造了非常有利的条件，使自动化批量样品建库成为可能。
图I为本发明对照例中Illumina mRNA-Seq文库制备流程示意图；图2为本发明实施例I中mRNA-Seq文库制备流程示意图；图3为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明对照例中Illumina测序平台提供的5XRNA断裂试剂在94°C断裂5min所得；图4为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例I中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂3min所得；图5为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例I中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂6min所得；图6为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例I中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂12min所得；图7为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-AB，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图8为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-AB平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图9为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图10为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图11为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自玉米RNA，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图12为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自玉米RNA平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图13为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自水稻RNA，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图14为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自水稻RNA平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图15为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自真菌RNA，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图16为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自真菌RNA平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图17为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自小鼠RNA，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得；图18为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自小鼠RNA平行样，用本发明实施例11中的3XRNA断裂试剂在94°C断裂IOmin所得。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
为了从实验数据和图表上直观显示出本发明的有益效果，我们将此发明用于mRNA-Seq建库过程中。mRNA-Seq样品制备參考Illumina公司提供的mRNA-seq建库标准流程(mRNA Sequencing Sample PreparationGuide,part#1004898)进行，图 I 为对照例中Illumina mRNA-Seq文库制备流程示意图；图2为实施例I中mRNA-seq (mRNA测序)文库制备流程示意图。实施例I为确定较优的RNA打断条件，采用同一 RNA断裂试剂对相同的样本进行试验，设置5个断裂温度梯度为70°C、80°C、90°C、94°C和100°C，6个断裂时间梯度为I. 5min、3min、6min、8min、IOmin 和 12min,共 30 种方案。I. I样品试剂MAQC-Agilent (Universal Human Reference RNA, UHRR, Stratagen)；MAQC-AB (Human Brain Reference RNA，Ambion) ；3X RNA 断裂试剂200mM Tris-HCl (pH
8.0), IOOmM KCl,15mM MgCl2,15mMZnCl2 (断裂试剂的各组分均购自Sigma，试剂不含RNA酶);其它各试剂缓冲液，除另有标明，均来自Illumina公司提供的mRNA-Seq样品制备试剂盒。I. 2实验步骤I. 2. I 纯化 mRNAI)取 I-IOii g 总 RNA (MAQC-Agilent 或MAQC-AB)至ー个无 RNA 酶的 EP 管(Axygen)中，用DEPC水(Ambion)稀释至50yl。混匀，65°C变性5分钟以打开ニ级结构，然后立即将样品置于冰上。2)吸取 15 U I Sera-Mag oligo (dT)磁珠(Invitrogen)于 I. 5ml 的 non-stick-EP管中，用100 u I结合缓冲液洗磁珠两次，将磁珠重悬于50 u I结合缓冲液，将第一步中制得的总RNA加入管中，室温放置5min。3)将non-stick-EP管置于磁分离器(MPC, Invitrogen)上2min,去除上清，再用200 u I洗脱缓冲液清洗磁珠两次。取一新的不粘的EP管，加入50 u I的结合缓冲液。4)向含磁珠的EP管中加入50 u I IOmM Tris-HCl，80°C加热2min将mRNA从磁珠上洗脱下来，迅速将EP管转至MPC上，转移mRNA至上步加有50 U I结合缓冲液的EP管，将混合溶液在65 °C变性5min，打开ニ级结构，然后立即将样品置于冰上。另外，立即将200 yl洗脱缓冲液加入到含有磁珠管中，洗两次磁珠。
5)将100 u I mRNA样品加入洗过两次的磁珠中，室温放置5min，将EP管置于MPC上2min，小心吸除上清，再用200 U I洗脱缓冲液清洗磁珠两次。6)向含磁珠的EP管中加入17 ill IOmM Tris_HCl，80°C加热2min，从而将mRNA从磁珠上洗脱下来。迅速地将EP管转至MPC上，转移mRNA洗脱液至一新的200 u I PCR管中，大约能回收16y I mRNA。I. 2. 2断裂mRNA及合成cDNA第一链往回收到的16 ill mRNA溶液加入5. I iU 3X RNA断裂试剂，94 V IOmin (或700C I. 5min 或 70°C 3min 或 70°C 6min 或 70°C 8min 或 70°C IOmin 或 70°C 12min，其它温度80で、90で、94で和100°C设置作用时间同70°C )，立即置于冰上，加入随机引物lyl，65°C 5min打开单链ニ级结构，置于冰上。配置反应混合物，包括2 IOOmM DTT.O. 4u I25mMdNTP混合底物、0. 5u I RNA抑制剂，将混合物加入含RNA的管中，混匀后室温放置2min，然后加入IiU 200U/ u I Superscript II逆转录酶混匀，总体系25 yl。在PCR仪上按照以下程序进行反应Step 125 °C IOminStep 242 °C 50minStep 370 °C 15minStep 44°C HoldI. 2. 3 合成 cDNA 第二链向一链反应体系中补水至82.8 iil，依次加入IOiil GEX ニ链合成缓冲液、I. 2 ill25mM dNTP混合物，混匀，冰上放置5min，再加入I y IRNaseH,5 u I DNA聚合酶，混匀，将反应管置于16°C反应2. 5小时。反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化双链cDNA产物，溶于50iU洗脱液。I. 2. 4末端修复上述步骤得到50iU DNA溶液，向反应体系中依次加入27. 4 yl水、IOyl IOX末端修复缓冲液、I. 6u I 25mM dNTP混合物、5 y I T4DNA聚合酶、I ii I Klenow DNA聚合酶、5u I T4PNK，总反应体系为lOOiil，将反应管置于20°C反应30min。反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化末端修复产物，溶于32iU洗脱液。I. 2.5 加 A，加接头上述步骤得到32 ill DNA溶液，向反应体系中依次加入5 ill A-Tailing反应液、IOu I ImM dATP、3iil Klenow exo(3/ to 5'外切酶)，总反应体系为50 yl，将反应管置于 37°C 反应 30min。反应完成后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化加A产物，溶于23 yl洗脱液。上述步骤得到23 ill加A产物，向反应体系中依次加入25 ill 2X T4DNA快速连接缓冲液、Iu I PE接头混合物、I U I T4DNA连接酶，总反应体系为50 u 1，将反应管置于室温汉攸15min。
反应完成后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化连接产物，溶于10 yl洗
脱液1.2.6连接产物胶纯化配制2%的琼脂糖凝胶,选择IOObp DNA Ladder, 120v电泳60min,切胶回收,根据接头以及所需目的片段大小决定，切胶范围为200_400bp。切下的胶块用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen)回收,最后溶于30 y I洗脱液。I. 2. 7PCR扩增及纯化上述步骤得到30 U I连接产物，向反应体系中依次加入10 U I 5XPhusion缓冲液、I u I PCR Primer PE I. OU U I PCR Primer PE 2. 0,0. 5 u I 25mM dNTP 混合物、0. 5 u IPhusion DNA聚合酶、7 y I水，总反应体系50 yl。在PCR仪上按照以下程序进行反应a. 30seconds at 98°Cb. 15cycles of IOseconds at 98°C30seconds at 65°C30seconds at 72°Cc. 5minutes at 72°Cd. Hold at 4°C反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，溶于32 yl洗脱液，用Agilent Bioanalyzer 2100对各个文库进行检测,对3XRNA断裂试剂94°C处理IOmin 的制得的 MAQC-AB 和 MAQC-AgilentRNA-Seq 文库模板进行 Illumina Hiseq2000 测序。Agilent Bioanalyzer 2100对RNA片段大小的检测结果图表明对于样本MAQC-Agilent或MAQC-AB，在各个作用温度下，断裂I. 5min不能将RNA打断成相对较集中的片段，作用3min、6min或Smin存在不同程度的大片段，而断裂12min目的片段相对较小，图4-6分别是以MAQC-Agilent RNA为样本，3XRNA断裂试剂94°C下断裂RNA 3min、6min及12min的AgilentBioanalyzer 2100检测图，从图上看，RNA被打断成相对集中的片段，但从片段大小的覆盖度来看，图4显示断裂3min仍然存在大量未被打断或者没有完全打断的RNA，图5所示断裂6min效果有所改善，仍有700bp左右的片段，图6所示打断12min，形成的主峰比较集中，但是由于打断时间片长，目的片段相对稍小。从峰图的覆盖度和文库的信息分析要求来看，利用该试剂断裂不同样本RNA的时间可在3-12min范围调整。同样的MAQC-Agi I ent样本，在固定的断裂时间如IOmin，断裂温度70 V，80°C，90で或100 V效果不如或近似于94°C (图谱未显示)。所以，对于MAQC-Agilent或MAQC-AB，结合考虑断裂温度和时间对RNA片段的大小范围集中程度的影响，选择较优的作用条件为94°C IOmin,图I和图8中的RNA片段来自MAQC-AB平行样，3XRNA断裂试剂94°C处理IOmin ;图9和图10的RNA片段其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样，3 X RNA断裂试剂94°C处理lOmin。Illumina Hiseq2000 对 3XRNA 断裂试剂 94°C处理 IOmin 制得的 RNA-Seq 文库模板(MAQC-AB和MAQC-Agilent)进行测序，数据统计见表I。将此Illumina HiSeq2000测序数据，与依照Illumina mRNA-Seq建库标准流程制备得的文库的测序数据(“对照例”结果)作比较，各自测序所得数据及分析结果见表1-3，后面做专门讨论。
以下实施例2 10是以同样的RNA样品(MAQC-AB或MAQC-Agilent)在固定打断时间为lOmin、打断温度为94°C的情况下，检测所述RNA断裂试剂组分和浓度的调整对RNA断裂效果影响的实例。实施例22. I样品试剂3X RNA 断裂试剂100mM Tris-HCl (pH 8. 0) ,400mM KCl,8mMMgCl2, IOOmMZnCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA 酶);其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例一。2. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例33. I样品试剂3X RNA 断裂试剂350mM Tris-HCl (pH 8. 0) ,80mM NaCl, IOOmMMgCl2,8mMZnCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶);其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。3. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例44. I样品试剂3X RNA 断裂试剂150mM Tris-HCl(pH 8. 0),300mM KC1,9OmMNaC1,8OmMMgCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶);其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。4. 2实验步骤试验步骤同1.2. I 1.2.7。实施例55. I样品试剂3X RNA 断裂试剂300mM Tris-HCl (pH 8. 0), 250mM KCl, IOOmMNaCl, IOmMZnCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶);其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。5. 2实验步骤试验步骤同1.2. I 1.2.7。实施例66. I样品试剂3X RNA 断裂试剂250mM Tris-HCl (pH 8. 0)，IOOmM KCl，IOOmMNaC1,6OmM MgCl2,15mM ZnCl2(断裂试剂各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。6. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例7
7. I样品试剂3X RNA断裂试剂200mM Tris-HCl (pH 8. 0),90mM NaCl，IOOmMMgCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。7. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例88. I样品试剂3X RNA 断裂试剂IOOmM Tris-HCl (pH8. 0), 250mM NaCl，8mMZnCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。 8. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例99. I样品试剂3X RNA 断裂试剂200mM Tris-HCl (pH 8. 0), 300mM KC1，80mMMgCl2 (断裂试剂各组分来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。9. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。实施例1010. I样品试剂3X RNA 断裂试剂200mM Tris-HCl (pH 8. 0), IOOmM KC1，15mMZnCl2 (断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例I。10. 2实验步骤试验步骤同I. 2. I I. 2. 7。对实施例2 10 所得的 RNA-Seq 文库(MAQC-AB 或 MAQC-Agilent)进行 AgilentBioanalyzer 2100检测。检测图(未列出)显示对同样的样本，在同样的断裂条件940C IOmin下，这9个调整3X RNA断裂试剂的组分组成及浓度的方案对RNA的打断效果不如或与实施例 I 的 3X RNA 断裂试剂(200mM Tris-HCl (pH 8. 0), IOOmM KCl, 15mM MgCl2,15mM ZnCl2)的效果相近。本领域的技术人员可以了解，只要将维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，用于ー链合成的ー价金属离子和用于断裂RNA的ニ价金属离子这三种组分混合在一起，并调配这三种组分在有效浓度，就能够达到本发明的基本目的。为达到更好的效果，本发明也相应给出了这三种组分的优选组合和浓度。所述生物缓冲液优选为Tris缓冲液，其浓度为100-350mM，优选150-300mM，更优选200-250mM ;维持pH值在7至9之间。所述ー价金属离子优选为K+和/或Na+，优选K+ ;—价金属离子的浓度为80-400mM，优选地100_300mM，更优选200-250mM。所述ニ价金属阳离子优选为Mg2+和/或Zn2+，更优选Mg2+和Zn2+ ;Mg2+离子的浓度为8-100mM，优选10-80mM，更优选15_60mM ;Zn2+离子的浓度为8_100mM，优选10_80mM，更优选15-60mM。使用这些參数或者在这些參数的附近，本领域的技术人员将很容易的达到本发明的目的，即简化操作步骤，节约时间，降低成本和实现自动化。实施例11
为了验证本发明的稳定性和可重复性，在一祥的断裂试剂及作用条件下(3X RNA 断裂试剂200mM Tris-HCl (pH 8. 0), IOOmM KCl, 15mMMgCl2,15mM ZnCl2,94 °C lOmin)，选取不同物种平行建库，所选样品除了 MAQC-Agilent和MAQC-AB，还有利用TRIzol (Invitrogen)提取的小鼠、水稻、玉米或真菌的RNA。11. I样品试剂TRIzol (Invitrogen)提取的小鼠、水稻、玉米或真菌的RNA ;各试剂缓冲液，同实施例I。11. 2实验步骤
操作步骤同I. 2. I I. 2. 7。对不同物种平行建库,使用Agilent Bioanalyzer 2100检测片段大小，结果见图7-18，图7-18为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图。图7和图8中的RNA片段来自MAQC-AB平行样；图9和图10的RNA片段其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样；图11和图12的RNA片段来自玉米RNA平行样；图13和图14的RNA片段来自水稻RNA平行样；图15和图16的RNA片段来自真菌RNA平行样；图17和图18的RNA片段来自小鼠RNA平行样。从每组样品的两个重复看，本发明的打断缓冲液及其打断条件对同一样品的重复性非常好，打断片段与集中度都很相似，如图9和图10显示，打断片段非常接近，峰图也非常相似。由此，我们认为本发明对同一样品的重复性良好；在不同样品之间，由于样品的特殊性，打断的片段大小有些许差别，但峰形都很正常，片段集中度都较高，覆盖度也很接近，因此，本发明方法适用于所测试的样品，打断效果良好，具有良好的可重复性与稳定性。对照例样品试剂5X RNA断裂缓冲液(Applied Biosystem);其他材料、试剂或缓冲液来源同实施例I中的I. I操作步骤I)纯化mRNA，操作步骤同I. 2. I ;2)断裂 mRNA加入4iil 5X RNA断裂缓冲液，94°C 5min，立即加入2yl终止反应液，随后加入3M NaAC (pH 5. 2)、糖元、100%こ醇，混匀后置于_80°C 30min，沉淀出RNA。3)合成 cDNA 第一链将RNA沉淀溶于DEPC水中进行ー链合成反应。ー链合成体系如下11. Iul RNA,随机引物I ul，65°C 5min打开单链ニ级结构，置于冰上。配置反应混合物，包括4 5X —链缓冲液、2 IOOmM DTT.O. 4u 125mM dNTP Mix.O. 5u I RNA酶抑制剂将混合物加入含RNA的管中，混匀后室温放置2min，然后加入I y I Superscript II逆转录酶(200U/iU)混匀，总体系20 yl。在PCR仪上按照以下程序进行反应Step 125 °C IOminStep 242 °C 50minStep 370 °C 15minStep 44°C Hold后续操作步骤同实施例I中的I. 2. 3 I. 2. 7。反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，溶于32 U I洗脱液，用Agilent Bioanalyzer 2100和Illumina Hiseq2000对纯化产物进行检测和测序。图3为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent,利用Illumina测序平台提供的5XRNA断裂试剂在94°C断裂5min所得。测序所得数据及分析见表1-3，与实施例I所得的数据作比较。对两种微阵列质量控制标准品(MAQC标准品)MAQC-AB和MAQC-Agilent分别用对照例IHumina测序平台提供的方法a和本发明方法b (实施例I的方法)同时构建文库，各做三个重复(1、2和3)，采用样本MAQC-AB和MAQC-Agilent构建的RNA-Seq文库分析本发明方法对测序数据的影响，利用Illumina HiSeq2000测序仪测序，分别做了以下三方面的分析测序原始数据统计、与QPCR的绝对定量的基因表达相关性分析、相同数据量检测基 因数的比较分析。表I为a、b两种方法构建的MAQC标准品文库的原始测序数据统计，从表中看出对同一样品，a、b两种的建库方法得到的reads比对到基因上的比率相当，正负偏差小于5%，可以认为两种方法并无显著差别；表2为a、b两种建库方法得到的基因表达量与QPCR检测结果的相关性分析结果，两种不同建库方法得到的基因表达量与QPCR检测同样样品得到的基因表达量进行Spearman相关性分析，相关系数从0-1，数字越大，说明两者之间越接近，即相关性越好。从表中数据看，a、b两种方法的相关系数都达到0. 85以上(大于0. 8，符合标准)，说明本发明方法b的RNA-Seq与QPCR的相关性高，定量准确；两种方法得到的绝对定量的基因表达的相关系数非常接近，表明和Illumina提供的方法的数据相比，本发明数据可靠、可信；表3为a、b两种建库法测序相同数据量中检测到的基因数的比较，同样的数据量，基因数越接近，表明两种方法结果越相似，数据显示，对同一样品，两种不同的建库方法在相同数据量检测到的基因数相差无几，由此证实本发明的建库方法b与Illumina提供的方法a得到的数据一致，从而证明本发明RNA断裂试剂及其打断条件适用于mRNA-seq建库，得到的数据真实、可信，且对信息分析没有影响。表la、b两种方法构建的MAQC标准品文库的原始测序数据统计
样品 [MAQC-A_pilent _ _ I MAQC-AB ——
项目I] 23I丨:21:3 59.57%I 58.86% jJ8.76% 47.57% f 47.51% 1=54.56%表2a、b方法构建的MAQC标准品文库的基因表达量与QPCR检测结果的相关性分
析
权利要求
1.RNA断裂试剂，包括維持pH值在7至9之间的生物缓冲液，ー价金属离子和ニ价金属离子；其中所述生物缓冲液、ー价金属离子和ニ价金属离子均处于有效浓度。
2.权利要求I所述RNA断裂试剂，其中所述生物缓冲液为Tris缓冲液；浓度为100-350mM,优选150_300mM，更优选200_250mM ;维持pH值在7至9之间。
3.权利要求I所述RNA断裂试剂，其中所述ー价金属离子为K+和/或Na+，优选K+; —价金属离子的浓度为80-400mM，优选地90-300mM，更优选100_250mM。
4.权利要求I所述RNA断裂试剂，其中所述ニ价金属阳离子为Mg2+和/或Zn2+，优选Mg2+和Zn2+ ；Mg2+离子的浓度为8-100mM，优选10_80mM，更优选15_60mM ；Zn2+离子的浓度为8-100mM，优选 10-80mM，更优选 15_60mM。
5.权利要求I 4中任一项所述的RNA断裂试剂，其中所述RNA来源于原核或真核生物。
6.权利要求I 5中任一项所述RNA断裂试剂的应用，包括使用所述RNA断裂试剂打断RNA的步骤。
7.—种构建RNA测序文库的方法，包括以下步骤 (a)使用权利要求I 5中任一项所述的RNA断裂试剂断裂RNA得到RNA片段； (b)在步骤(a)后的反应体系中直接加入逆转录酶和随机引物，进行逆转录合成cDNA第一链； (c)在步骤(b)后的反应体系中加入聚合酶和cDNAニ链合成缓冲液，合成cDNA第二链； (d)纯化步骤(c)所得双链cDNA； (e)对双链cDNA进行末端修复，加“A”和连接测序接头，得到连接产物； (f)PCR扩增(e)所得连接产物以产生文库。
8.权利要求7所述的方法，其中所述RNA断裂试剂打断RNA的作用温度是70_100°C，优选85_95°C,更优选94°C ;作用时间是3_12min,优选6_10min,更优选lOmin。
9.权利要求7所述的方法，其中所述步骤(a)断裂RNA产生的RNA片段含有60-1500nt，优选 150-700nt，更优选 150_500nt。
10.ー种RNA测序文库，其由权利要求7 9中任一项所述方法制得。
11.一种测序方法，其包括构建权利要求10所述RNA测序文库，并对该文库进行测序的步骤；所述测序使用高通量测序平台进行，所述高通量测序平台选自Illumina/Solexa.ABISolid和Roche 454测序平台。
全文摘要
本发明涉及高通量测序技术，具体提供了一种RNA断裂试剂及其应用。本发明提供的RNA断裂试剂，包括维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，一价金属离子和二价金属离子；其中所述生物缓冲液、一价金属离子和二价金属离子均处于有效浓度。本发明还提供了上述试剂在RNA测序文库构建中的应用。利用该试剂的建库方法简化了操作步骤，在节约时间、降低成本的同时，利于自动化批量样品建库，利于自动化仪器的应用。
文档编号C40B40/08GK102643792SQ20111004003
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者张秀清, 张艳艳, 杨焕明, 田方, 章文蔚, 胡轶霖, 陈海燕 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司