使用抗gpr49抗体的癌症的诊断和治疗的制作方法

专利名称：使用抗gpr49抗体的癌症的诊断和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的诊断方法、治疗方法和抗癌药。
背景技术：
GPR49分子是由人染色体12ql2的ENSG00000139292基因编码的蛋白，该分子是G 蛋白偶联7次膜结合蛋白的激素受体家族的LGR家族(富含亮氨酸GPCR家族、以下称作LGR 家族)的成员，这由其氨基酸序列的特征即可明确(非专利文献1)。LGR家族成员中，包括 LHR、TSHR、FSH等激素受体、以及以松弛素、胰岛素样肽3 (INSL3)等作为配体的LGR7、LGR8 等(非专利文献2)。已知所有配体均包含不同的肽，主要传递由cAMP介导的信号。LGR家 族具有包含7次跨膜蛋白区和N末端长的胞外区的结构，胞外区中存在9-17个由约25个氨 基酸构成的重复的富含亮氨酸的区(富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat) :LRR)。 GPR49有17次LRR(非专利文献1)。由TSHR等的分析可知配体以高亲和性与该细胞外的 LRR结合，并且与第2细胞外环状区结合，从而进行与G蛋白偶联的信号传递(非专利文献 3 ；Pharmacology & Therapeutics 103，21 (2004))。有关 GPR49 的配体尚未确定，但有报道 称与果蝇(Drosophila)近缘的LGR、即DLGR2的配体是包含作为BMP拮抗剂的家族分子 的Burs、Pburs (Bur的配偶体)的Bursicon，所以尚未明确配体的LGR4、LGR5 (GPR49)、LGR6 的配体也是BMP拮抗剂(非专利文献4、非专利文献幻。关于GPR49分子的功能，根据敲除 小鼠的分析，暗示其与舌粘连(ankylogenesis)有关(非专利文献幻。另外，根据毛囊干细 胞的基因表达分析，还推测其参与干细胞的增殖(非专利文献6)。有关GPR49分子与癌症的关系，山本等人报道了 GPR49在肝细胞癌患者中高度表 达(非专利文献7)，特别是在具有连环蛋白突变的患者中，GPR49在mRNA水平的表达 亢进。此外，伊藤等人根据Affymetrix公司的Genechip数据分析，列举GPR49作为在胃癌 患者中高度表达的分子之一(专利文献1)。有报道称GPR49在大肠癌、卵巢癌中表达亢进，在大肠癌中有64% (25/39)的患 者可见mRNA水平的表达亢进，而在卵巢癌中有53% (18/33)的患者可见mRNA水平的表达 亢进(非专利文献8)。有报道称在使用PoAb的免疫染色中，GPR49在正常组织中的胎盘、 骨骼肌中表达(非专利文献8)。有关GPR49与癌化的关系，根据细胞灶形成试验，在只进行 了基因导入的NIH3T3中4周没有细胞灶形成，而在添加有培养SW620的培养上清(条件培 养基)的细胞中3周内可见细胞灶形成。由此设想发生了依赖于配体的癌化。在siRNA实 验中，可见subGl细胞的蓄积，发生了凋亡。这暗示GPR49在大肠癌细胞中具有阻碍凋亡 诱导的功能。但是，还有报道称基于癌细胞株的表达，虽然GPR49在大肠癌、卵巢癌、神经胶质 瘤、黑色素瘤中表达亢进，但在乳癌、肺癌中未见其表达亢进(非专利文献8)。专利文献1 :W02000071710非专利文献1 :Mol. Endocrinology 12，1830 (1998)非专利文献2 Journal of Endocrinology 187,333(2005)
4
非专利文献3 :Pharmacology & Therapeutics 103,21(2004)非专利文献4:PNAS 102,2820(2005)非专利文献5 :Molecular and Cellular Biology, 24,9736 (2004)非专利文献6 :Nature Biotechnology 22,411(2004)非专利文献7 :H印atology 37,528(2003)非专利文献 8 =Cancer Biology & Therapy 5,419(2006)

发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供诊断癌症的新方法、治疗癌症的新方法、新的细胞增殖抑 制剂和抗癌药。解决课题的方法本发明人等发现在胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质 瘤等的癌细胞中，不仅GPR49的基因、就连GPR49的蛋白也高度表达。另外，本发明人等制 成了抗GPR49蛋白的单克隆抗体，并首次发现将具有IOOkDa的分子量的GPR49蛋白切断， 分成60kDa和40kDa的片段。由于N末端侧的60kDa的片段被切断后分泌到细胞外，所以 其作为癌症诊断用标志物是有用的。另外，认为C末端侧的40kDa的片段作为治疗用抗体 的靶是有用的。并且，本发明人等在测定抗GPR49抗体的补体依赖性细胞毒 (complement-dependent cytotoxicity ；CDC)活性以及抗体依赖性细胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ；ADCC)活性时，发现抗 GPR49 抗体 对GPR49表达细胞具有⑶C活性和ADCC活性。进一步发现利用结合有毒素的抗体，引起 GPR49表达细胞的细胞毒的活性。根据上述认识，本发明人等发现抗GPR49抗体对原发性 或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效，从而完成了本发明。更具体而言，本发明人 等发现GPR49可用作用于治疗或诊断以胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤 和神经胶质瘤为代表的GPR49表达亢进的癌症的手段，从而完成了本发明。S卩，本发明提供与GPR49蛋白结合的抗体。本发明还提供与GPR49蛋白结合、且对 表达GPR49蛋白的细胞具有细胞毒活性的抗体。优选该细胞毒活性为ADCC活性。还优选 该细胞毒活性为CDC活性。本发明又提供结合有细胞毒性物质的抗体。本发明还提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明 还提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂。本发明又提供含有 与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的抗癌药。或者，本发明提供含有与GPR49蛋白结合的抗体和药学上可接受的载体的药物组 合物。更具体而言，本发明提供下述[1] [21]。[1]抗体，该抗体与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑 制活性。[2] [1]所述的抗体，其中细胞增殖抑制活性为细胞毒活性。[3] [2]所述的抗体，其中细胞毒活性为抗体依赖性细胞毒活性。[4] [2]所述的抗体，其中细胞毒活性为补体依赖性细胞毒活性。
[5] [1] [4]中任一项所述的抗体，该抗体结合有细胞毒性物质。[6] [5]所述的抗体，该抗体具有内化活性。[7] [1] [6]中任一项所述的抗体，该抗体抑制癌细胞的增殖。[8] [7]所述的抗体，其中癌细胞为胃癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、卵 巢癌细胞和神经胶质瘤细胞中的任一种。[9]以下(1) 00)中任一项所述的抗体(1)抗体QJ18-1N)，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQ ID N0:5记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 6记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 7记载的氨基酸序列；(2)抗体OJ18-1N)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 10 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO=Il记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 12记载的氨基酸序列；(3)抗体，该抗体含有⑴所述的H链和⑵所述的L链；(4)抗体QU1E-1)，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQ ID NO 15记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 16记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 17记载的氨基酸序列；(5)抗体QU1E-1)，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQ ID NO 20记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 21记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 22记载的氨基酸序列；(6)抗体，该抗体含有⑷所述的H链和(5)所述的L链；(7)抗体QU2E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 25记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 26记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 27记载的氨基酸序列；(8)抗体QU2E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 30记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 31记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 32记载的氨基酸序列；(9)抗体，该抗体含有(7)所述的H链和⑶所述的L链；(10)抗体QL13-3)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 35 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 36记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 37记载的氨基酸序列；(11)抗体QL13-3)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 40 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 41记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 42记载的氨基酸序列；(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(11)所述的L链；(13)抗体(2L36-12)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 45 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 46记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 47记载的氨基酸序列；(14)抗体(2L36-12)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 50 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 51记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQID NO 52记载的氨基酸序列；(15)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(14)所述的L链；(16)抗体(2T15E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 66 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 67记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 68记载的氨基酸序列；(17)抗体(2T15E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 71 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 72记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 73记载的氨基酸序列；(18)抗体，该抗体含有(16)所述的H链和(17)所述的L链；(19)抗体，该抗体是在⑴ (18)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被 取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1) (18)中任一项所述的抗体具 有同等活性；(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1) (18)中任一项所述的抗体所结 合的GPR49蛋白的表位相同。[10] [1] [9]中任一项所述的抗体，该抗体具有人恒定区。[11] [10]所述的抗体，该抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。[12]药物组合物，其中含有[1] [11]中任一项所述的抗体作为有效成分。[13]细胞增殖抑制剂，其中含有[1] [11]中任一项所述的抗体作为有效成分。[14]抗癌药，其中含有[1] [11]中任一项所述的抗体作为有效成分。[15] [14]所述的抗癌药，其中，癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、 尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。[16]癌症的诊断方法，其特征在于检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因。[17] [16]所述的诊断方法，其特征在于检测GPR49蛋白。[18] [17]所述的诊断方法，其中GPR49蛋白的检测使用与GPR49蛋白结合的抗体 来进行。[19]癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤(a)提供从受试者采集的试样的步骤；(b)使用与GPR49蛋白结合的抗体检测(a)的试样中所含的GPR49蛋白的步骤。[20]癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤(a)将与GPR49蛋白具有结合活性、且用放射性同位素标记的抗体给予受试者的 步骤；(b)检测上述放射性同位素的累积的步骤。[21] [16] [20]中任一项所述的诊断方法，其中癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细 胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤中的任一种癌。本发明还提供下述[22] [24]。[22]抑制细胞增殖的方法，该方法使用[1] [11]中任一项所述的抗体。[23]癌症的治疗或预防方法，该方法包括给予[1] [11]中任一项所述的抗体的步骤。[24] [1] [11]中任一项所述的抗体在制造细胞增殖抑制剂或抗癌药中的应用。
发明效果本发明的抗GPR49抗体对GPR49表达细胞具有补体依赖性细胞毒活性以及抗体依 赖性细胞毒活性，并且，结合有毒素的抗体还具有引起GPR49表达细胞的细胞毒的活性，所 以对原发性或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效。


图1显示人GPR49在正常组织中的表达分布图。下面的值表示通过外显子芯片 (Exon Array)分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。图2显示人GPR49在胃癌细胞株和胃癌摘出组织的肿瘤部位的表达分布图。下面 的值表示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。图3显示人GPR49在尤文肉瘤、小细胞肺癌、肺腺癌摘出组织的肿瘤部位的表达分 布图。下面的值显示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。图4显示人GPR49在卵巢癌细胞株和卵巢癌摘出组织的肿瘤部位的表达分布图。 下面的值显示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。图5是利用单克隆抗体2U2E-2检测被诱导表达的GPR49的照片。照片显示抗体 特异性识别通过添加IyLUOyL Dox (多西环素)而诱导的GPR49，并识别与利用抗HA标 签抗体检测附加在N末端的HA标签所得的谱带相同的谱带。图6是用单克隆抗体2U1E-1、2U2E_2检测GPR49蛋白的照片，所述GPR49蛋白存 在于用GPR49siRNA转染GPR49强制表达DG44细胞以及大肠癌细胞株LoVo而得到的细胞 破碎液中。在导入有siRNA 507、508、509的细胞中，GPR49的表达被抑制。(_)表示未导入 siRNA的细胞，“con”表示导入有对照siRNA的细胞。除IOOkDa的谱带以外，2U1E-1中用 箭头显示的40kDa的谱带、2U2E-2中用箭头显示的60kDa的谱带也均消失，所以这些谱带均 来自Gra49。图7是将2B10(HA-GPR49表达DG44细胞)的细胞破碎液免疫沉淀后用单克 隆抗体检测GPR49而得到的照片。在2U1E-1中检测到IOOkDa和40kDa的谱带，在 2U2E-2中检测到IOOkDa和60kDa的GPR49的谱带。使用HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体 (JacksonImmunoResearch Laboratories 公司制备)作为二次抗体。图8是将2B10 (HA-GPR49表达DG44细胞)的细胞破碎液免疫沉淀后用单克隆抗 体检测GPR49而得到的照片。在2L系列的抗体中均检测到60kDa的GPR49的谱带。为了 区别来自用于免疫沉淀的抗体的H链的谱带和60kDa的GPR49的谱带，使用HRP标记抗小 鼠κ抗体(Southern Biotech公司制备)作为二次抗体。图9是通过使用单克隆抗体的WB检测各种癌细胞株的细胞破碎液的照片。照 片中的泳道表示样品名称，分别表示大肠癌细胞株LoVo、胃癌细胞株NUGC-4、肝细胞癌株 Alexander、肝细胞癌株H印G2、肝细胞癌株Huh6、卵巢癌细胞株KURAM0CHI、卵巢癌细胞株 0VSAH0、神经胶质瘤U251、中国仓鼠卵巢细胞DG44、HA-GPR49表达DG44细胞株2B10。图10是显示GPR49抗体的⑶C活性的图。图11是显示GPR49抗体对HA-GPR49表达DG44细胞的ADCC活性的图。图12是显示使用了 Mab-Zap的抗体的内化所产生的细胞杀伤活性的图。3根棒图 显示通过WST8分析测定活细胞的比例的结果，其中，左在GPR49诱导表达293细胞株B4的非诱导细胞中加入有抗体和Mab-Zap的样品；中在GPR49表达诱导细胞中加入有抗体 和Mab-Zap的样品；右在GPR49表达诱导细胞中只加入抗体的样品。图13是显示GPR49的结构和缺失突变体、GST融合蛋白中所含的区的图。图14是显示2U1E-1、2T15E_2与GST融合蛋白通过WB的反应性的照片。图15是显示抗小鼠GPR49单克隆抗体2U1E_1、2U2E_2通过WB的反应性的照片。 均与人(H)和小鼠(M)的GPR49反应。图16是显示利用FACS (流式细胞术)评价结合活性的结果的图。实线显示的峰 表示与癌细胞株的反应性，阴影部分表示在没有抗体的情况下反应时的峰。横轴显示利用 结合有FITC的抗体的结合度测定的信号的强度，纵轴显示细胞数。
具体实施例方式GPR49GPR49是7次跨膜型的LGR家族成员的蛋白。人GPR49的氨基酸序列和编码该序 列的基因序列分别公开在NCBI检索号NP_003658. 1(SEQ ID NO :1)和NM_003667. 2 (SEQ ID NO : 2)中。在本发明中，GPR49蛋白的含义包括全长蛋白及其片段两者。片段是指含有GPR49 蛋白的任意区域的多肽，可以不具有天然GPR49蛋白的功能。片段的例子有包括GPR49蛋 白的胞外区的片段。GPR49蛋白的胞外区在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中相当于第1-556 位、第615-637位、第704-722位、以及第792-800位。跨膜区在SEQ ID NO=I的氨基酸序 列中相当于第557-579位、第592-614位、第638-660位、第681-703位、第723-745位、第 769-791 位、以及第 801-823 位。抗GPR49抗体的制作本发明中使用的抗GPR49抗体只要与GPR49蛋白结合即可，不限定其来源、种类、 形状等。具体可以使用非人动物的抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、人抗体、嵌 合抗体、人源化抗体等公知的抗体。本发明中，可以使用单克隆抗体或多克隆抗体作为抗 体，但优选为单克隆抗体。抗体与GPR49蛋白的结合优选为特异性结合。本发明中使用的抗GPR49抗体，可以利用公知的方法，以多克隆或单克隆抗体的 形式获得。本发明中使用的抗GPR49抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳 动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的单克隆抗体；以及利用基因工程的方法，由用含 有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体等。产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制备。首先，使用GPR49 蛋白作为致敏抗原，按照常规的免疫方法对其进行免疫。按照常规的细胞融合法使由免疫 动物得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，得到杂交瘤。再利用通常的筛选法，从该杂交 瘤中筛选产生目标抗体的细胞，从而可以选择产生抗GPR49抗体的杂交瘤。具体而言，单克隆抗体的制备可如下进行。首先，通过表达GPR49基因，可以获 得用作取得抗体的致敏抗原的GPR49蛋白。GPR49基因的核苷酸序列公开在NCBI检索号 NM_003667. 2 (SEQ ID NO :2)等中。即，将编码GPR49的基因序列插入公知的表达载体中， 转化适当的宿主细胞，之后按照公知的方法，可以从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标 人GPR49蛋白。纯化的天然GPR49蛋白也可同样使用。另外，象本发明所使用的那样，还可 以利用使GPR49蛋白的所需的部分多肽与不同的多肽融合的融合蛋白作为免疫原。为了制造作为免疫原的融合蛋白，例如可以利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体 可如下制作通过使所需的编码两种或两种以上多肽片段的基因进行符合读框的融合，将 该融合基因插入表达载体中来制作。融合蛋白的制作方法例如记载在Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook，J 等人，Molecular Cloning 2nd ed. , 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)中。如此操作而纯化的GPR49蛋白可以用作用于对哺乳动物进行免疫的致敏抗原。 GPR49的部分肽也可用作致敏抗原。例如，可以以下述肽作为致敏抗原。根据人GPR49的氨基酸序列通过化学合成获得的肽；将GPR49基因的一部分整合到表达载体中，使其表达而获得的肽；利用蛋白分解酶分解GPR49蛋白而获得的肽。对用作部分肽的GPR49的区域和大小没有限定。优选的区域可以从构成GPR49 的胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO :1的氨基酸序列中第1-556位、第615-637位、第 704-722位、以及第792-800位)中选择。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸数目优选为至少 3以上、例如5以上或6以上。更具体而言，可以以8 50、优选10 30个残基的肽作为 致敏抗原。对用该致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定。为了利用细胞融合法得到单克隆 抗体，优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来选择免疫动物。通常作为免疫动物， 优选啮齿类动物。具体可以以小鼠、大鼠、仓鼠或兔作为免疫动物。此外，猴等也可作为免 疫动物。可以按照公知的方法，利用致敏抗原免疫上述动物。例如常规方法为通过腹腔 内或皮下注射致敏抗原，可以对哺乳动物实施免疫。具体而言，每4 21天对哺乳动物多 次给予该致敏抗原。致敏抗原用PBS (磷酸缓冲盐)或生理盐水等按适当的稀释倍率稀释 后用于免疫。并且，可以将致敏抗原与佐剂一同给药。例如，可以将致敏抗原与弗氏完全佐 剂混合、乳化，作为致敏抗原。另外，用致敏抗原进行免疫时可使用适当的载体。特别是使 用分子量小的部分肽作为致敏抗原时，优选将该致敏抗原肽与白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白 (keyhole limpethemocyanin)等载体蛋白结合后进行免疫。另一方面，单克隆抗体还可以通过DNA免疫(DNA Immunization)而获得。所谓DNA 免疫，是指将在免疫动物中以编码抗原蛋白的基因能够表达的方式构建的载体DNA给予该 免疫动物，使免疫抗原在免疫动物体内表达，从而赋予免疫刺激的方法。与给予蛋白抗原的 普通免疫方法相比，在DNA免疫中有望获得下述优势。-可以维持GPR49这样的膜蛋白结构不变而赋予免疫刺激-不必纯化免疫抗原但另一方面，在DNA免疫中难以与佐剂等免疫刺激手段组合。由于GPR49具有7次 跨膜型立体结构这样的结构特征，所以预料难以在体内保持天然存在的结构不变的情况下 引发免疫反应。与由于这样的结构特征而难以获得抗体的、属于LGR家族的蛋白GPR49结 合的单克隆抗体通过DNA免疫而实际获得，这是出乎意料的成果。通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体时，首先，对免疫动物给予表达GPR49蛋白 的DNA。编码GPR49的DNA可以通过PCR等公知方法来合成。将得到的DNA插入适当的表 达载体中，之后给予免疫动物。作为表达载体，例如可以使用pcDNA3. 1等市售的表达载体。对生物体给予载体的方法也可采用通常使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒通 过基因枪(gene gun)打入细胞内，从而可以进行DNA免疫。根据本发明人等的经验，由通过向腹腔内给予GPR49强制表达细胞来进行免疫的 小鼠无法高效率地得到产生GPR49结合性抗体的杂交瘤，相对于此，由利用DNA免疫来进行 免疫的小鼠可以高效率地获得产生GPR49结合性抗体的杂交瘤。特别是在DNA免疫后进一 步给予了 GPR49强制表达细胞的小鼠中，可以容易地获得目标杂交瘤。即，在DNA免疫后利 用GPR49表达细胞来进行追加免疫(boost)，这是获得本发明的单克隆抗体的优选方法。如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体量升高后，从哺乳动物采集免 疫细胞用于细胞融合。特别优选使用脾细胞作为免疫细胞。与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。优选骨髓瘤细胞具备用 于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指，可以(或者不可以)在特定的培养条件下 生存的特性。选择标志物中，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(以下简记为HGPRT 缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下简记为TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺 陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下简记为HAT感受性)。HAT感受性 的细胞在HAT选择培养基中无法进行DNA合成而死亡，但与正常细胞融合时，利用正常细胞 的补救途径可以继续进行DNA的合成，所以在HAT选择培养基中也能够增殖。HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞，各自可以在含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下 简记为8AG)或5’ -溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄 入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的细胞由于不摄入上述嘧啶类似物，所以可以在选择培 养基中生存。此外，被称作G418耐性的选择标志物由于新霉素耐性基因，提供对2-脱氧链 霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。例 如，制造本发明的单克隆抗体时可以使用下述骨髓瘤细胞。P3(P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123,1548-1550)；P3x63Ag8U. 1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)；NS-I (Kohler. G.和 MiIstein，C. Eur. J. Immunol. (1976)6,511-519)；MPC-Il (Margulies.D. H.等人，Cell (1976) 8，405-415)；SP2/0(Shulman, M.等人，Nature (1978) 276，269-270)；FO (de St. Groth, S. F.等人，J. Immunol. Methods (1980) 35，1-21)；S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)；R210(Galfre, G.等人，Nature (1979) 277，131-133)等基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler. G.和 Milstein, C. ,Methods Enzymo 1. (1981) 73，3-46)等，进行免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融
口 O更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中，可以实施 上述细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。为了进一步 提高融合效率，根据需要，还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选相对于骨髓瘤细胞， 使免疫细胞为1 10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可以使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且，可以 在培养液中添加胎牛血清(FCQ等血清补液。细胞融合可如下形成将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充 分混合，再混合预先加热至37°C左右的PEG溶液，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。在细 胞融合法中，通常可以以30 60% (w/v)的浓度添加例如平均分子量为1000 6000左右 的PEG。接着，依次添加上述例举的适当培养液，离心以除去上清，通过重复该操作，可除去 不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。如此操作而得到的杂交瘤，可以通过使用选择培养液而进行选择，所述选择培养 液对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞， 可通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。 即，将HAT感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，在HAT培养液中，成功地与正常细胞进行 细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡， 使用上述HAT培养液继续培养足够的时间。具体而言，通常通过培养数天至数周，可以选择 目标杂交瘤。接着，通过实施常规的极限稀释法，可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和 单克隆。或者，还可以按照国际公开W003/104453中所述的方法制备识别GPR49的抗体。目标抗体的筛选和单克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来实 施。例如，使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等载体结合，再与杂 交瘤的培养上清反应。然后清洗载体，之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中 含有与致敏抗原反应的目标抗体时，二次抗体经由该抗体与载体结合。最终，通过检测与载 体结合的二次抗体，可以确定培养上清中是否存在目的抗体。利用极限稀释法等可以克隆 能与抗原结合的产生所需抗体的杂交瘤。此时，抗原不仅可以使用用于免疫的抗原，还可以 适当使用实质上为相同性质的GPR49蛋白。例如，可以使用表达GPR49的细胞株、GPR49的 胞外结构域、或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外，对人淋巴细 胞进行抗原致敏，也可得到目标抗体。具体而言，首先，在体外用GPR49蛋白致敏人淋巴细 胞。然后，使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来 自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞(参照日本特公平1-59878号公报)。通过该方法 得到的抗GPR49抗体是与GPR49蛋白具有结合活性的人抗体。并且，通过对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物给予作为抗原 的GPR49蛋白、或者用按照在该动物中表达GPR49的方式构建的DNA进行免疫，也可得到 抗GPR49抗体。免疫动物的抗体产生细胞通过与适当的融合配偶体进行细胞融合、或者通 过EB病毒感染等处理，可以使之无限增殖。可以从如此操作而得到的无限增殖细胞中分 离抗GPR49蛋白的人抗体(参照国际公开WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602) 0并且，通过克隆无限增殖的细胞，也可以克隆产生具有目标反应特异性的抗体 的细胞。以转基因动物作为免疫动物时，该动物的免疫系统将人GPR49识别为异物。因此， 可以容易地得到抗人GPR49的人抗体。如此操作而制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在常规培养液中继代培养。还可以 在液氮中长期保存该杂交瘤。按照常规方法培养该杂交瘤，从其培养上清中可以获得目标单克隆抗体。或者，还可以将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物以使其增殖，以其腹水的形式获得单克隆抗 体。前一种方法适合获得高纯度的抗体。本发明中，还可以利用由抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。将克隆的 抗体基因整合到适当的载体中，再导入宿主中，从而可以以抗体的形式表达。用于抗体基因 的分离、载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经确立(例如参照Vandamme，A.M.等 人·，Eur. J. Biochem. (1990) 192，767 775)。例如，可以从产生抗GPR49抗体的杂交瘤细胞中得到编码抗GPR49抗体的可变区 (V区)的cDNA。因此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方 法，例如可以采用以下方法。胍超离心法(Chirgwin,J.Μ.等人·，Biochemistry (1979) 18，5294 5299) ；AGPC 法(Chomczynski, P.等人.，Anal. Biochem. (1987) 162，156 159)。所提取的mRNA可以用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBio-Sciences制备)等进 行纯化。或者，象QuickPr印mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences制备)等那 样，用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒也有市售。使用这种试剂盒，也可以从杂交瘤 中得到总mRNA。可以使用逆转录酶，由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。可以使用从与 小鼠的抗体基因共通的序列中选出的任意15-30个碱基的序列作为引物。具体而言，通过 使用具有SEQ ID NO 61 63所示的DNA序列的引物，得到编码抗体V区的cDNA。cDNA可 以通过 AMV 逆转录酶第一链 cDNA 合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化学工业公司制备)等来合成。为了进行cDNA的合成和扩 增，可以采用5，-Ampli FINDERRACE试剂盒(Clontech制备)和使用PCR的5，-RACE法 (Frohman,M. Α.等人.，Proc. Natl. Acid. ki. USA(1988)85，8998 9002、Belyavsky，A.等 人.，Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919 四32)。并且，在上述cDNA的合成过程中，可 以向cDNA的两个末端导入后述的适当的限制酶切位点。由所得的PCR产物纯化目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如上制备重组载体， 将其导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所需的重组载体。 而且，cDNA的核苷酸序列可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。此外，为了得到编码抗体可变区的基因，还可以利用cDNA引物。首先，以从抗体产 生细胞中提取的mRNA为模板合成cDNA，得到cDNA文库。在cDNA文库的合成中，使用市售 的试剂盒是便利的。实际上，由于仅由少数细胞得到的mRNA极其微量，所以若将其直接纯 化则收率低。因此，通常是添加已明确不含抗体基因的载体RNA后再纯化。或者，在可以提 取一定量的RNA时，即使仅是抗体产生细胞的RNA，也可以高效率地提取。例如从10以上、 或30以上、优选50以上的抗体产生细胞中提取RNA时，有时不必添加载体RNA。已所得cDNA文库为模板，利用PCR法扩增抗体基因。用于通过PCR法扩增抗体基 因的引物是公知的。例如，可以根据论文(J. Mol. Biol. (1991)222,581-597)等公开的内 容，设计人抗体基因扩增用的引物。这些引物在每一免疫球蛋白的亚类都形成不同的核苷 酸序列。因此，以亚类不明确的cDNA文库为模板时，考虑所有可能性后再进行PCR法。具体而言，例如为了取得编码人IgG的基因时，可以使用可扩增编码作为重链的 Yl Y 5、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’ 侧的引物中使用在相当于铰链区的部分退火的引物。而5’侧的引物中可以使用对应于各亚类的引物。将由重链和轻链的各亚类的基因扩增用引物得到的PCR产物制成各自独立的文 库。利用如此合成的文库，可以重构包含重链与轻链的组合的免疫球蛋白。以重构的免疫 球蛋白与GPR49的结合活性为指标，可以筛选目标抗体。例如，为了获取抗GPR49抗体时，进一步优选抗体与GPR49的结合为特异性的。与 GPR49结合的抗体例如可以如下筛选。(1)使抗体与GPR49接触的步骤，所述抗体含有由所得的cDNA编码的V区；(2)检测GPR49与抗体的结合的步骤；以及(3)选择与GPR49结合的抗体的步骤。检测抗体与GPR49的结合的方法是公知的。具体而言，使被检抗体与固定在载体 上的GPR49反应，接下来使之与识别抗体的标记抗体反应。清洗后检测出载体上的标记抗 体时，可以证明该被检抗体与GPR49结合。标记中可以使用过氧化物酶或β-半乳糖苷酶 等酶活性蛋白、或FITC等荧光物质。为了评价抗体的结合活性，还可以使用表达GPR49的 细胞的固定标本。作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可采用利用了噬菌体载体的淘选 法。按上述方式获取抗体基因作为重链和轻链的亚类的文库时，利用噬菌体载体的筛选法 是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因通过以适当的接头序列连接，可以形成单链 Fv(SCFV)。将编码scFv的基因插入噬菌体载体中时，可以得到在表面表达scFv的噬菌体。 使该噬菌体与目标抗原接触，回收与抗原结合的噬菌体时，可以回收编码具有目标结合活 性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，可以浓缩具有目标结合活性的scFv。本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长、或者可以编码抗体的一部 分。抗体的一部分是指抗体分子的任意部分。以下，作为表示抗体的一部分的用语，有时 使用抗体片段。本发明中优选的抗体片段包括抗体的互补链决定区(complementarity determinationregion ；⑶R)。进一步优选本发明的抗体片段包括构成可变区的全部的3个 CDR。获得编码目标抗GPR49抗体V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA的两个末端 的限制酶切位点的限制酶消化该cDNA。优选的限制酶识别、消化在构成抗体基因的核苷酸 序列中出现的可能性低的核苷酸序列。为了进一步将单拷贝的消化片段按正确方向插入载 体中，优选提供粘性末端的限制酶。通过将上述被消化的编码抗GPR49抗体V区的cDNA插 入适当的表达载体中，可以得到抗体表达载体。此时，通过使编码抗体恒定区(C区)的基 因与编码上述V区的基因进行符合读框的融合，可以得到嵌合抗体。此处的嵌合抗体是指 恒定区和可变区的来源不同。因此，除小鼠-人等的异种嵌合抗体外，人-人同种嵌合抗体 也包括在本发明的嵌合抗体中。预先将上述V区基因插入整合有编码恒定区的DNA的表达 载体中，也可构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如在保持有编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧， 可以预先配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。用相同组合的限制酶消化两 者，使之进行符合读框的融合，从而构建嵌合抗体表达载体。为了制备本发明中使用的抗GPR49抗体，可以将抗体基因整合到表达载体中，使 在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区例如包括增强子和启动子。接着，使用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗GPR49抗体的DNA的重组 细胞。表达抗体基因时，可以将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别整合到 另一表达载体中。将整合有H链和L链的载体同时转化(共转染，co-transfect)到相同 的宿主细胞中，从而可以使具备H链和L链的抗体分子表达。或者，可以将编码H链和L链 的DNA整合到单一的表达载体中，来转化宿主细胞(参照国际公开WO 94/11523)。用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中以制备抗体的宿主与表达载体的多个 组合是公知的。这些表达系统均可应用于本发明。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动 物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，可用于本发明的动物细胞可以例示下述细胞(1)哺乳类细胞:010、0)5、骨髓瘤、8服(幼仓鼠肾)、拖13、￥61~0、昍1(293、83/^3、 HL-60、Jurkat、SK-HEPl 等；(2)两栖类细胞非洲爪蟾卵细胞等；以及(3)昆虫细胞sf9、sf21、Tn5 等。或者，作为植物细胞，来自烟草(Nicotiana tabacum)等烟草属(Nicotiana)的细 胞产生的抗体基因的表达系统是公知的。在植物细胞的转化中，可以使用进行了愈伤组织 培养的细胞。并且，作为真菌细胞，可以使用下述细胞。## IISSI# (Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces) Μ、甲酉享 营养型酵母(Pichia pastoris，巴斯德毕赤酵母)等毕赤酵母(Pichia)属；丝状菌黑曲霉(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)属。或者，使用原核细胞的抗体基因的表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时， 可以将大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌等细菌细胞用于本发明。使用哺乳类细胞时，可以使polyA信号与常用的有效启动子、要表达的抗体基因、 其3’侧下游进行功能性结合来表达。例如，启动子/增强子可以是人巨细胞病毒早期启动 子/增强子。此外，可以将病毒启动子/增强子、或人延伸因子la (HEFla)等来自哺乳类细胞 的启动子/增强子等用于抗体表达。作为可以利用启动子/增强子的病毒，具体可以例示 逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。使用SV40启动子/增强子时，可以采用Mulligan等人的方法(Nature (1979) 277， 108)。另外，利用 Mizushima 等人的方法(NucleicAcids Res. (1990) 18，5322)，可以容易地 将HEFl α启动子/增强子用于目标基因的表达。当为大肠杆菌时，使常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗 体基因功能性连接，可以表达该基因。启动子例如有IacZ启动子、araB启动子。使用IacZ 启动子时，可以采用 Ward 等人的方法(Nature (1989) ；341，544 M6 ；FASEBJ. (1992)6， 2422 2427)。或者，利用 Better 等人的方法(Science (1988) 240,1041 1043)，可以将 araB启动子用于目标基因的表达。用于抗体分泌的信号序列在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pel B信号序列 (Lei, S. P.等人，J.Bacteriol. (1987) 169,4379)。接着，分离在周质中产生的抗体，之后通 过使用尿素的胍盐酸盐这样的蛋白改性剂，可重折叠抗体的结构，使其具有所需的结合活性。使用动物细胞来产生抗体时，作为用于向细胞外分泌所必需的信号序列，优选使 用抗体的重链基因或轻链基因的信号序列。此外，还可以使用IL-3或IL-6等的分泌蛋白 所具有的信号序列。插入到表达载体中的复制起点可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病 毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，可以向表达载体中 插入选择标志物。具体可以使用下述选择标志物氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因；胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因；大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因；二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。将这些表达载体导入宿主细胞中，接下来，将转化的宿主细胞在体外或体内进行 培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养可以按照公知的方法进行。例如，培养液可以使用 DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。如上表达并产生的抗体，可以通过将常规蛋白质纯化中使用的公知方法单独使用 或适当组合来进行纯化。例如，可以通过适当选择并组合蛋白A柱等亲和柱、色谱柱、滤 器、超滤、盐析、透析等，来分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。另外，在重组型抗体的产生中，除了使用上述宿主细胞外，还可以使用转基因动 物。即，将编码目标抗体的基因导入动物体内，可以由该动物得到该抗体。例如，通过将抗 体基因符合读框地插入到编码乳汁中特性产生的蛋白的基因内部，可以构建融合基因。作 为乳汁中所分泌的蛋白，例如可以使用山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基 因的DNA片段注入到山羊胚胎中，再将该注入胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生 出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，可以以与乳汁蛋白形成的融合 蛋白的形式获得所需抗体。另外，为了增加由转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量，可 以将激素适当用于转基因山羊(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology (1994) 12，699 702)。本发明的重组抗体的C区可以使用来自人以外的动物的抗体的C区。例如，小鼠 抗体的 H链 C 区可以使用 Cy 1、C γ 2a、C γ 2b、Cy 3、Cμ、CS、Cal、Ca2、Ce，L 链 C 区可 以使用Ck Χλ。另外，除小鼠以外的动物的抗体可以使用大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴等 的抗体。它们的序列是公知的。为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对C区进行修饰。本发明中，将抗体给予人时，为了降低对人的异种抗原性等，可以制成人工修饰的 基因重组型抗体。基因重组型抗体例如包括嵌合抗体、人源化抗体等。这些修饰抗体可以 采用公知的方法进行制备。嵌合抗体是指将来源互不相同的可变区和恒定区连接而成的抗体。例如，包含小 鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合 抗体。将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载 体中，从而可以制备表达嵌合抗体的重组载体。培养通过该载体转化的重组细胞，使整合的 DNA表达，从而可以获得培养中所产生的该嵌合抗体。在嵌合抗体和人源化抗体的C区使用 人抗体的C区。
例如，在H 链中，可以使用 Cy 1、Cy2、Cy3、Cy4、Cp、CS、Ca l、Ca 2和 C ε 作
为C区。在L链中，可以使用Ck和CX作为C区。上述C区的氨基酸序列以及编码该氨 基酸序列的核苷酸序列是公知的。为了改善抗体本身或抗体产生的稳定性，可以对人抗体 C区进行修饰。通常，嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。相 对于此，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补性决定区(CDR)和来自人抗体的构 架区(FR)、以及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此可用 作本发明的治疗药的有效成分。抗体可变区通常由夹在4个构架区(FR)中的3个互补性决定区(OTR)构成。⑶R 实质上是决定抗体的结合特异性的区。CDR的氨基酸序列富有多样性。一方面，构成FR的 氨基酸序列即使在具有不同结合特异性的抗体间往往也显示出高度同源性。因此，通常通 过移植CDR，可以将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠 抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的常规基因重 组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠序列延 伸PCR(0verlap Extension PCR)是公知的。在重叠序列延伸PCR中，将该移植的编码小鼠 抗体CDR的核苷酸序列附加在用于合成人抗体FR的引物上。分别准备4个FR的引物。通 常，向人FR中移植小鼠CDR时，选择与小鼠的FR同源性高的人FR，这对维持CDR的功能有 利。即，通常优选利用包含与该移植的小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸 序列的人FR。另外，被连接的核苷酸序列设计成彼此符合读框地进行连接。利用各自的引物分 别合成人FR。其结果，得到在各FR中附加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码 小鼠CDR的核苷酸序列设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠 ⑶R部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠⑶R序列进行连接。最终，连接有3个⑶R和4个FR的全长V区基因使用下述引物进行扩增，所述引 物为对其5’末端和3’末端退火且附加有适当的限制酶识别序列。将如上得到的DNA与编 码人抗体C区的DNA插入表达载体中，使符合读框地融合，从而可以制备人型抗体表达用载 体。将该载体导入宿主中，建立重组细胞，之后培养该重组细胞，使编码人源化抗体的DNA 表达，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧洲专利公开EP 239400、国 际公开 WO 96/02576)。通过定性或定量测定并评价如上制备的人源化抗体与抗原的结合活性，可以适当 选择经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，还可以置 换FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用用于向人 FR中移植小鼠CDR的PCR法，可以向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向对FR 退火的引物中导入一部分核苷酸序列的突变。利用这样的引物合成的FR中，导入了核苷酸 序列的突变。通过用上述方法测定并评价取代了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性， 可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato, K.等人，Cancer Res，1993，53，851 856)。另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞。接着，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合，从而可以获得与抗原具 有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。在作为融合配偶体的人骨髓瘤细胞 中，例如可以使用U266等。通过用所需抗原对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免 疫，可以获得所需的人抗体(参照国际公开W093/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585,WO 96/34096,WO 96/33735)。并且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗 体的技术。例如，利用噬菌体展示法，使人抗体的V区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面 表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与 抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序 列与所需人抗体C区序列进行符合读框的融合，之后插入适当的表达载体中，从而可以制 备表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表 达，从而可以获得该人抗体。这些方法已经公知(国际公开WO 92/01047.W0 92/2079UW0 93/06213, WO 93/11236,WO 93/19172, WO 95/01438,WO 95/15388)。因此，作为本发明中使用的抗体的优选方式之一，可以列举具有人恒定区的抗体。本发明的抗体，只要与GPR49蛋白结合即可，不仅包括IgG所代表的二价抗体，还 包括一价抗体或IgM所代表的多价抗体。本发明的多价抗体包括具有完全相同的抗原结 合部位的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明的抗体 并不限于抗体的全长分子，只要与GPR49蛋白结合即可，可以是小分子抗体或其修饰物。小分子抗体包括全长抗体(whole antibody，例如全长IgG等)的一部分缺失的抗 体片段。只要与GPR49抗原具有结合能力即可，允许抗体分子的部分缺失。本发明中的抗体 片段优选含有重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。此外，本发明中的抗体片段优选含 有⑶R。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加和/或插入。并且，只要与GPR49 抗原具有结合能力即可，可以缺失VH和/或VL的一部分。另外，可变区可以进行嵌合化或 人源化。抗体片段的具体例子例如有？油4油’4(油’)2工￥等。小分子抗体的具体例子 例如有Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv (单链 Fv)、双抗体、sc (Fv) 2 (单链(Fv) 2)等。这些 抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的小分子抗体中。抗体片段可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。作为生成抗体片 段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等是公知的。或者，构建编码这些抗 体片段的基因，将其导入表达载体中，之后可以在适当的宿主细胞中表达(例如 参照 Co，M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976、Better，M.和 Horwitz， Α. H. Methods in Enzymology (1989) 178，476—496、Plueckthun, Α.禾口 Skerra，A. Methods inEnzymology(1989) 178,476-496> Lamoyi, Ε. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663>Rousseaux, J. 入，Methods in Enzymology (1989) 121,663-669> Bird, R. E.等 人，TIBTECH(1991)9,132-137)。消化酶切断抗体片段的特定位置，给予下述特定结构的抗体片段。对上述酶解得 到的抗体片段应用基因工程方法时，可以使抗体的任意部分缺失。木瓜蛋白酶消化F (ab) 2或Fab胃蛋白酶消化F(ab，)2或Fab，纤溶酶消化Facb
因此，本发明中的小分子抗体只要与GPR49具有结合亲和性即可，可以是缺失了 任意区的抗体片段。并且，特别是在本发明的癌症等细胞增殖性疾病的治疗中，优选抗体维 持其效应子活性。即，本发明中优选的小分子抗体具有与GPR49的结合亲和性和效应子功 能两者。抗体的效应子功能包括ADCC活性和CDC活性。本发明中的治疗用抗体，特别优选 具有ADCC活性和/或⑶C活性作为效应子功能。双抗体(Diabody)是指通过基因融合构建的二价抗体片段(HolligerP等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444 6448 (1993) ；EP404, 097 号；W093/11161 号等)。双 抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常，构成二聚物的多肽链，各自在同一条链中VL和 VH通过接头进行结合。双抗体中的接头通常短至VL和VH无法相互结合。具体而言，构成 接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，编码在同一条多肽链上的VL和VH无法形 成单链可变区片段，而是与另一单链可变区片段形成二聚体。其结果，双抗体具有两个抗原 结合部位。ScFv可通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在scFv中，H链V区和L链V 区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acid. Sci. U. S. Α. 1988， 85，5879 5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以是来自本说明书中记载的任何抗体。 对连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用包含3 25个残基左右的任意单链肽 作为接头。具体而言，例如可以使用后述的肽接头等。两链的V区例如可以按照上述PCR法进行连接。为了利用PCR法连接V区，首先， 在下述DNA中，以编码全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作为模板编码抗体H链或H链V区的DNA序列；以及编码抗体L链或L链V区的DNA序列。编码H链和L链的V区的DNA分别利用PCR法进行扩增，所述PCR法使用具有与 应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。接着，准备编码肽接头部分的DNA。编 码肽接头的DNA也可利用PCR来合成。在此时使用的引物的5’侧附加可与另外合成的各 V区的扩增产物连接的核苷酸序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区 DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5，侧退火的引物和在[L链V区DNA] 的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物是指可以扩增编码应合成的scFv的全长 序列的DNA的引物组。另一方面，[肽接头DNA]中附加有可与各V区DNA连接的核苷酸序 列。其结果，连接上述DNA，再利用装配PCR用引物，最终以扩增产物的形式生成scFv的全 长。暂且制作编码scFv的DNA，按照常规方法可以获取含有上述DNA的表达载体和通过该 表达载体转化的重组细胞。其结果，培养所得的重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，从而 可获得该scFv。scFv-Fc是使Fc区与包含抗体的H链V区和L链V区的scFv融合得到的小分子 抗体(Cellular & Molecular Immunology 2006 ；3 :439-443)。对 scFv-Fc 中使用的 scFv 的来源没有特别限定，例如可以使用来自IgM的scFv。此外，对Fc的来源也没有特别限定， 例如可以使用小鼠IgG2(小鼠IgG2a等)、人IgG(人IgGl等)。因此，作为scFv-Fc的优 选方式的例子，可以列举IgM抗体的scFv片段和小鼠IgGh的CH2 (例如C γ 2)和CH3 (例 如C γ 3)通过小鼠IgGh的铰链区(H y )连接而成的scFv-Fc、或IgM抗体的scFv片段和人IgGl的CH2和CH3通过人IgGl的铰链区连接而成的scFv-Fc。sc (Fv) 2是两个VH和两个VL通过接头等连接形成单链的小分子抗体(Hudson等 人，J Immunol. Methods 1999 ;231 177 189)。sc (Fv) 2 例如可以通过用接头连接 scFv 来制备。优选具有以下特征的抗体，所述特征为2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧 为基点，按照VH、VL、VH、VL ([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])的顺序排列。2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按照任何顺序进行排列。例 如包括以下排列[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]
[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]
[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]
[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]
[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接头、或化学合 成接头(例如参照ftOtein Engineering，9 (3)，299 305，1996)中公开的接头等。本发 明中优选肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。 通常，构成肽接头的氨基酸残基为1 100个氨基酸，优选3 50个氨基酸，进一步优选 5 30个氨基酸，特别优选为12 18个氨基酸(例如15个氨基酸)。构成肽接头的氨基酸序列，只要不阻碍scFv的结合作用即可，可以形成任意序 列。例如，当为肽接头时，可以使用下述氨基酸序列。krGly ·Ser
Gly ·Gly ·Ser
Ser ·Gly ·Gly
Gly ·Gly ·Gly ·Ser (SEQ ID NO 53)
Ser ·Gly ·Gly ·Gly (SEQ ID NO 54)
Gly ·Gly ·Gly ·Gly · Ser(SEQ ID NO 55)
Ser ·Gly ·Gly ·Gly · Gly(SEQ ID NO 56)
Gly ·Gly ·Gly ·Gly · Gly · Ser(SEQ ID NO 57)
Ser ·Gly ·Gly ·Gly · Gly · Gly(SEQ ID NO 58)
Gly ·Gly ·Gly ·Gly · Gly · Gly · Ser(SEQ ID NO
Ser ·Gly ·Gly ·Gly · Gly · Gly · Gly(SEQ ID NO
(Gly Gly Gly Gly · Ser(SEQ ID NO :53))η
(Ser Gly Gly Gly · Gly(SEQ ID NO :54))η
[η为1以上的整数]
关于肽接头的氨基酸序列，本领域技术人员可以根
述肽接头长度的η通常为1 5，优选1 3，更优选为1或2。因此，本发明中特别优选的sc(Fv)2的方式例如有以下sc(Fv)2。[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]-肽接头(15个氨基酸)-[VH]-肽接头(15个 氨基酸)_[VL]
或者，还可以利用化学合成接头(化学交联剂)来连接V区。本发明中可以使用通 常用于交联肽化合物等的交联剂。例如下述化学交联剂是公知的。这些交联剂均有销售。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)；双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)；二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)；二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)；双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)；双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)；二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)；二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)； 双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BS0C0EQ ；以及双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BS0C0EQ等。连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可 以使用不同的接头。本发明中，优选的小分子抗体为双抗体或sc(Fv)2。为了获得这样的 小分子抗体，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理抗体，生成抗体片段；或者构建编 码这些抗体片段的DNA，将其导入表达载体中，之后在适当的宿主细胞中表达即可(例如参 照 Co，M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ；Better, Μ.和 Horwitz，Α. H.，Methods Enzymo1. (1989) 178,476-496 ；Pluckthun,Α.禾口 Skerra，A.，Methods Enzymo1. (1989) 178， 497-515 ；Lamoyi,E. ,Methods Enzymo 1. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J.等人，Methods Enzymo 1. (1986) 121,663-669 ；Bird, R. Ε.和 Walker，B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9， 132-137)。本发明的抗体不仅包括一价抗体，还包括多价抗体。本发明的多价抗体包括具有 完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价 抗体。作为抗体修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。而且， 抗体上还可以结合化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质。上述抗体修饰物 (以下称为抗体缀合物)可以通过对所得抗体施行化学修饰而获得。尚需说明的是，抗体的 修饰方法在该领域中已经确立。如后所述，还可以以双特异性抗体(bispecificantibody) 等分子型的形式获取，所述双特异性抗体通过基因重组技术设计成不仅识别GPR49蛋白、 还识别化疗药物、毒性肽、放射性化学物质等细胞毒性物质的形式。本发明中的“抗体”也 包括这些抗体。与抗GPR49抗体结合、发挥细胞毒活性作用的化疗药物可以例示如下述化疗药 物阿扎立平、阿那曲唑、5-氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素-1、白 消安、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺钼、伊立替康、卡钼、克拉 屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、道诺霉素葡萄糖醛酸苷、柔红 霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司 汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉 西他滨、己酸羟孕酮、羟基尿、伊达比星、异环磷酰胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸 苯酯、泼尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、 丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春碱、长春瑞 滨、长春新碱。本发明中，优选的化疗药物为小分子化疗药物。小分子化疗药物与抗体结合后，其 干涉抗体功能的可能性也小。本发明中，小分子化疗药物通常具有100 2000、优选200 1000的分子量。此处例示的化疗药物均为小分子化疗药物。本发明中的这些化疗药物包括 在机体内转化成活性化疗药物的前体药物。前体药物的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。另外，还可以用毒性肽修饰抗体。毒性肽的例子有下述物质白喉毒素A链 (Langone J. J.,等人，Methods in Enzymology, 93，307—308，1983)、绿月农杆菌夕卜毒素 (Nature Medicine, 2，350-353,1996)、蓖麻毒蛋白 A 链(Fulton R. J.，等人，J. Biol. Chem. ,261,5314-5319,1986 ；SivamG.,等人，Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods, 135,15-24,1990 ；Wawrzynczak Ε. J.,等人，CancerRes., 50,7519-7562,1990 ；Gheeite V.，等人，J. Immunol. Methods，142，223-230，1991)、无糖链 蓖麻毒蛋白 A 链(Thorpe P. Ε.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思子毒素 A 链(ffawrzynczak E. J.，等人，Br. J. Cancer, 66, 361-366,1992 ；Wawrzynczak E. J.，等人， Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169—3173，1987 ； Thorpe P. Ε.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、多花白树毒蛋白(Sivam G.，等人， Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods，135，15-24， 1990 ；ffawrzynczak Ε· J.，等人，CancerRes.，50，7519-7562，1990 ；Bolognesi A.，等人， Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPs) (Bolognesi A.，等 人，Clin. exp. Immunol. , 89, 341-346,1992)、Briodin (Bolognesi Α.,等 Α Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)、皂草毒蛋白(Bolognesi A·，等人，Clin. exp. Immunol. ,89, 341-346，1992)、地肤子皂苷(Cumber A. J.，等人，J. Immunol. Methods, 135,15-24,1990 ； ffawrzynczak E. J.,等人，CancerRes. , 50, 7519-7562,1990 ；Bolognesi A.,等人，Clin, exp. Immunol.，89，341-346，1992)、木鳖根蛋白(Bolognesi Α.，等人，Clin. exp. Immunol.， 89,341-346,1992)、石竹素 32 (Bolognesi Α.，等人，Clin. exp. Immunol.，89，341-346， 1992)、石竹素 30(Stirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白 IKStirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、槲寄生凝集素 Gtirpe F.， Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白 I Gtirpe F. , Barbieri L.， FEBS letter 195，1-8，1986)、商陆毒蛋白(Stirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195， 1-8，1986)、小麦毒蛋白(Stirpe F. ,Barbieri L. ,FEBS letter 195，1-8，1986)、软瓜蛋白 (Stirpe F. ,Barbieri L. ,FEBS letter 195，1-8，1986)、栝楼素(Casellas P.，等人，Eur. J.Biochem. 176,581-588,1988 ；Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346， 1992)。在本发明中，放射性化学物质是指含有放射性同位素的化学物质。对放射性同位 素没有特别限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用32P、14C、125I、3H、131I、18f5Re、-Re 等。在另一方式中，将一种或两种以上的小分子化疗药物与毒性肽分别组合，可以用于修饰抗体。抗GPR49抗体与上述小分子化疗药物的结合可以使用共价键或非共价键。结合有这 些化疗药物的抗体的制作方法是公知的。并且，蛋白性药物或毒素可以通过基因工程方法与抗体结合。具体而言，例如使编 码上述毒性肽的DNA与编码抗GPR49抗体的DNA进行符合读框的融合并整合到表达载体 中，可以构建重组载体。将该载体导入适当的宿主细胞中，之后培养所得的转化细胞，使重 组的DNA表达，可以以融合蛋白的形式得到结合有毒性肽的抗GPR49抗体。得到与抗体的 融合蛋白时，通常将蛋白性药物或毒素配置在抗体的C末端侧。还可以使肽接头介于抗体 与蛋白性药物或毒素之间。并且，本发明的抗体可以是双特异性抗体(bispecific antibody)。双特异性抗体 是指，在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以 具有识别GPR49分子上的不同表位的抗原结合部位。这样的双特异性抗体相对于1分子的 GPR49可以结合2分子的抗体分子。其结果，有望获得更强效的细胞毒作用。或者，还可以形成其中一个抗原结合部位识别GPR49、另一个抗原结合部位识别细 胞毒性物质的双特异性抗体。细胞毒性物质具体包括化疗药物、毒性肽或放射性化学物质 等。这样的双特异性抗体与表达GPR49的细胞结合，同时捕获细胞毒性物质。其结果，可以 使细胞毒性物质直接作用于表达GPR49的细胞。即，利用识别细胞毒性物质的双特异性抗 体，可以特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。在本发明中，还可以组合识别GPR49以外的抗原的双特异性抗体。例如，可以组合 识别非GPR49抗原的双特异性抗体，所述非GPR49抗原与GPR49 —样在作为靶的癌细胞的 细胞表面特异性表达。用于制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，使识别不同抗原的两种抗体结合， 可以制作双特异性抗体。进行结合的抗体可以是各自具有H链和L链的1/2分子，也可以 是仅包含H链的1/4分子。或者，使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制备产生 双特异性抗体的融合细胞。并且，利用基因工程方法可以制备双特异性抗体。(Antibodies A Laboratory Manual. EdHarlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)时，可以采用公知的方法。例如可以使用 ELISA (酶联免疫吸附测定法)、EIA (酶免疫测定法)、RIA (放射免疫测定法)或荧光免疫 法等。本发明的抗体可以是糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链，可以增强抗 体的细胞毒活性。作为糖链被修饰的抗体，例如以下抗体是公知的。进行糖基化修饰的抗体(W099/54342等)；附加在糖链上的岩藻糖缺失的抗体(W000/61739、W002/31140等)；具有具等分GIcNAC的糖链的抗体(W002/79255等)等。抗体是否对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性，这可以利用本领域技 术人员所公知的方法来测定。例如，在对象抗体的存在下和不存在下(或阴性对照抗体存 在下)培养表达GRP49蛋白的细胞，并测定其活细胞数，从而可以进行测定。只要抑制细胞 的增殖即可，对抑制的比例没有特别限定，优选的例子有与对象抗体不存在下的活细胞数 相比，对象抗体存在下的活细胞数为90 %以下、70 %以下、50 %以下等。对表达GPR49蛋白 的细胞没有特别限定，可以列举用编码GPR49蛋白的基因转化的细胞、胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌和神经胶质瘤等。为了治疗目的而使用本发明的抗体时，抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。本发明中的细胞毒活性例如有抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体 依赖性细胞毒(CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指由补体系统产生的细胞毒活性。而 ADCC活性是指，特异性抗体附着于靶细胞的细胞表面抗原上时，保有Fc γ受体的细胞(免 疫细胞等)经由Fc γ受体与其Fc部位结合，给靶细胞带来伤害的活性。抗GPR49抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有⑶C活性，这可以利用公知的方 法进行测定(例如 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan 等人，John Wiley & Sons, Inc. , (1993)等)。具体而言，首先，制备效应细胞、补体溶液、靶细胞。(1)效应细胞的制备从CBA/N小鼠等中摘出脾脏，在RPMI1640培养基Gnvitrogen公司制备)中分离 脾细胞。用含有10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制备)的相同培养基清洗，之后将细胞 浓度调整至5 X IO6个细胞/mL，即可制备效应细胞。(2)补体溶液的制备将幼兔补体(BabyRabbit Complement) (CEDARLANE 公司制备)用含有 10% FBS 的培养基(Irwitrogen公司制备)稀释10倍，可以制备补体溶液。(3)靶细胞的制备将表达GPR49 蛋白的细胞与 0. 2mCi 的 51Cr-铬酸钠(GEHealthcare Bio-Sciences 公司制备)一起在含有10% FBS的DMEM培养基中、在37°C下培养1小时，从而可以放射 性标记该靶细胞。表达GPR49蛋白的细胞可以使用以编码GPR49蛋白的基因转化的细胞、 胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌和神经胶质瘤等。放射性标记后，将细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基清洗3次，将细胞浓度调整至2 X IO5个细胞/mL，从而可以制备该 靶细胞。ADCC活性或⑶C活性可以利用下述方法测定。测定ADCC活性时，在96孔U底板 (Becton Dickinson公司制造)中分别加入50 μ L靶细胞和抗GPR49抗体，在冰上反应15 分钟。之后，加入100 μ L效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或 10yg/mL。培养后，回收100 μ L上清，用γ射线计数仪(C0BRAIIAUT0-GAMMA，型号D5005， Packard Instrument Company公司制造)测定放射活性。细胞毒活性(％)可以使用所 得值、根据算式(A-C)/(B-C)X100来计算。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入了 1 % NP-40 (nacalai tesque公司制备)的试样的放射活性(cpm)，C表示只含靶细胞的试样 的放射活性(cpm)。另一方面，测定⑶C活性时，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分 别加入50 μ L靶细胞和抗GPR49抗体，在冰上反应15分钟。之后，加入100 μ L补体溶液， 在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或3yg/mL。培养后，回收IOOyL上 清，用Y射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。而当测定抗体缀合物的细胞毒活性时，向96孔平底板(BectonDickinson公司制 造)中分别加入50 μ L靶细胞和抗GPR49抗体缀合物，在冰上反应15分钟。在二氧化碳培 养箱内培养1 4小时。使抗体的终浓度达到0或3yg/mL。培养后，回收100 μ L上清，用Y射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。作为本发明 中使用的抗体的另一方式，可以列举具有内化活性的抗体。在本发明中，“具有内化活性的 抗体”是指，与细胞表面上的GPR49结合时被输送到细胞内(细胞质内、小泡内、其他小器官 内等)的抗体。抗体是否具有内化活性，这可以利用本领域技术人员所公知的方法来确认，例如 可以采用下述方法进行确认使结合有标记物质的抗GPR49抗体与表达GPR49的细胞接触， 之后确认该标记物质是否被摄入细胞内的方法；使结合有细胞毒性物质的抗GPR49抗体与 表达GPR49的细胞接触，之后确认是否诱导了该GPR49表达细胞的细胞死亡的方法等。更 具体而言，利用下述实施例中记载的方法等，可以确认抗体是否具有内化活性。具有内化活性的抗体，例如可以通过结合上述细胞毒性物质，以抗癌药等药物组 合物的形式使用。本发明的抗体可以使用识别GPR49的任意抗体。例如，优选的抗体可以例示以下 (1) 00)所述的抗体。这些抗体例如可以是全长抗体、小分子抗体、动物抗体、嵌合抗体、 人源化抗体或人抗体。(1)抗体(2J18-1N)，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQ ID N0:5记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 6记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID
NO 7记载的氨基酸序列。(2)抗体OJ18-1N)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 10 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO=Il记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO: 12记载的氨基酸序列。(3)抗体，该抗体含有⑴所述的H链和⑵所述的L链。(4)抗体QU1E-1)，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQ ID NO 15记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 16记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO: 17记载的氨基酸序列。(5)抗体QU1E-1)，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQ ID NO 20记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 21记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 22记载的氨基酸序列。(6)抗体，该抗体含有⑷所述的H链和(5)所述的L链。(7)抗体QU2E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 25记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 26记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 27记载的氨基酸序列。(8)抗体QU2E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 30记 载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 31记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 32记载的氨基酸序列。(9)抗体，该抗体含有(7)所述的H链和⑶所述的L链。(10)抗体QL13-3)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 35 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 36记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO :37记载的氨基酸序列。(11)抗体OL13-3)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 40记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 41记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 42记载的氨基酸序列。(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(11)所述的L链。(13)抗体(2L36-12)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 45 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 46记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 47记载的氨基酸序列。(14)抗体(2L36-12)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 50 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 51记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 52记载的氨基酸序列。(15)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(14)所述的L链。(16)抗体(2T15E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDRl的SEQ ID NO 66 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 67记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 68记载的氨基酸序列。(17)抗体(2T15E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDRl的SEQ ID NO 71 记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID NO 72记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 73记载的氨基酸序列。(18)抗体，该抗体含有(16)所述的H链和(17)所述的L链。(19)抗体，该抗体是在⑴ (18)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被 取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1) (18)中任一项所述的抗体具 有同等活性。(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1) (18)中任一项所述的抗体所结 合的GPR49蛋白的表位相同。本发明中，与本发明的抗体具有同等活性是指，与GPR49的结合活性和/或对表达 GPR49的细胞的细胞毒活性同等。向多肽中导入突变的方法，是用于制备与某种多肽功能相同的多肽的、本 领域技术人员所熟知的方法之一。例如，本领域技术人员可采用位点特异性诱变法 (Hashimoto-Gotoh, Τ.等人.(1995)Gene 152,271-275、Zoller, MJ,和 Smith, Μ. (1983) Methods Enzymol. 100,468-500> Kramer, W.等 K ■ (1984)Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W,和 Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)等，向本发明的抗体中导入适当的突变，从而可以制备与该抗体功能相同的抗 体。另外，氨基酸的突变在自然界中也可发生。如上所述，在本发明抗体的氨基酸序列中， 具有1个或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体功能相同的抗体也包含在本发 明的抗体中。上述突变体中，突变的氨基酸数目通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以 内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。在突变的氨基酸残基中，优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。例 如，根据氨基酸侧链的性质，确立以下分类疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；
亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)；具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)；具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；具有含碱性侧链的氨基酸(R、K、H)；具有含芳族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内均表示氨基酸的单字母符号)。已知具有对某一氨基酸序列通过1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或 用其它氨基酸的取代进行修饰的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性(Mark，D.F.等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M.J.和 Smith, Μ.，Nucleic Acids Research(1982) 10,6487-6500, Wang, A.等入，Science 224,1431-1433, Dalbadie-McFarland, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79,6409-6413) 即，通常 构成某多肽的氨基酸序列中，被分成各组的氨基酸在相互取代时，该多肽的活性得以保持 的可能性高。本发明中，将上述氨基酸组的组内氨基酸间的取代称作保守取代。本发明还提供与表位结合的抗体，所述表位与本发明所公开的抗GPR49抗体所结 合的表位相同。即，本发明涉及识别与2J18、2L13、2L36、2U1E、2U2E所识别的表位相同的表 位的抗体及其用途。上述抗体例如可以通过以下方法获得。被检抗体与某抗体共有表位，这可通过两者对同一表位的竞争来确认。抗体间的 竞争通过交叉阻断测定等进行检测。例如，竞争ELISA测定为优选的交叉阻断测定。具体而言，在交叉阻断测定中，在候选的竞争抗体的存在或非存在下，预温育包被 在微量板的孔上的GPR49蛋白，之后添加本发明的抗GPR49抗体。与孔中的GPR49蛋白结 合的本发明的抗GPR49抗体的量与对相同表位竞争性结合的候选竞争抗体(被检抗体)的 结合能力间接相关。即，被检抗体与相同表位的亲和性越大，则本发明的抗GPR49抗体与包 被GPR49蛋白的孔的结合量越降低，而被检抗体与包被GPR49蛋白的孔的结合量越增加。关于与孔结合的抗体量，通过预先标记抗体，可以容易地测定。例如，生物素标记 的抗体可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物来测定。将利用了过氧化 物酶等酶标记的交叉阻断测定特别地称作竞争ELISA测定。抗体可以用可检测或可测定的 其它标记物标记。具体而言，放射标记或荧光标记等是公知的。并且，当被检抗体具有来自与本发明的抗GPR49抗体不同种的恒定区时，还可以 通过识别任一恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任一种抗体。或者，即使是来自同种的 抗体，当类别(class)不同时，可以利用识别各类别的抗体测定与孔结合的抗体。与在候选竞争抗体非存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可 以阻断至少20%、优选至少30%、进一步优选至少50%的抗GPR49抗体的结合时，该候选竞 争抗体是与本发明的抗GPR49抗体实质上结合在同一表位上、或者是竞争结合在同一表位 上的抗体。上述(4) (6)中的任一种抗体所识别的表位的例子有人GPR49蛋白(SEQ ID NO 1)的第517位氨基酸 第537位氨基酸的区。另外，上述(16) (18)中的任一种抗 体所识别的表位的例子有人GPR49蛋白(SEQ ID NO 1)的第510位氨基酸 第5 位氨
27基酸的区。药物组合物从另一角度来看，本发明提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的药物 组合物。此外，本发明涉及含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂、 特别是抗癌药。优选将本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药给予罹患癌症的对象或有可能罹 患癌症的对象。由于GPR49的表达水平在脑以外的正常细胞中非常低，而在癌细胞中亢进， 由此认为通过给予抗GPR49抗体，可以得到癌细胞特异性的细胞毒作用。对本发明的药物组合物(例如抗癌药)中使用的抗GPR49抗体没有特别限定，可 以是任何抗GPR49抗体，例如可以使用上述抗GPR49抗体。本发明人等发现将GPR49蛋白切断，分成60kDa和40kDa的片段，N末端侧的 60kDa的片段被切断后分泌到细胞外。因此，对本发明的药物组合物中使用的抗GPR49抗体 没有特别限定，但优选其识别C末端侧的40kDa的片段。C末端侧的40kDa的片段的例子 有包含SEQ ID NO 1的第510位氨基酸 第907位氨基酸序列的片段等。SEQ ID NO 1的第510位氨基酸 第907位氨基酸序列中，胞外区形成第510位 氨基酸 第556位氨基酸的区、第615位氨基酸 第637位氨基酸的区、第704位氨基酸 第722位氨基酸的区、第792位氨基酸 第800位氨基酸的区。因此，虽然没有特别限定， 但识别这些区的抗体作为药物组合物特别有用。本发明中，“含有与GPR49结合的抗体作为有效成分”是指，含有抗GPR49抗体作为 主要活性成分，并不限定抗GPR49抗体的含有率。当本发明的药物组合物的治疗对象疾病为癌症时，对作为对象的癌症没有特别限 定，但优选为胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神经胶质瘤(例 如成胶质细胞瘤)，特别优选胃癌。癌症可以是原发病灶，也可以是转移病灶。本发明的药物组合物可以通过口服、胃肠外给药中的任一种途径给予患者。优选 为胃肠外给药。所述给药方法具体有注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射 给药的例子有例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部 给予本发明的药物组合物。还可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给药量例 如可以在每次、每kg体重0. OOOlmg IOOOmg的范围内选择。或者，例如可以在每位患者 0. OOlmg IOOOOOmg/个体的范围内选择给药量。但本发明的药物组合物并不限于上述给 药量。本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington ‘ s Pharmaceutical Science,latest edition, Mark PublishingCompany, Easton,U. S. A),可 以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。例如有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存 剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。并 不限于这些，可以进一步适当使用其它常用的载体。载体具体有轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤 维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚 乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢 化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。本发明还提供通过使GPR49表达细胞和与GPR49蛋白结合的抗体接触，而在 GPR49表达细胞中引发毒性的方法或抑制细胞增殖的方法。
对本发明的方法中使用的抗体没有特别限定，例如可以使用上述抗体。抗GPR49 抗体所结合的细胞只要是表达GPR49的细胞即可，没有特别限定。本发明中优选的GPR49 表达细胞为癌细胞。更优选为胃癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、 卵巢癌细胞、尤文肉瘤或神经胶质瘤细胞(例如成胶质细胞瘤细胞)。本发明的方法对上述 癌症的原发病灶和转移病灶均适用。进一步优选的癌细胞为原发性胃癌和转移性胃癌的细 胞。本发明中，“接触”例如可以通过向在试管内培养的GPR49表达细胞的培养液中添 加抗体来进行。在本发明中，“接触”还可以通过对将GPR49表达细胞移植到体内的非人动 物、或具有内源性表达GPR49的癌细胞的动物进行给药来进行。作为评价或测定通过抗GPR49抗体的接触在GPR49表达细胞中引发的细胞毒的方 法，优选采用以下方法。在试管内评价或测定该细胞毒活性的方法有上述抗体依赖性细 胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等的测定方法。抗GPR49抗体 是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以利用公知方法来测定(例如Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies inhumans, Editor, John E, Coligan等人，John Wiley & Sons, Inc.，(1993)等)。测定活性时，以具有与抗GPR49抗 体相同的同种型、但不具有该细胞毒活性的结合抗体作为对照抗体，与抗GPR49抗体同样 地加以使用，根据抗GPR49抗体显示出较对照抗体强的细胞毒活性，可以判定活性。抗体的同种型由该抗体的氨基酸序列的H链恒定区的序列来规定。在机体内，根 据产生抗体的B细胞成熟时发生的染色体上的基因重组所产生的类别转换，最终决定抗体 的同种型。同种型的不同反映在抗体的生理、病理性功能的不同。具体而言，例如已知细胞 毒活性的强度和抗原的表达量同时受抗体的同种型影响。因此，测定上述细胞毒活性时，用 作对照的抗体优选使用与被检抗体相同的同种型。此外，为了在机体内评价或测定细胞毒活性，例如将表达GPR49的癌细胞移植到 非人被检动物的皮内或皮下，之后从当天或第二天起每天或间隔数天静脉或腹腔内给予被 检抗体。通过每天测定肿瘤的大小，可以判定细胞毒活性。与试管内的评价同样，给予具有 相同同种型的对照抗体，根据抗GPR49抗体给药组的肿瘤大小明显小于对照抗体给药组的 肿瘤大小，可以判定具有细胞毒活性。使用小鼠作为非人被检动物时，可适当使用遗传性缺 失胸腺从而缺失其T淋巴细胞的功能的裸小鼠(nu/nu)。通过使用该小鼠，在评价、测定给 予的抗体所产生的细胞毒活性时，可以排除被检动物中T淋巴细胞的干预。本发明还提供癌症的诊断方法，其特征在于检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白 的基因。确认GPR49在各种癌组织或癌细胞株中明显表达亢进，相对于此，在正常细胞中 GPR49的表达在除脑以外的脏器中非常低。因此，GPR49作为用于特异性检测癌症的标志物 是有用的。在本发明方法的一个方式中，通过检测试样中的GPR49蛋白来进行癌症的诊断。 优选检测GPR49蛋白的胞外区。GPR49蛋白的检测优选使用识别GPR49蛋白的抗体来进行。作为本发明的诊断方法的具体例之一，可以列举包括以下步骤的癌症的诊断方法。(a)提供从受试者采集的试样的步骤；(b)使用与GPR49蛋白结合的抗体检测采集的试样中所含的GPR49蛋白的步骤。
本发明中，检测包括定量或定性的检测。例如，定性检测可以是下述测定仅测定是否存在GPR49蛋白；测定是否存在一定量以上的GPR49蛋白；将GPR49蛋白的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。而定量检测可以是GPR49蛋白浓度的测定、GPR49蛋白量的测定等。本发明中的被检试样只要是可能含有GPR49蛋白的试样即可，没有特别限定。具 体优选从哺乳类等生物的体内采集的试样。进一步优选的试样为从人体内采集的试样。被 检试样的具体例子可以例示如血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血 清、淋巴液、唾液、尿、组织、腹水、腹腔内清洗液等。优选的试样为由下述被检试样得到的试 样，所述被检试样为将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液寸。将GPR49蛋白切断，分成约60kDa的N末端肽和约40kDa的C末端肽，N末端肽分 泌到血液中。因此，在本发明的诊断方法中，可以检测切断后的N末端肽或C末端肽。例如， 可以检测血液或血清等试样中所含的分泌的N末端肽。对根据本发明诊断的癌症没有特别限定，可以是任何癌症。具体有肝细胞癌、肺 癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)等。本发明中，对上述 癌症的原发病灶和转移病灶均可诊断。本发明中，特别优选的癌症为原发性胃癌和转移性胃癌。本发明中，当在被检试样中检测出蛋白时，以其水平为指标来诊断癌症。具体而 言，与阴性对照或正常者相比，被检试样中检测出的GPR49蛋白的量多时，显示受试者患有 癌症、或者将来罹患癌症的可能性高。即，本发明涉及癌症的诊断方法，该方法包括以下步 骤(1)检测从受试者采集的生物样品中GPR49的表达水平的步骤；和(2)当(1)中检测的GPR49的表达水平与对照相比高时，显示受试者患有癌症的步
马聚ο本发明中，对照是指作为比较基准的试样，包括阴性对照和正常者的生物样品。阴 性对照可以通过采集正常者的生物样品，并根据需要进行混合而得到。对照的GPR49表达 水平可以和受试者的生物样品中的GPR49表达水平同时检测。或者，可以预先检测多名正 常者的生物样品中的GPR49表达水平，再对正常者中的标准表达水平进行统计学判定。具 体而言，例如还可以使用平均值士2X标准偏差(S. D.)、或平均值士3X标准偏差(S.D.) 作为标准值。在统计学上，平均值士 2X标准偏差(S.D.)包括80%的正常者的值，而平均 值士3X标准偏差(S. D.)包括90%的正常者的值。或者，可以利用ROC曲线设定对照中的GPR49的表达水平。ROC曲线(receiver operating characteristic curve ；接收者操作特性曲线)是纵轴表示检测灵敏度、横轴 表示假阳性率(即“1-特异度”)的曲线图。本发明中，当连续改变用于判定生物样品中的 GPR49表达水平的基准值时，通过将灵敏度和假阳性率的变化作图，可以得到ROC曲线。需要说明的是，用于得到ROC曲线的“基准值”，是为了进行统计学分析而暂时使 用的数值。用于得到ROC曲线的“基准值”通常在可以覆盖可选择的所有基准值的范围内连 续变化。例如可以使基准值在所分析的集团的GPR49测定值的最小值与最大值之间变化。
基于所得的ROC曲线，可以选择可以期待所需的检测灵敏度以及精度的标准值。 根据ROC曲线等在统计学上设定的标准值也称为截断值(cut-off值)。基于截断值的癌 症的检测方法为在上述步骤⑵中，将(1)中检测的GPR49的表达水平与截断值比较。而 且，当(1)中检测的GPR49的表达水平比截断值高时，表示受试者被检测出癌症。本发明中，GPR49的表达水平可以通过任意方法来确定。具体而言，通过评价 GPR49的mRNA的量、GPR49蛋白的量、以及GPR49蛋白的生物学活性，可以知道GPR49的表 达水平。GPR49的mRNA和蛋白的量可以通过本说明书中所述的方法来确定。本发明中，可以以表达GPR49蛋白的任意动物种作为受试者。例如已知黑 猩猩(Pan troglodytes)(ENSPTRG00000005223(XR_021586. 1)),恒河猴(Macaca mulatta) (ENSMMUG00000020942)、小鼠(Mus musculus)(ENSMUSG00000020140)、大鼠 (Rattus norvegicus)(ENSRN0G00000004221 (L0C687868)),豚鼠(Cavia porcellus) (ENSCP0G0000000949W、狗(Canis familiar is) (ENSCAFG00000000451)、猫(Felis catus) (ENSFCAG00000008064)、鸡(Gallus gallus) (ENSGALG00000010163)等人以外的多种哺乳 类表达GPR49蛋白。因此，本发明中的受试者包括这些动物。特别适合的受试者是人。需 要说明的是，以人以外的动物作为受试者时，当然可以检测该动物种的GPR49蛋白。对被检试样中所含的GPR49蛋白的检测方法没有特别限定，优选通过使用抗 GPR49抗体的、以下例示的免疫学方法进行检测放射免疫测定(RIA)；酶联免疫测定(EIA)；荧光免疫测定(FIA)；发光免疫测定(LIA)；免疫沉淀法(IP)；免疫比浊法(TIA)；蛋白质印迹法(WB)；免疫组织化学法(IHC)；以及免疫扩散法(SRID)。上述方法中，作为癌症的诊断方法，免疫组织化学(IHC)法是优选的免疫学测定 方法之一，该方法包括以下步骤将从罹患癌症的患者取得的组织或细胞固定在切片上，之 后检测切片上的GPR49蛋白。免疫组织化学(IHC)法等上述免疫学方法为本领域技术人员 所公知。S卩，GPR49是癌细胞中特异性表达增强的膜蛋白，因此利用抗GPR49抗体可以检测 癌细胞或癌组织。通过上述免疫组织学分析，检测从机体内采集的细胞或组织中所含的癌 细胞。在另一优选方式中，还可以利用抗GPR49抗体来检测机体内的癌组织。S卩，本发 明涉及癌症的检测方法，该方法包括(1)给予受试者用放射性同位素等标记物标记的与 GPR49蛋白结合的抗体的步骤；以及( 检测上述标记物的累积的步骤。为了追踪给予到机 体内的抗体，可以标记抗体以能够进行检测。例如，可以追踪用荧光物质、发光物质或放射 性同位素标记的抗体在机体内的行为。用荧光物质或发光物质标记的抗体，可以使用内视 镜或腹腔镜来观察。至于放射性同位素，通过追踪其放射活性，可以将抗体的定位图像化。本发明中，机体内的抗GPR49抗体的定位表示癌细胞的存在。为了检测机体内的癌症，标记抗体的放射性同位素可以使用正电子发射核素。例 如可以用18F、55Co、64CU、6fiGaJ8GaJ6BiN8i^ 和124I这样的正电子发射核素标记抗体。利用这 些正电子发射核素标记抗GPR49抗体时，可采用公知的方法(Acta Oncol. 32，825 830， 1993)。将用正电子发射核素标记的抗GPR49抗体给予人或动物后，使用PET (正电子断层 摄影装置)从体外计测该放射性核素放射的放射线，通过计算机层析成像的方法转换为图 像。PET是用于非侵袭性地获得有关药物的体内行为等的数据的装置。利用PET可以将放 射强度以信号强度的形式定量图像化。通过按上述方式使用PET，无需从患者体内采集试 样，即可检测在特定癌症中高度表达的抗原分子。抗GPR49抗体除了用上述核素标记外，还 可以利用使用"(:、"Ν、1μΟ、18Ρ、45 等正电子发射核素的短寿命核素进行放射标记。使用由医疗用回旋加速器得到的上述核素的短寿命核素的生产、短寿命放射标记 化合物的制备技术等相关研究开发得到推进。利用这些技术，可以用各种放射性同位素标 记抗GPR49抗体。给予患者的抗GPR49抗体，根据抗GPR49抗体对各部位的病理组织的特 异性而累积在原发灶和转移灶中。抗GPR49抗体用正电子发射核素标记时，检测其放射活 性，从而根据放射活性的定位，检测该原发灶和转移灶的存在。用于该诊断用途时，可适当 使用25 4000keV的γ粒子或正电子放射量的活性值。另外，选择适当的核素、再大量给 予时，也有望获得治疗效果。为了得到放射线产生的抗癌作用，可以使用给予70 700keV 的Y粒子或正电子放射量值的核素。在本发明方法的另一方式中，检测GPR49的基因的表达。本发明中，对所检测的基 因没有特别限定，但优选mRNA。本发明中，检测包含定量或定性检测。例如，定性检测的例 子有下述测定操作。仅测定是否存在GPR49mRNA ；测定是否存在一定量以上的GPR49mRNA ；将GPR49mRNA的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。而定量检测可以是GPR49 mRNA浓度的测定、GPR49 mRNA量的测定等。作为本发明中的被检试样，可以使用可能含有GPR49 mRNA的任意试样。优选从 哺乳类等生物的体内采集的试样，进一步优选为从人体内采集的试样。被检试样的具体例 子可以例示如血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、 尿、组织、腹水、腹腔内清洗液等。本发明的被检试样还包括优选的试样、即由下述被检试样 得到的试样，所述被检试样为将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的 培养液等。使用由将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等的、 从被检试样得到的试样时，优选采用原位杂交法。原位杂交法是作为确认细胞或组织内是 否存在特定的DNA或RNA、或分布及其表达的强弱的方法而发展起来的。其原理是利用了 下述性质具有与细胞内的特定核酸序列互补的核苷酸序列的探针核酸特异性地形成复合 体。通过预先将放射性同位素(RI)或抗原物质(半抗原)等标记在该探针上，通过检测该 标记，即可识别杂交的部位，因此原位杂交法被用于细胞内DNA或RNA等的检测等。作为探 针的标记，优选使用利用RI进行的标记。作为进一步优选的例子，可以使用利用了非放射性物质的生物素或洋地黄毒苷等的半抗原等的荧光标记。作为特别优选的例子，采用利用 被称作FISH的荧光原位杂交(fluorescence in situ hibridization)进行的检测法。对所要诊断的癌症没有特别限定。具体有胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺 癌、卵巢癌和神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)等。本发明中，对上述癌症的原发病灶和转 移病灶均可诊断。本发明中，可以以表达GPR49蛋白的任意动物种作为受试者。例如已知小鼠、大 鼠、恒河猴、黑猩猩等人以外的多种哺乳类表达GPR49。特别适合的受试者是人。需要说明 的是，当以人以外的动物种作为受试者时，检测该动物种的GPR49 mRNA。以下给出检测方法的具体方式。首先，由受试者制备试样。然后，检测该试样中所 含的GPR49 mRNA。本发明中，还可检测由mRNA合成的cDNA。本发明中，在被检试样中检测 出GPR49mRNA或编码GPR49的cDNA时，判定可能患有癌症。例如，与阴性对照或正常者相 比，在被检试样中检测出的GPR49 mRNA或编码GPR49的cDNA的量多时，显示受试者患有癌 症、或者将来罹患癌症的可能性大。 检测mRNA的方法是公知的。在本发明中，具体可以利用例如RNA印迹法、RT-PCR 法、DNA芯片法等。上述本发明的检测方法，还可以使用各种自动检查装置自动进行。通过自动化，可 以在短时间内检查多个试样。本发明还提供用于诊断癌症的诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒含有用 于检测被检试样中的GPR49蛋白的试剂。本发明的诊断试剂至少含有抗GPR49抗体。通过将本发明的癌症诊断用试剂与用于检测GPR49的其它要素组合，可以制成用 于诊断癌症的试剂盒。即，本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒含有与GPR49结 合的抗体、和检测该抗体与GPR49结合的试剂，还可以进一步含有对照试样，所述对照试样 包含含GPR49的生物样品。本发明的试剂盒，还可以在试剂盒中附带用于说明测定操作的 说明书。需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。实施例以下，利用实施例来进一步具体说明本发明，但本发明的技术范围并不受这些实 施例的限定。[实施例I]利用人外显子1.OST芯片进行的GPR49mRNA表达分析为了明确人GPR49 mRNA在临床癌症、癌细胞株、各种正常脏器中的表达分布，使用 原本为了进行剪接变体分析而开发的人外显子1. OST芯片(Affymetrix公司)进行表达分 析。利用人外显子1. OST芯片进行表达分析的优点在于与基本上每个基因在3’侧只有1 个探针组的、Affymetrix公司的现有表达芯片相比，在人外显子1. OST芯片中基因的每个 外显子可设定至少1个探针组，所以使用本芯片对每个基因进行表达分析时，每个基因可 以得到多个探针组的表达数据，每个基因的表达数据的可靠性均有所提高。此次表达分析中，使用来自22例肺腺癌摘出组织的肿瘤部分、13例胃癌摘出组织 的肿瘤部分、5例尤文肉瘤组织的肿瘤部分、20例卵巢癌摘出组织的肿瘤部分、19种肺腺癌 细胞株、4种小细胞肺癌细胞株、16种胃癌细胞株、20种卵巢癌细胞株和71种正常组织(从Clontech 公司、Ambion 公司、STRATAGENE 公司、CellAPPLICATIONS 公司、Panomics 公司、 CHEMICON 公司、BioChair^nstitute 公司购入)的总 RNA。对于所有临床癌摘出组织(已取得知情同意)的肿瘤部分、正常部分和癌细胞株 (从 ATCC、JCRB、理研 BIOSOURCE CENTER CELLBANK 购入)，使用 Trizol (Invitrogen)，按照 产品附录的方法提取总RNA。使用1 μ g上述总RNA，根据GeneChip全转录物(WT)有义靶标记测定指南 (Affymetrix)进行基因表达分析实验，人外显子1. OST芯片数据的数值化使用Affymetrix 公司提供的ExACT (外显子芯片计算工具)软件来进行。存在21个相对于人外显子1. OST芯片的人GPR49的核心探针组，其探针组ID 为 3422146、3422162、3422166、3422167、3422175、3422177、3422179、3422180、3422181、 3422182、3422189、3422191、3422194、3422195、3422197、3422198、3422199、3422200、 3422201。探针组ID 3422201在正常组织中的表达数据见图1，在胃癌细胞株、胃癌摘出组 织的肿瘤部分的表达数据见图2，在尤文肉瘤、小细胞肺癌、肺腺癌摘出组织肿瘤部分的表 达数据见图3，在卵巢癌细胞株、卵巢癌摘出组织的肿瘤部分的表达数据见图4。由图1 4可知人GPR49转录物在正常组织中的表达仅限于间脑、延髓、末梢神 经、骨骼肌、子宫、胎盘、胎儿大肠等中。而其在担心药物毒性的脏器、即肺、肾脏、肝脏、骨 髓、末梢血中的表达低，有望将副作用抑制在低水平。在癌组织中，观察到其在胃癌、尤文肉 瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、卵巢癌中高度表达，期待以人GPR49为靶的抗肿瘤药对这些癌症 有效。[实施例21全长人GPR49表达细胞的建立分别以NCBI检索号NP_003658. 1 (SEQ ID NO 1 (氨基酸序列))和 NM_003667. 2 (SEQ ID NO :2 (核苷酸序列))为基础，通过PCR法分离全长人GPR49cDNA，并 将其克隆到哺乳细胞表达用载体(pcDNA5/FRT/T0) (Invitrogen公司)中。pcDNA5/FRT/ TO是一种在杂交人CMV/TetA启动子下插入基因能够诱导表达、且整合有新霉素耐性基因 作为耐药性标志物的载体。再使用仅在四环素或多西环素存在下能够进行表达诱导的表达 系统Flph系统anvitrogen公司)，向T-Rex细胞中进行全长人GPR49cDNA的 基因导入。向在 DMEM(高糖)/10% FBS/100yg/mL Zeocin (Invitrogen 公司)/15 μ g/ ml杀稻瘟素anvitrogen公司)中培养的T-Rex细胞中导入表达载体时，使用 Fugene6 (Roche公司)。按照操作指南，同时进行表达Flp重组酶的pOG44载体和pcDNA5/ FRT/GPR49载体的基因导入，用50 μ g/mL潮霉素B (Invitrogen公司)进行选择，建立导入 了全长人GPR49基因的人GPR49诱导表达细胞株、B2、B4。在插入到表达载体中的GPR49基 因的N末端导入有HA标签，所以利用抗HA抗体(Sigma公司)来检测选择细胞。使用BioRad GenePulser，向来自中国仓鼠卵巢的细胞、即DG44细胞株中导入基 因，得到HA-GPR49表达细胞株2B10。再构建导入有GPR49基因的载体，将其用于DNA免疫。表达载体pMCN是一种在小 鼠CMV启动子(ACCESSION No. U68299)下插入基因能够诱导表达、且整合有新霉素耐性基 因作为耐药性标志物的载体。按照常规方法将GPR49基因克隆到pMCN中，由此制作作为 GPR49 表达载体的 pMCN-GPR49。
[实施例31通过DNA免疫讲行的抗GPR49单克降抗体的制作利用基因枪粒子(GeneGun Particle)法向小鼠中导入基因，进行DNA免疫。该方 法按照BioRad公司的操作指南来进行。将Imm的金颗粒(BioRad公司)与pMCN_GPR49DNA 混合，包被在管内部，由此制作DNA免疫用弹丸。对于6周龄雌性MRL/lpr小鼠，以 200-300psi的压力，使用Helios基因枪(BioRad公司)，将包被有pMCN_GPR49 DNA的弹丸 打入腹部皮肤中，由此进行基因导入。认为通过被导入到存在于皮肤中的角化细胞、郎格汉 斯细胞、真皮树突细胞(dermal dendritic cell)中的基因表达GPR49蛋白，使这些细胞成 为抗原提示细胞(APC)，引起了免疫(Methods 31,232-242(2003) ；Immunization with DNA through the skin)。以1周的间隔进行6次DNA免疫。最终免疫是指将表达GPR49的DG44 细胞株2B10的100万个细胞用PBS稀释后进行尾静脉内给药。抗体效价的测定通过使用 2B10细胞的FACS分析来进行。比较已免疫的小鼠的血清与在2B10细胞的细胞膜表面上 表达的GPR49蛋白的反应。对反应性最高的小鼠进行最终免疫，将其用于细胞融合。最终 免疫的3天后，摘出该脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63Ag8Ul (P3U1、从ATCC购入)混合， 达到2 1的比例。细胞融合通过缓慢加入PEG1500( 口* 二·夕·、7夕‘7 7歹4 7夕公 司)来进行，制作杂交瘤细胞。通过小心加入RPMI1640培养基(GIBCO BRL公司)来稀释 PEG1500的浓度，之后通过离心操作除去PEG1500。接下来，将杂交瘤细胞悬浮于含有10% FBSU XHAT培养基添加剂(SIGMA公司)、0. 5 X BM-Condimed Hl杂交瘤克隆添加剂(口〉
f ^ 7 J % r ^ ^ 9公司)的RPMi 1640培养基(以后记作HAT培养基)中，之后接 种在96孔培养板上，使达到200 μ L/孔。接种时的细胞浓度根据所用的P3U1细胞数目来 稀释，将杂交瘤细胞在96孔培养板中、于37°C、5% CO2中、在HAT培养基中培养约1周。分 泌抗体到培养上清中的杂交瘤的筛选通过流式细胞术来进行。[实施例41 sGPR49Fc的制备利用PCR扩增含有GPR49蛋白的第1_555位氨基酸的片段，之后构建载体，使扩增 的片段与小鼠IgGh的Fc蛋白以融合蛋白的形式表达。将构建的载体导入DG44细胞中，选 择sGPR49Fc的融合蛋白能够表达的细胞作为新霉素耐性株。大量培养所得的细胞株2D3， 之后回收培养上清，纯化sGPR49Fc蛋白。将通过蛋白A柱以Fc融合蛋白的形式被亲和纯 化的sGPR49Fc蛋白供给蛋白免疫的抗原或杂交瘤的筛选抗原。[实施例51利用sGPR49Fc蛋白免疫来制作抗GPR49抗体将50 μ g亲和纯化sGPR49Fc蛋白与弗氏完全佐剂混合，进行免疫，再将50 μ g 二 次亲和纯化sGPR49Fc蛋白与弗氏不完全佐剂混合，将所得混合物通过皮下对小鼠进行免 疫以诱导抗体，对与GPR49蛋白的反应性最高的小鼠从尾静脉注射25 μ g sGPR49Fc蛋白，3 天后供给细胞融合，如上操作来制备杂交瘤。[实施例61利用FACS(流式细胞术)评价结合活性使用所得的杂交瘤，利用流式细胞术评价与人GPR49/DG44细胞QB10)的结合。将 悬浮于FACS缓冲液O % FBS/PBS/0. 05 % NaN3)中的人GPR49表达细胞株用FACS缓冲液稀 释至1 X IO6个细胞/mL，之后按50 μ L/孔分别注入i^lcOn353910圆底96孔板中。向加入有 细胞的孔中加入稀释至适当浓度的杂交瘤的培养上清，使之在冰上反应60分钟。接下来， 用FACS缓冲液清洗细胞1次。向加入有细胞的孔中添加作为二次抗体的山羊F(ab' )2片 段抗小鼠IgG (H+L)-FITC (Beckman Coulter公司)，之后使之在冰上反应30分钟。反应后，通过离心除去上清，之后将悬浮于IOOyL FACS缓冲液中的细胞供给流式细胞术。在流式 细胞术中使用FACS CalibuH《夕l· > r 4 7今> 乂 >公司)。根据前向角散射(forward scatter)和侧向角散射(side scatter)的斑点印迹在活细胞集团中设定阈值，选FLl的直 方图，评价该集团中所含的细胞的结合活性。使杂交瘤的上清与作为诱导表达GPR49的DG44细胞的2B10、作为其母株的DG44 分别反应时，得到了与GPR49表达细胞发生特异性反应的杂交瘤。利用极限稀释法将这 些孔的杂交瘤单克隆化。使用Isc^trip (注册商标)小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(口 ν . τ ^ 7 ^ r ^ ^ )分析各抗体的同种型。其结果，2J18-1N、2J18_3是IgM， 而 2L7-8、2L9-3、2L10-19、2L13-3、2L15-12、2L16-15、2L18-15、2L33-6、2L34-5、2L36-12、 2T4E-6、2T9E1#14、2T15E-2、2T42E-4、2T54-2、2T65-3、2T37-16、2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11 是 IgGl0扩大培养被单克隆化的杂交瘤，之后使用蛋白G柱，按照操作指南从培养上清中纯化 抗体。至于IgM抗体，使用蛋白L柱按照操作指南进行纯化。已纯化的抗体通过DC蛋白测 定等进行蛋白定量。[实施例71抗原基因的克降对于显示ADCC 活性和 CDC 活性的 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36_12、 2T15E-2这6种杂交瘤，确定抗体可变区基因的序列。对于抗体的基因，使用从分别产生 抗 GPR49 抗体 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2 的杂交瘤中提取的总 RNA，通过 RT-PCR 法进行扩增。以下，将各抗体 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、 2T15E-2 的基因名称简记为 2J18、2U1E、2U2E、2L13、2L36、2T15E 基因。使用 RNeasy Plant Mini试剂盒OiIAGEN公司)，从1 X IO7个细胞的杂交瘤中提取总RNA。通过使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(CL0NTECH公司)，利用1 μ g总RNA构建RACE文库。作为IgM抗体 的2J18-1N使用与小鼠IgM恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgM(SEQ ID NO :61 ； CCACCAGATTCTTATCAGACAGG)，其他抗体基因则使用与小鼠IgGl恒定区序列互补的合成寡 核苷酸 MHC-IgGl (SEQ ID NO :62 ;GGGCCAGTGGATAGACAGATG)、或与小鼠 κ 链恒定区核苷酸 序列互补的合成寡核苷酸κ (SEQ ID NO :63 ;GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG)，从而扩增编码 该杂交瘤所产生的抗体的基因的5’末端侧基因片段。在42°C下进行1小时30分钟的逆 转录反应。50yL PCR溶液中含有5yL IOXAdvantage 2 PCR缓冲液、5yL IOX通用引 物 A Mix、0. 2mM 的 dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1 μ L Advantage 2 聚合酶 Mix (以上由 CL0NTECH公司制备)、2. 5μ L逆转录反应产物、IOpmol合成寡核苷酸MHC-IgM、MHC_IgGl或 κ。PCR反应如下进行在94°C的初温下反应30秒后，重复94°C下5秒、72°C下3分钟的 反应循环5次，接下来，重复94°C下5秒、70°C下10秒、72°C下3分钟的反应循环5次，再 重复94°C下5秒、68°C下10秒、72°C下3分钟的反应循环25次。最后，将反应产物在72°C 下加热7分钟。使用QIAquick凝胶提取试剂盒OiIAGEN公司制备)，从琼脂糖凝胶中纯化 各PCR产物。之后，将该PCR产物克隆到pGEM-T fesy载体(Promega公司制备)中，确定 其核苷酸序列。2J18的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :3、氨基酸序列见SEQ ID NO :4、L 链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :8、氨基酸序列见SEQ ID NO :9。2J18的重链⑶Rl的 氨基酸序列见SEQ ID NO :5、重链⑶R2的氨基酸序列见SEQ ID NO :6、重链⑶R3的氨基酸 序列见SEQ ID NO :7、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ ID NO 10、轻链⑶R2的氨基酸序列见SEQ ID NO :11、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :12。2U1E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 13、氨基酸序列见SEQ ID N0:14、 L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 18、氨基酸序列见SEQ ID NO 19。2U1E的重链CDRl 的氨基酸序列见SEQ IDNO 15、重链⑶R2的氨基酸序列见SEQ ID NO 16、重链⑶R3的氨基 酸序列见SEQ ID NO :17、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ ID NO :20、轻链⑶R2的氨基酸序 列见SEQ ID NO :21、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :22。2U2E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :23、氨基酸序列见SEQ ID NO :24、 L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 28、氨基酸序列见SEQ ID NO :29。2U2E的重链CDRl 的氨基酸序列见SEQ IDNO :25、重链⑶R2的氨基酸序列见SEQ ID NO 26、重链⑶R3的氨基 酸序列见SEQ ID NO :27、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ ID NO :30、轻链⑶R2的氨基酸序 列见SEQ ID NO :31、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :32。2L13的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 33、氨基酸序列见SEQ ID NO :34、 L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 38、氨基酸序列见SEQ ID NO :39。2L13的重链CDRl 的氨基酸序列见SEQ IDNO :35、重链⑶R2的氨基酸序列见SEQ ID NO 36、重链⑶R3的氨基 酸序列见SEQ ID NO :37、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ ID NO :40、轻链⑶R2的氨基酸序 列见SEQ ID NO :41、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :42。2L36的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :43、氨基酸序列见SEQ ID NO :44、 L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO 48、氨基酸序列见SEQ ID NO :49。2L36的重链CDRl 的氨基酸序列见SEQ IDNO :45、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO :46、重链CDR3的氨基 酸序列见SEQ ID NO :47、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ ID NO :50、轻链⑶R2的氨基酸序 列见SEQ ID NO :51、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :52。2T15E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :64、氨基酸序列见SEQ ID NO: 65、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO :69、氨基酸序列见SEQ ID NO :70。2T54E的重链 CDRl的氨基酸序列见SEQID NO :66、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO :67、重链CDR3 的氨基酸序列见SEQ ID NO :68、轻链⑶Rl的氨基酸序列见SEQ IDNO :71、轻链⑶R2的氨基 酸序列见SEQ ID NO :72、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO :73。Γ实施例81使用强制表达细胞株的细胞破碎液进行的蛋白质印迹分析使用HA-GPR49表达DG44细胞株2Β10的细胞破碎液，筛选可进行蛋白质印迹的抗 体时，在2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11、2T15E-2、2T65_3等中，通过蛋白质印迹法分析可以检测 出预想为GPR49蛋白的分子量为IOOkDa的谱带。为了确认所检测出的IOOkDa的谱带来自 人GPR49，通过蛋白质印迹法分析与293细胞B2的非诱导时、诱导时的细胞破碎液的反应 性，所述293细胞B2表达通过多西环素可以诱导表达的HA-GPR49。结果见图5。^3、B2的 0表示非诱导时的细胞破碎液，1和10表示表达诱导时的细胞破碎液。在利用单克隆抗体 2U2E-2进行的检测中诱导表达的泳道上特异性地确认到IOOkDa的谱带。该谱带与利用HA 标签检测的HA-GPR49的谱带、即IOOkDa的谱带大小相同，由此断定单克隆抗体2U2E-2是 识别GPR49的抗体。Γ实施例91利用SiRNA确认识别抗体的抗原为了进一步确认IOOkDa的谱带来自GPR49，通过转染siRNA来剔除GPR49的表 达，确认抗体所识别的谱带消失。按照操作指南，将从hvitrogen公司购入的抗GPR49的
37siRNA (Cat. No. 1299003) LGR5-HSS112507、LGR5-HSS112508、LGR5-HSS112509 (以下简记为 siRNA507.508.509)导入2B10细胞株或GPR49高度表达大肠癌细胞株、即LoVo细胞中，利 用蛋白质印迹法分析其细胞破碎液。结果如图6所示，在siRNA507、508、509这3种siRNA 中，发现在508、509中GPR49的相当于予想分子量IOOkDa蛋白的谱带明显消失，由此认为 IOOkDa的谱带识别GPR49。并且，如图6所示，2U1E-1、2U2E_2的蛋白质印迹分析的结果，发现了与由于siRNA 的导入而消失的IOOkDa蛋白的谱带同时消失的新的谱带。在抗体2U1E-1的检测中，除 IOOkDa蛋白的谱带外，发现约40kDa蛋白的谱带也由于siRNA而消失。还发现在抗体 2U2E-2的检测中，除IOOkDa蛋白的谱带外，约60kDa蛋白的谱带也由于siRNA而消失。这 两个谱带的大小总计正好为全长IOOkDa,由此认为GPR49蛋白在某处被切断，生成60kDa、 40kDa的蛋白。另外，在作为大肠癌细胞株的LoVo细胞中也检测到60kDa、40kDa的谱带。[实施例101利用免疫沉淀法检测切断片段为了确认通过蛋白质印迹法检测的40kDa蛋白、60kDa蛋白的谱带的存在，使用 GPR49单克隆抗体进行免疫沉淀实验。作为发生免疫沉淀的样品，使用用NP40裂解缓冲液 (0. 5% NP40,50mM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl，蛋白酶抑制剂 complete mini (Roche 公 司))增溶表达HA-GPR49的DG44细胞株2B10而制成的细胞破碎液。以BSA作为标准品， 通过DC蛋白测定来定量细胞破碎液中所含的蛋白量。向500μ L含IOOyg蛋白的细胞破 碎液中加入2yg抗体溶液，使之在4°C下反应1小时。再加入20 μ L蛋白A/G Plus琼脂 糖(Santa Cruz公司)，使之反应一夜。以IOOOXg的离心力离心1分钟，使琼脂糖珠粒沉 淀，用ImL PBS清洗2次，之后加入50 μ L 2XSDS-样品缓冲液，在60°C下保温30分钟， 从而洗脱与抗体结合的抗原。以IOOOXg的离心力离心1分钟，将所得上清中的15μ L供 给SDS-PAGE。利用submarine法转录到S 1J求7公司的Immobilon-P上，利用单克隆抗体 2U1E-1、2U2E_2进行检测。结果见图7、图8。如在2L13_3、2L36_12中发生免疫沉淀的样品 流过的泳道中之所见，除IOOkDa的谱带外，确实在2U1E-1中还可检测到40kDa的谱带、在 2U2E-2中还检测到60kDa的谱带，由此可知GPR49除了以具有IOOkDa的分子量的分子形 式存在外，还以具有显示为约60kDa、约40kDa的大小的分子量的分子形式存在。图7使用 作为二次抗体的 HRP 标记抗小鼠 IgG (H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司制备)，图8使用作为二次抗体的HRP标记抗小鼠κ抗体(Southern Biotech公司制 备)，以区别来自用于免疫沉淀的抗体的H链的谱带和60kDa的GPR49的谱带。[实施例111使用各种癌细胞株的细胞破碎液进行的蛋白质印迹分析使用单克隆抗体2U2E-2检测各种癌细胞株的细胞破碎液。如图9所示，在大肠癌 细胞株LoVo、肝细胞癌株Alexander、H印G2、卵巢癌细胞株KURAM0CHI、0VSAH0、神经胶质瘤 U251中，GPR49蛋白的表达特别显著地亢进。箭头显示100kDa、60kDa的GPR49蛋白的谱带。 照片中的泳道显示出样品名称，分别显示大肠癌细胞株LoVo、胃癌细胞株NUGC-4、肝细胞 癌株Alexander、肝细胞癌株H印G2、肝细胞癌株Huh6、卵巢癌细胞株KURAM0CHI、卵巢癌细 胞株0VSAH0、神经胶质瘤U251、中国仓鼠卵巢细胞DG44、HA_GPR49表达DG44细胞株2B10。[实施例121抗GPR49单克隆抗体的⑶C活性的测定通过以产生细胞毒的细胞中7-AAD的摄入程度为指标，测定⑶C活性。使GPR49表达DG44细胞或DG44细胞与单克隆抗体以10 μ g/mL的浓度在4 °C下反应30分钟。接下来，添加幼兔补体(Baby RabbitComplement) (CEDARLANE LABORATORIES公司)，使其最终浓度达到1 %或5 %，在37 °C下继续反应90分钟。加 入7-AAD(BeckmanC0ulter公司)，使其最终浓度达到1 μ g/mL,之后在室温下静置10分 钟。之后，用FACS缓冲液清洗细胞，然后用FACSCalibur分析产生细胞毒的细胞的比 例。％ FL3的值表示用7-AAD染色的、损伤细胞的比例，在表达HA-GPR49的DG44细胞 中，利用抗GPR49抗体2J18-1N确认到特异性补体依赖性细胞毒(complement-cbpendent cytotoxicity (CDC))活性(图 10)。[实施例13l2.T18scFv-Fc表汰载体的构建由于抗人GPR49单克隆抗体2J18是IgM，所以无法评价ADCC活性。于是，使抗体 基因以scFv-Fc的形式表达。对于如实施例7那样克隆的2J18抗体基因，通过PCR扩增H 链、L链的可变区，并经由作为接头的氨基酸GGGGS使之结合，之后连接小鼠的IgGh的H链 的铰链区、CH2区、CH3区，制成以scFv-Fc形式表达的抗体分子。具体使用以下引物进行 PCR。KozakATG-2J18VHGCGAATTCCACCATGGGATG(SEQ ID NO :74)2J18VH-GS1TGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAG(SEQ ID NO :75)GS1-2J18VLGGTGGCGGTGGCTCACAGATTGTTCTCACCCAGTC(SEQ ID NO :76)2J18VH-GS2ACTCCCACCACCGCCTTTTATTTCCAATTTTGTCCCCG(SEQ ID NO :77)GS2_mIgGh-铰链GGCGGTGGTGGGAGTGAGCCCAGAGGGCCCAC(SEQ ID NO :78)NX-mG2a-3CTCTAGAGCGGCCGCTTATC(SEQ ID NO :79)将其插入表达载体中，完成2J18SCFv-FC表达载体的构建。[实施例14l2.T18scFv-Fc蛋白的制备使2J18SCFv-FC表达载体在细胞中一过性表达，使用蛋白G柱从其培养上 清中亲和纯化。将18μ g质粒DNA和Μμ L FugeneHD (Roche公司制备)一同在900 μ L 0pti-MEM(Invitorogen公司制备)中混合，静置15分钟，之后添加到200万个在Τ75烧杯 中培养的四31~细胞(从ATCC购入)细胞上，将基因导入细胞中。在5% CO2培养箱中、37°C 下培养3天，之后回收培养上清，使用蛋白G柱，按照操作指南纯化2J18scFV-Fc。[实施例15]人IgGl嵌合2L13抗体的制作对于如实施例7那样克隆的抗人GPR49单克隆抗体2L13的抗体基因，通过PCR扩 增H链、L链的可变区，之后将其与人IgGl的H链恒定区、L链恒定区连接，以人IgGl嵌合分 子的形式插入表达载体中，使其能够表达。所得载体基因导入到大鼠骨髓瘤细胞YB2/0(从 ATCC 购入)中，建立新霉素耐性株。在 RPMI-1640/10% FBS/500y g/mLGeneticine/青霉 素 链霉素存在下培养，使用蛋白A柱，按照操作指南从培养上清中纯化人IgGl嵌合抗体。 将已纯化的抗体2L13/TO供给ADCC活性的测定。
[实施例161抗GPR49单克降抗体的ADCC活件的测定利用铬释放法研究对抗人GPR49单克隆抗体中的GPR49强制表达DG44细胞2B10 的ADCC活性。将作为靶细胞的2B10用添加有铬-51的培养液(CHO-S SFM II (Invitrogen 公司制备))培养数小时，之后除去培养液，用培养液清洗细胞，之后将悬浮于新的培养液 中的细胞添加到96孔圆底板中，使达到IX 104个细胞/孔。接着，添加抗体，使最终浓度 达到1 μ g/mL、0. 1 μ g/mL,向各孔中的与靶细胞相比为约5倍量的效应细胞(NK_92(ATCC， CRL-2407)中添加强制表达含有小鼠Fc-γ受体3 (NM_010188)的胞外区和人Y链 (NM_004106)的跨膜区和胞内区的嵌合蛋白的重组细胞(日本特愿2007-20155))，将板在 5% CO2培养箱中、于37°C下静置4小时。静置后将板离心，从各孔中回收一定量的上清，使 用Y射线计数仪Wallac 1480测定放射活性，使用下式求出特异性的铬游离率(％ )。特异性的铬游离率(％) = (A-C) X 100/(B-C)其中，A表示各孔中的放射活性，B表示以终浓度Nonidet P-40进行细胞溶解 后释放到培养基中的放射活性平均值，C表示仅添加培养基时的放射活性平均值。其结果如图11所示，在用于试验的抗人GPR49单克隆抗体中，特别是2TM-2、 2T15E-2、2L13-3、2L36-12 和 2J18scFv_Fc 对人 GPR49 表达细胞 2B10 诱导非常强的 ADCC 活 性。此结果显示抗体治疗对以人GPR49为靶的肿瘤非常有用。测定人IgGl嵌合抗体2L13/TO的ADCC活性时，使用与上述相同的2B10细胞作为 靶细胞，向与靶细胞相比为约5倍量的效应细胞(NK-92(ATCC，CRL-2407)中添加强制表达 人Fc-γ受体3 (NM_000569)的重组细胞(日本特愿2007-20155))，将板在5% CO2培养箱 中、于37°C下静置4小时。静置后将板离心，从各孔中回收一定量的上清，使用Y射线计数 仪Wallac 1480测定放射活性，使用下式算出特异性的铬游离率(％)。其结果如图11所 示，确认2L13/TO对人GPR49表达细胞产生非常高的ADCC活性。[实施例171使用了Mab-Zap的内化所产生的细胞杀伤效果使用结合有名为皂草毒蛋白的毒素的二次抗体、Mab-Zap(AdVanCed Targeting Systems公司制备)作为具有下述作用机理的抗体药物的开发模型，评价对GPR49表达细 胞的杀伤能力，所述作用机理为使毒素等与抗体结合，在细胞内抗体与靶细胞结合后内化 进入细胞内，之后利用缀合毒素的作用杀伤靶细胞。细胞使用诱导表达HA-GPR49的B4、未 诱导表达HA-GPR49的B4细胞。每孔中加入IOOng抗体和IOOng Mab-Zap，在37°C、5% CO2 培养箱中保温3天，之后通过使用活细胞测定试剂SF( t力，4 f 7々公司制备)的WST8 测定分析活细胞数。结果见图12。除2T42E-4、2U2E-2、2U4E-11外，在所分析的抗体中均可 确认到细胞毒活性。[实施例181GST融合蛋白的表达和表位的分析构建缺失突变体的GPR49表达载体，通过WB分析识别40kDa谱带的2U1E-1，结果 表明在第495-537位氨基酸中存在表位。于是，为了缩小范围，作为GST融合蛋白，使第 495-537、495-516、510-529、517-537位的氨基酸与GST蛋白融合并表达。各GST融合蛋白 所含有的GPR49的氨基酸序列见图13。结果如图14所示，使用表达产物的蛋白质印迹法进 行分析，结果表明2U1E-1以517-537的氨基酸区作为表位。另外，同样进行识别40kDa的 2T15E-2抗体的表位分析时，在510-5 的氨基酸区存在表位。该结果表明通过切断而产 生的40kDa的蛋白是含有至少直至第510位氨基酸的序列的分子。
[实施例191抗GPR49单克降抗体与小鼠GPR49的反应件将小鼠GPR49整合到表达载体中，使其在细胞中一过性表达，通过WB分析其 细胞破碎液时，如图15所示，结果表明其与小鼠的GPR49也发生反应。[实施例201利用FACS(流式细胞术)评价结合活件利用流式细胞术分析抗体2Τ15Ε-2与人癌细胞株的反应性。将悬浮于FACS缓冲 液O % FBS/PBS/0. 05 % NaN3)中的人癌细胞株用FACS缓冲液稀释至1 X IO6个细胞/mL，之 后以50 μ L/孔分别注入i^lCOn353910圆底96孔板中。加入浓度稀释至10 μ g/mL的抗体 2T15E-2，使之在冰上反应60分钟。接下来，用FACS缓冲液清洗细胞1次。向加入有细胞 的孔中加入作为二次抗体的山羊F (ab' )2片段抗小鼠IgG (Fe γ)-FITC (Beckman Coulter 公司)，之后使之在冰上反应30分钟。反应后，通过离心除去上清，之后将悬浮于IOOyL 含有PI (碘化丙锭)的FACS缓冲液中的细胞供给流式细胞术。在流式细胞术中使用FACS CalibuH卜> Π 7 # > 乂 >公司)。根据前向角散射(forward scatter)和侧向角 散射(side scatter)的斑点印迹在活细胞集团中设定阈值，取FLl的直方图，评价该集团 中所含的细胞的结合活性。在使用卵巢癌细胞株0VSAH0、肝癌细胞株Alexander、胃癌细胞株NUGC-4的流式 细胞术分析中，与不含一次抗体的峰相比，观察到明显的峰的移动，由此可知在这些细胞 株中GPR49分子存在于细胞膜上(图16)。以实线表示的峰显示与癌细胞株的反应性，阴影 部分则表示在没有抗体的情况下进行反应时的峰。横轴显示结合有FITC的抗体的结合度 所产生的信号的强度，纵轴显示细胞数。产业实用性本发明的GPR49蛋白特异性抗体可以用作胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺 癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等的诊断药。本发明的诊断药对原发性或转移性癌症的 诊断有用。具体而言，通过检测从患者采集的生物样品中所含的GPR49蛋白，可以判定癌症 的可能性。或者，通过检测机体内的GPR49表达细胞的定位，可以检测机体内胃癌、大肠癌、 肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的存在。另外，本发明的具有细胞毒活性的抗GPR49抗体对治疗或预防表达GPR49蛋白的 癌症有用。具体而言，根据本发明，提供胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤 文肉瘤和神经胶质瘤等各种癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂。本发明的癌细胞的细 胞毒性剂或细胞增殖抑制剂还可适用于原发性和转移性的任一种癌。并且，本发明的具有细胞毒活性的抗GPR49抗体可以用作胃癌、大肠癌、肝细胞 癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等各种癌症的治疗药。本发明中，抗 GPR49抗体还可用作原发性和转移性的任一种癌症的治疗药。此外，编码本发明的抗体的基因和通过该基因转化的重组细胞可用于制作发挥上 述效果或更佳效果的重组抗体。
权利要求
1.抗体，该抗体与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性。
2.权利要求1所述的抗体，其中细胞增殖抑制活性为细胞毒活性。
3.权利要求2所述的抗体，其中细胞毒活性为抗体依赖性细胞毒活性。
4.权利要求2所述的抗体，其中细胞毒活性为补体依赖性细胞毒活性。
5.权利要求1 4中任一项所述的抗体，该抗体结合有细胞毒性物质。
6.权利要求5所述的抗体，该抗体具有内化活性。
7.权利要求1 6中任一项所述的抗体，该抗体抑制癌细胞的增殖。
8.权利要求7所述的抗体，其中癌细胞为胃癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、 卵巢癌细胞、尤文肉瘤细胞和神经胶质瘤细胞中的任一种。
9.以下(1) 00)中任一项所述的抗体(1)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO :5记载的氨基酸序列、 作为⑶R2的SEQ ID NO 6记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 7记载的氨基 酸序列；(2)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 10记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO: 11记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:12记载的氨基酸序列；(3)抗体，该抗体含有⑴所述的H链和⑵所述的L链；(4)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 15记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO 16记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:17记载的氨基酸序列；(5)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 20记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :21记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:22记载的氨基酸序列；(6)抗体，该抗体含有⑷所述的H链和(5)所述的L链；(7)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO :25记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO J6记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:27记载的氨基酸序列；(8)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 30记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :31记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:32记载的氨基酸序列；(9)抗体，该抗体含有(7)所述的H链和⑶所述的L链；(10)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 35记载的氨基酸序 列、作为CDR2的SEQ ID NO 36记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO 37记载的氨基酸序列；(11)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO :40记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :41记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:42记载的氨基酸序列；(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(11)所述的L链；(13)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 45记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO 46记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ IDNO 47记载的氨基酸序列；(14)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 50记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :51记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:52记载的氨基酸序列；(15)抗体，该抗体含有(1 所述的H链和(14)所述的L链；(16)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为⑶Rl的SEQIDNO 66记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :67记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:68记载的氨基酸序列；(17)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为⑶Rl的SEQIDNO :71记载的氨基酸序 列、作为⑶R2的SEQ ID NO :72记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID N0:73记载的氨基酸序列；(18)抗体，该抗体含有(16)所述的H链和(17)所述的L链；(19)抗体，该抗体是在(1) (18)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取 代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1) (18)中任一项所述的抗体具有 同等活性；(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1) (18)中任一项所述的抗体所结合的 GPR49蛋白的表位相同。
10.权利要求1 9中任一项所述的抗体，该抗体具有人恒定区。
11.权利要求10所述的抗体，该抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
12.药物组合物，其中含有权利要求1 11中任一项所述的抗体作为有效成分。
13.细胞增殖抑制剂，其中含有权利要求1 11中任一项所述的抗体作为有效成分。
14.抗癌药，其中含有权利要求1 11中任一项所述的抗体作为有效成分。
15.权利要求14所述的抗癌药，其中，癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢 癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。
16.癌症的诊断方法，其特征在于检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因。
17.权利要求16所述的诊断方法，其特征在于检测GPR49蛋白。
18.权利要求17所述的诊断方法，其中GPR49蛋白的检测使用与GPR49蛋白结合的抗 体来进行。
19.癌症的诊断方法，该诊断方法包括以下步骤(a)提供从受试者采集的试样的步骤；(b)使用与GPR49蛋白结合的抗体检测(a)的试样中所含的GPR49蛋白的步骤。
20.癌症的诊断方法，该诊断方法包括以下步骤(a)将与GPR49蛋白具有结合活性、且用放射性同位素标记的抗体给予受试者的步骤；(b)检测上述放射性同位素的累积的步骤。
21.权利要求16 21中任一项所述的诊断方法，其中癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞 癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。
全文摘要
本发明公开了与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性的抗体。细胞增殖抑制活性是指抗体依赖性细胞毒和补体依赖性细胞毒等细胞毒活性。本发明还公开了含有本发明的抗体作为有效成分的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。癌症例如为胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤。本发明进一步公开了通过检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因的表达来诊断癌症的方法、以及用于该方法的诊断药和试剂盒。
文档编号C07K19/00GK102112492SQ20088012502
公开日2011年6月29日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者舟桥真一 申请人:株式会社未来创药研究所