14-3-3η抗体及其用于诊断和治疗关节炎的用途的制作方法

专利名称：14-3-3η抗体及其用于诊断和治疗关节炎的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合14-3-3蛋白之η同工型(isoform)并能够区分η同工 型与其它14-3-3蛋白同工型的抗体。
背景技术：
14-3-3蛋白是在真核生物中普遍表达的保守的细胞内调节分子家族。14-3-3蛋 白能够结合多种功能各异的信号传导蛋白质，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体。事实上，已报 道超过100种信号传导蛋白质为14-3-3之配体。14-3-3蛋白可以被认为是34肽重复超 家族(Tetratrico Peptide R印eatsuperfamily)的演化成员。它们一般具有9或10个 α螺旋，并通常沿其氨基端螺旋形成同二聚体和/或异二聚体相互作用。这些蛋白质含 有多个已知结构域，包括二价阳离子相互作用区域、磷酸化和乙酰化区域以及蛋白质水解 切割区域等。14-3-3蛋白有七种不同基因编码的已知在哺乳动物中表达的同工型，其中 每种同工型包含242 255个氨基酸。所述七种14-3-3蛋白同工型分别称为14_3_3 α / β (alpha/beta)、14-3-3 δ/ξ (delta/zeta)、14_3_3 ε (epsiIon)、14_3_3γ (gamma)、 14-3-3 n (eta)、14-3-3 τ/θ (tau/theta)禾口 14—3—3 σ (sigma/stratifin)。14-3-3蛋白具有高度的序列相似性。因此，抗14-3-3抗体通常识别多于一种 14-3-3蛋白同工型。已经表征的几种抗14-3-3抗体制备物可商购获得。例如，识别14_3_3 蛋白的兔多克隆抗体可从 Biomol, Santa CruzBiotechnology, Upstate Biotechnology, and Assay Designs获得。这些多克隆抗体制备物识别某种形式的14-3-3 η ；但是，它们 并非相对于其它14-3-3蛋白同工型来说选择性针对η同工型。也参见Martin，H.等人 (1993)Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. FEBS331 296-303。还参见2007年5月9日提交的WO 2007/128132。除了缺少同工型选择性之外， 几乎没有14-3-3抗体显示识别天然构型的14-3-3蛋白。已提示14-3-3蛋白参与多种疾病。然而，14-3-3蛋白的普遍存在和功能多样性极 大地妨碍了与多种14-3-3蛋白同工型(“泛14-3-3抗体”)结合和/或不能识别天然构型 14-3-3蛋白之抗体的治疗性应用。此外，已提示特定的14-3-3同工型参与特定的疾病，泛 14-3-3抗体不能在诊断测定中进行确定无疑地检测，并且这些泛14-3-3抗体不能以靶向 方式进行治疗。例如，已提示14-3-3 n和14-3-3 γ参与关节炎。参见2007年5月9日提交 的 W02007/128132。还参见 Kilani 等人(2007，J. Rheum. 34 1650-1657 ；W02007/128132)， 其报道14-3-3蛋白质家族的两个成员(具体为14-3-3 n和14_3_3 γ )存在于关节炎患者 的滑膜液和血清中，并且这些同工型与滑膜液和血清中的MMP-I和ΜΜΡ-3水平直接相关。

发明内容
本发明部分地来自于出人意料的发现尽管14-3-3同工型之间具有高度的序列 同一性，仍可使用选定的14-3-3 η表位来制备针对天然构型14-3-3蛋白η同工型具有选 择性的抗体。特别地，本发明提供了具有如下性质的抗14-3-3蛋白抗体⑴通过例如免 疫沉淀所证明地，特异性结合天然构型的14-3-3 η蛋白；以及(ii)相对于其它14-3-3蛋 白同工型来说，选择性地结合14-3-3 η蛋白。该性质组合使得本发明的抗体区别于现有技 术，并提供了选择性抗14-3-3 n抗体在针对14-3-3 n所参与之疾病的诊断和治疗方法中 的用途。因此，在一个方面中，本发明提供了抗14-3-3 n抗体。本发明的抗14-3-3抗体能 够(i)通过例如天然14-3-3 n的免疫沉淀所证明地，特异性结合天然构型的人14-3-3 n 蛋白；以及(ii)相对于其它的人14-3-3蛋白同工型来说，选择性地结合人14-3-3 η蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 Il抗体能够结合在关节炎中异常定 位于细胞外滑膜腔(synovial space)的14-3-3 η蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 n抗体不与位于人14-3-3 η蛋白N 端的表位结合。在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体能够结合包含选自以下之肽 的表位14-3-3 n环肽、14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽，其中η环肽是尤其优选 的。在一个优选实施方案中，所述14-3-3 n环肽包含选自SEQ ID NO 11-16的氨基酸 序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 n抗体结合与对应于选自SEQ ID NO 11-16之序列的 氨基酸序列重叠的14-3-3 n区域。在一个优选实施方案中，所述14-3-3 n螺旋肽包含选自SEQ ID NO :1_10的氨基 酸序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 η抗体结合与对应于选自SEQ ID N0:l_10之序列 的氨基酸序列重叠的14-3-3 n区域。在一个优选实施方案中，所述14-3-3 n非螺旋肽包含选自SEQ ID NO 17-32的氨 基酸序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 n抗体结合与对应于选自SEQ ID NO 17-32之序 列的氨基酸序列重叠的14-3-3 n区域。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体结合选自 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO 30), KKLEKVKAYR(SEQ ID NO 31)和 KNSWEASEAAYKEA(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。示例性14-3-3 n环、螺旋和非螺旋肽公开于本文表1中。要注意的是，SEQ ID NO 30与对应的14-3-3 n序列的不同在于14-3-3 n序列中的半胱氨酸被丝氨酸所替换以避 免形成二硫键。在一个实施方案中，本发明提供了这样的抗体，其还结合包含半胱氨酸的与 SEQ ID NO :30相关的天然14-3-3序列。在一个实施方案中，本发明提供了能够结合如下 肽序列的抗体，所述肽序列与表1所列肽序列的不同在于用丝氨酸替换半胱氨酸。示例性14-3-3 n环、螺旋和非螺旋肽公开于本文表1中。要注意的是，SEQ ID NO 30与对应的14-3-3 n序列的不同在于14-3-3 n序列中的半胱氨酸被丝氨酸所替换以避 免形成二硫键。在一个实施方案中，本发明提供了这样的抗体，其还结合包含半胱氨酸的与 SEQ ID NO :30相关的天然14-3-3序列。在一个实施方案中，本发明提供了能够结合如下肽序列的抗体，所述肽序列与表1所列肽序列的不同在于用丝氨酸替换半胱氨酸。在一个实施方案中，抗14-3-3 η抗体能够抑制14-3-3 η对MMP的诱导。优选地， 所述 MMP 选自 ΜΜΡ-1、3、8、9、10、11 和 13，尤其优选 ΜΜΡ-1 和 ΜΜΡ-3。在一个方面中，本发明提供了诊断涉及14-3-3 η之疾病和病症的方法。所述方法 包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体来检测14-3-3 η蛋白的变化，例如表达、定位、功能等 的变化。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14-3-3 II抗体进行免疫沉淀。在一 个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体进行ELISA。在一个实施方案中， 检测包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体进行Western印迹。在一个实施方案中，检测包括 将本发明的抗14-3-3 η抗体用于免疫组织化学中。在一个实施方案中，检测包括将本发明 的抗14-3-3 η抗体用于免疫荧光中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η 抗体用于FACS分析中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于放 射性免疫测定中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于试条测试 (strip test)中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于床边检 验(point of care test)中。在一个实施方案中，将检测14_3_3 η与检测另一种疾病标 志物(例如针对关节炎的MMP)联用。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断炎性病症的方法。在一个优选实施 方案中，提供了用于诊断关节炎的方法。包括用于诊断选自以下之疾病的方法强直性 脊柱炎、白塞病(Beh$et，S Disease)、弥漫性特发性骨肥厚症(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis，DISH)、埃—当综合征(Ehlers-Danlos Syndrome，EDS)、费尔 蒂综合征(Felty’s Syndrome)、纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、 混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)、骨关节炎、佩吉特病 (Paget' sDisease)、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现 象(Raynaud’ s Phenomenon)、反应性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征 (Sj5gren，S Syndrome)、斯蒂尔病(Still，s Disease)和韦格纳肉芽肿病(Wegener，s granulomatosis)。在一个实施方案中，所述方法包括检测患者的滑膜液、血浆或血清中的14-3-3 n 蛋白。在一个实施方案中，通过使用本发明的抗14-3-3 η抗体对来自滑膜液、血浆或血清 的14-3-3 n蛋白进行免疫沉淀来进行检测。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗 14-3-3 n抗体进行ELISA。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14_3_3 n抗体对 包括来自患者的滑膜液、血浆或血清的样品进行Western印迹。在一个实施方案中，检测包 括使用放射性免疫测定。在一个实施方案中，检测包括使用试条测试。在一个实施方案中， 检测包括使用床边检验。在一个实施方案中，将检测14-3-3 n与检测另一种关节炎标志物 (例如，MMP、抗CCP抗体、抗RF抗体和/或CRP)联用。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断神经性病症的方法。在一个优选实施 方案中，提供了用于诊断选自细菌性脑膜炎和克-雅病(Creutzfeldt Jakob disease)之 疾病的方法。在一个方面中，本发明提供了用于治疗涉及14-3-3 n之疾病的方法。所述方法包 括向患者施用治疗有效量的本发明抗14-3-3 η抗体。在一些实施方案中，所述方法包括联 合治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗炎性病症的方法。在一个优选实施方案中， 提供了用于治疗关节炎的方法。包括治疗选自以下疾病的方法强直性脊柱炎、白塞病、弥 漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌痛、痛风、感染性 关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特病、风湿性多肌 痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类风湿性关节炎、 硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个实施方案中，所述方法包括联合治疗，其中除了施用一种或多种本发明抗 14-3-3 11抗体之外还施用至少一种另外的治疗剂。在一个优选实施方案中，所述治疗剂 选自改变病因的抗风湿药物(disease-modifyingantirheumatic drug, DMARD)、改变病 因的骨关节炎药物(diseasemodifying osteoarthritis drug, DMOAD ；例如参见 Loeser， Reumatologia，21 104-106，2005)、抗 TNF α 抗体、抗 IL-1 抗体、抗 CD4 抗体、抗 CTLA4 抗 体、抗CD20抗体、抗IL-6抗体、来氟米特、柳氮磺吡啶和甲氨蝶呤。在一个方面中，本发明提供了用于预防涉及14-3-3 η之病症发生的预防性方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于在具有发生炎性疾病风险的对象中预防炎 症疾病发生的预防性方法。在一个优选实施方案中，提供了在具有发生关节炎风险的对象 中预防关节炎的预防性方法。包括预防选自以下疾病的预防性方法强直性脊柱炎、白塞 病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌痛、痛风、感 染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特病、风湿性 多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类风湿性关 节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。所述方法包括向对象施用本发 明的抗14-3-3 η抗体。在一个实施方案中，所述抗14-3-3 η抗体作为本文所述联合疗法 的组分进行施用。在一个方面中，本发明提供了监测涉及14-3-3 η之疾病的治疗的方法。所述方法 包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体测定患者样品中14-3-3 η的水平，以及监测进行治疗 的患者中14-3-3 η的水平。在一个实施方案中，本发明提供了用于监测炎性病症之治疗的方法。在一个优选 实施方案中，提供了用于监测关节炎治疗的方法。包括用于监测选自以下之疾病的治疗的 方法强直性脊柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂 综合征、纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨 关节炎、佩吉特病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反 应性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个方面中，本发明提供了用于确定患者对涉及14-3-3 11之疾病的治疗的响 应潜力的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体测定患者 样品中的14-3-3 η水平。在一个优选实施方案中，将患者样品中的14-3-3 η水平与来自 已知能够响应于治疗之对象的样品中的14-3-3 η水平进行比较。在一个实施方案中，本发明提供了用于确定患者对炎性疾病之治疗的响应潜力的 方法。在一个优选实施方案中，提供了用于确定患者对关节炎治疗的响应潜力的方法。包 括用于确定对选自以下疾病之治疗的响应潜力的方法强直性脊柱炎、白塞病、弥漫性特发 性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特病、风湿性多肌痛、多肌炎 和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍 格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个方面中，本发明提供了用于区分涉及14-3-3 η之疾病亚型的方法。在一个实施方案中，提供了用于区分炎性疾病亚型的方法。在一个优选实施方案 中，提供了用于区分关节炎亚型的方法。包括用于区分选自以下之疾病的方法强直性脊 柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌 痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特 病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类 风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个实施方案中，所 述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体测定患者样品中的14-3-3 η水平。在一个优选 实施方案中，将患者样品中的14-3-3 11水平与来自炎性疾病或预后亚型已知的对象之样 品中的14-3-3 η水平进行比较。在一个方面中，本发明提供了用于减少由外伤引起的关节损伤的方法。所述方法 包括向具有外伤受损关节的对象施用本发明的抗14-3-3 η抗体。在一个实施方案中，所述 抗14-3-3 η抗体作为本文所述联合治疗的组分来施用。在一个方面中，本发明提供了降低MMP表达的方法。在一个实施方案中，待降低的 MMP表达是在滑膜中。所述方法包括向存在产生MMP之细胞的组织或区室递送本发明的抗 14-3-3 η抗体，其中产生MMP的细胞响应于14-3-3 η蛋白。可以直接或间接地递送至受影 响组织或区室。在一个优选实施方案中，所述响应细胞是成纤维细胞或FLS细胞。在一个优选实施方案中，待降低的MMP表达是与关节炎相关的MMP表达。在一个优选实施方案中，待降低的MMP表达是选自以下MMP的表达:ΜΜΡ_1、3、8、9、 10、11和13。在一个特别优选的实施方案中，待降低的MMP表达是MMP-I或ΜΜΡ-3的表达。在一个方面中，本发明提供了抑制14-3-3 n蛋白对MMP之诱导的方法。抑制可以 是部分的或完全的。所述方法包括向存在产生MMP之细胞的组织或区室递送本发明的抗 14-3-3 n抗体，其中所述产生MMP的细胞响应于14-3-3 η蛋白。可以直接或间接递送至受 影响组织或区室。在一个优选实施方案中，将所述抗14-3-3 η抗体施用到滑膜。在一个优 选实施方案中，所述响应细胞是成纤维细胞或FLS细胞。在一个优选实施方案中，待抑制的MMP诱导是对在关节炎中上调之MMP的诱导。在一个优选实施方案中，待抑制的MMP诱导是对选自以下MMP的诱导ΜΜΡ_1、3、8、 9、10、11和13。在一个特别优选的实施方案中，待抑制的MMP诱导是MMP-I或ΜΜΡ-3的诱导。在一个方面中，本发明提供了降低对象中关节肿胀的方法。所述方法包括向受影 响对象施用本发明的抗14-3-3 n抗体。在一个方面中，本发明提供了降低对象中软骨降解的方法。所述方法包括向受影 响对象施用本发明的抗14-3-3 n抗体。在一个方面中，本发明提供了降低对象中骨降解的方法。所述方法包括向受影响 对象施用本发明的抗14-3-3 n抗体。在一个方面中，本发明提供了降低滑膜液中促炎细胞因子积累的方法。所述方法包括向受影响对象施用本发明的抗14-3-3 η抗体。对于涉及向受影响对象施用抗14-3-3 η抗体的方法，在一个优选实施方案中，使 用囊内递送。在另一实施方案中，使用系统性递送。配制治疗性组合物，并施用以使得这样 递送的抗14-3-3 η抗体可结合位于细胞外的14-3-3 η蛋白。在一个方面中，本发明提供了可用于诊断涉及14-3-3 11的疾病或者确定受涉及 14-3-3 n之疾病影响的患者之预后的试剂盒。在一个方面中，本发明提供了可用于治疗涉及14-3-3 n之疾病的药物组合物。所 述药物组合物包含本发明的抗14-3-3 η抗体。在一个优选实施方案中，提供了可用于治疗 关节炎的药物组合物。在一个方面中，本发明提供了制备可用于治疗涉及14-3-3 11之疾病的药物的方法。


图1. ELISA 小鼠抗AUG1-CLDK免疫血清(第二次加强后)针对AUGl-CLDK-BSA抗 原的测试血液效价(仅IgG应答)。图2. ELISA 小鼠抗AUG2-KKLE免疫血清(第二次加强后)针对AUG2-KKLE-BSA抗 原的测试血液效价(仅IgG应答)。图3. ELISA 小鼠抗AUG3-CKNS免疫血清(第二次加强后)针对AUG3-CKNS-BSA抗 原的测试血液效价(仅IgG应答)。图4.多种14-3-3蛋白同工型的序列比对。图5. Western印迹，显示市售14_3_3 η多克隆抗体与7种14_3_3蛋白同工型的 交叉反应性。图6. Western印迹，显示由针对人全长重组14_3_3 η产生之单克隆抗体免疫沉淀 的来自细胞裂解物之14-3-3 n蛋白和人重组14-3-3 n。图7. Western印迹，显示由针对来自所述蛋白质非螺旋区的人14-3-3 η肽片段 142-158SEQ ID NO :24产生之单克隆抗体免疫沉淀的来自细胞裂解物之14_3_3 η蛋白和 人重组14-3-3 n。图8. ELISA 小鼠抗14_3_3 η免疫血清(第二次加强后)针对14_3_3 η抗原的 测试血液效价(仅IgG应答)。发明详述如果抗体或其抗原结合片段以可检出水平(例如在ELISA测定中)与配体反应， 并且在相似条件下不与无关配体可检出地反应，则称抗体或其抗原结合片段与配体“特异 性结合”、“免疫结合”和/或“免疫反应”。本文所用的免疫结合一般是指发生在免疫球蛋白分子与该免疫球蛋白特异性的 抗原之间的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离 常数(Kd)来表示，其中较小的Kd表示较大的亲和力。可使用本领域公知的方法对免疫结合 特性进行定量。例如，参见 Davies 等人(1990)Annual Rev. Biochem. 59 :439_473。“抗体”是指包含特异性结合相应抗原之蛋白质的组合物，并且其具有免疫球蛋白 的一般共同结构。术语“抗体”特别地包括多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。抗 体可以是鼠源的、人源的、人源化的、嵌合的或者源自其它物种。通常，抗体会包含由二硫键 相互连接的至少两个重链和两个轻链，当它们组合时形成与抗原相互作用的结合结构域。 每个重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包括三个结构域——CHU CH2和CH3，并且可以为μ、δ、γ、α和ε同种型。类似地，轻链包含轻链可变区(VL)和 轻链恒定区(CL)。轻链恒定区包含一个结构域构成——CL，其可以为κ或λ同种型。VH 和VL区域还可进一步细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其被称为框架区(FR)的较 保守区域间隔开。每个VH和VL包含3个⑶R和4个FR，从氨基端至羧基端以下列顺序排 列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结 合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细 胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。重链恒定区介导免疫球 蛋白与宿主组织或宿主因子的结合，特别是通过细胞受体(例如Fc受体(例如，FcyRI, FcyRILFCYRIII等))的结合。如本文所用，抗体还包括免疫球蛋白中保留了结合抗原 之能力的抗原结合部分。这些包括例如F(ab)——VL CL和VH CH抗体结构域的单价片段； 和F(ab' )2片段——包含由铰链区二硫键相连的两个Fab片段的二价片段。术语“抗体” 还指重组的单链Fv片段(scFv)和双特异性分子，例如双抗体、三抗体和四抗体(参见例如 美国专利 No. 5,844，094)。抗体可以多种形式制备和使用，包括抗体复合物。本文使用的术语“抗体复合物” 是指一种或多种抗体与另一抗体或者与抗体片段的复合物，或者是两种或更多种抗体片段 的复合物。抗体复合物包括多聚形式的抗14-3-3抗体，例如如本发明所述的同缀合物和异 缀合物以及其它交联抗体。“抗原”作广义理解，其是指可特异性结合抗体的任何分子、组合物或颗粒。抗原具 有一个或多个与抗体相互作用的表位，尽管其不一定诱导该种抗体的产生。术语“交联”及其语法上的等同形式是指两个或更多个抗体结合形成抗体复合物， 也可称为多聚化。交联或多聚化包括两个或更多个同样抗体的结合(例如，同二聚化)，以 及两个或更多个不同抗体的结合(例如，异二聚化)。本领域技术人员还会了解，交联或多 聚化也称为形成抗体同缀合物和抗体异缀合物。这样的缀合物可包括同一克隆来源的两个 或更多个单克隆抗体的结合(同缀合物)或者两个或更多个不同克隆来源的抗体的结合 (也称为异缀合物或双特异性)。抗体可通过非共价或共价结合进行交联。本领域技术人 员会了解适于交联的多种技术。可通过使用特异性针对第一抗体种类的第二抗体来实现非 共价结合。例如，可使用山羊抗小鼠(goat anti-mouse, GAM)第二抗体来交联小鼠单克隆 抗体。可通过使用化学交联物来实现共价结合。“表位”是指能够特异性结合抗体的决定簇。表位是通常存在于分子表面上并且有 机会与抗体相互作用的化学特征。典型的化学特征是具有三维结构特征以及包括电荷、亲 水性和亲脂性等化学性质的氨基酸和糖部分。构象表位与非构象表位的不同在于其在分 子的空间要素变化而没有任何内在化学结构的变化时丧失与抗体的反应性。“人源化抗体”是指尽可能少地含有源自非人免疫球蛋白之序列的免疫球蛋白分 子。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的 残基被具有所需特异性、亲和力和容量的来自非人物种例如小鼠、大鼠或兔的CDR(供者抗体)的残基替换。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替换。 人源化抗体还可包含在受者抗体或者所引入的CDR或框架序列中均不存在的残基。一般 地，人源化抗体会包含至少一个以及通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本上 全部的CDR区域对应于非人免疫球蛋白中的那些，全部或基本上全部的框架(FR)区是人免 疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗体还涵盖包含免疫球蛋白恒定区(Fe)之至少一部 分(其一般是人免疫球蛋白的)的免疫球蛋白(Jones等人，Nature 321 =522-525(1986)； Reichmann 等人，Nature 332 :323_329 (1988))。“免疫原”是指刺激产生免疫应答的物质、化合物或组合物。术语“免疫球蛋白基因座”是指这样的遗传元件或者一组连锁的遗传元件，其包含 B细胞或B细胞前体可利用来表达免疫球蛋白多肽的信息。该多肽可以是重链多肽、轻链多 肽或者重链和轻链多肽的融合物。在未经重排基因座的情形中，B细胞前体对遗传元件进 行组装以形成编码免疫球蛋白多肽的基因。在经重排基因座的情形中，基因座内包含编码 免疫球蛋白多肽的基因。“同种型(isotype)”是指由重链恒定区定义的抗体类别。重链一般分为Y、μ、 α、δ、ε，并命名为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每个同种型内的差异又将其分为多种亚型， 例如IgG的亚型分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，而IgA分为IgAl和IgA2。IgY同种型是鸟 类特有的。“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子制备物。单 克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。术语“人单克隆抗体”包括具有来源于人免疫球蛋白序列的可变区和/或恒定区 (如果存在的话)的显示单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由这样 的杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的、具有包含人重链转基因和轻链转基 因之基因组的、从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞。“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体VH和VL区域的抗体，其中这些结构域存在于 单个多肽链中。通常，scFv还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成抗原 结合的所需结构。“对象”和“患者”可互换使用，其是指哺乳动物例如人和非人灵长类以及兔、大鼠、 小鼠、山羊、猪以及其它哺乳动物物种，另有指明除外。“重组抗体”是指所有通过重组技术产生的抗体。这些包括从免疫球蛋白基因座为 转基因的动物获得的抗体、从重组表达载体表达的抗体以及通过将任意免疫球蛋白基因序 列剪接成任何其它核酸序列而产生、制备和表达的抗体。抗14-3-3 抗体在一个方面中，本发明提供了抗14-3-3 η抗体。本发明的抗14-3-3 η抗体能够 (i)通过例如免疫沉淀所证明地，特异性结合天然构型的人14-3-3 η蛋白，以及(ii)相对 于其它的人14-3-3蛋白同工型来说，选择性结合人14-3-3 n蛋白。特异性结合“天然构型”的人14-3-3 n蛋白意指有如在体内接触时结合14-3-3蛋 白的能力。这可例如通过抗体对来自生物样品的14-3-3 η蛋白进行免疫沉淀的能力来证 明。“相对于其它的人14-3-3蛋白同工型来说，针对所述人14-3-3 η蛋白的选择性”意指在同样的条件下，与其它的人14-3-3蛋白同工型相比，特异性结合人14-3-3 η蛋白 并优先结合14-3-3 η的能力。可例如使用ELISA测定来证明选择性，该测定可使用例如 杂交瘤克隆的上清液来进行。优选使用对照(例如免疫前血清)。“选择性”抗体能够识别 14-3-3 η，并且与其它的14-3-3同工型相比产生更高的针对14_3_3 η的信号，优选相比于 其它同工型高出至少1.5倍的信号，更优选高出至少2倍的信号。在一个优选实施方案中， 相比于其它14-3-3同工型，选择性抗体能够选择性免疫沉淀14-3-3 η。在一个优选实施方案中，所述抗14-3-3 η抗体显示出相比于人14-3-3 α、β、δ、 ε、Y、τ和ξ蛋白来说针对所述人14-3-3 11蛋白的选择性。这可例如通过ELISA来证 明。在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体能够结合在关节炎中异常定 位于细胞外滑膜腔中的14-3-3 η蛋白。这可通过例如对存在于关节炎患者之滑膜液样品 中的14-3-3 η蛋白进行免疫沉淀来证明。在一个优选实施方案中，抗14-3-3 η抗体能够抑制14-3-3 η对MMP的诱导。优选 地，所述MMP选自MMP-1、3、8、9、10、11和13，特别优选MMP-1和ΜΜΡ-3。该能力可通过体外测 定或体内测定来确定。如本领域技术人员所了解地，设计该测定使得在不存在抗14-3-3 η 抗体时，14-3-3 η的存在会导致MMP诱导。降低14-3-3 η对MMP之诱导的能力可证明抗 14-3-3抗体的该功能抑制能力。14-3-3 η 表位在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体不结合14-3-3 ηΝ端的表位。 14-3-3 η 的 “N 端”是指 1-12 位氨基酸(即，DREQLLQRARLA (SEQ ID NO :33))。在一个优选实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体能够结合包含选自以下肽的 表位14-3-3 η环肽、14-3-3 η螺旋肽和14-3-3 η非螺旋肽，其中η环肽是特别优选的。 参见本文表1。示例性的14-3-3 η环、螺旋和非螺旋肽公开于本文表1中。要注意的是， SEQ ID NO 30与对应的14_3_3 n序列的不同在于14_3_3 n序列中存在的半胱氨酸被丝 氨酸所替换，以避免形成二硫键。在一个实施方案中，本发明提供了这样的抗体，其还结合 与SEQ ID NO :30相关的包含半胱氨酸的天然14_3_3序列。在一个实施方案中，本发明提 供了能够结合如下肽序列的抗体，所述肽序列与表1所列肽序列的不同在于用丝氨酸替换 半胱氨酸。(i)环肽在一个优选实施方案中，所述14-3-3 n环肽包含选自SEQ ID NO 11-16的氨基酸 序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 n抗体结合与对应于选自SEQ ID NO 11-16之序列的 氨基酸序列重叠的14-3-3 n区域。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体结合选自以下的氨基酸 序列LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO :30)、KKLEKVKAYR(SEQ ID NO :31)和 KNSWEASEAAYKEA(SEQ ID NO 32)。(ii)螺旋肽在一个优选实施方案中，所述14-3-3 n螺旋肽包含选自SEQ ID NO :1_10的氨基 酸序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 η抗体结合与对应于选自SEQ ID N0:l_10之序列 的氨基酸序列重叠的14-3-3 n区域。
(iii)非螺旋肽在一个优选实施方案中，所述14-3-3 η非螺旋肽包含选自SEQ ID NO 17-32的氨 基酸序列。在另一实施方案中，抗14-3-3 η抗体结合与对应于选自SEQ ID NO 17-32之序 列的氨基酸序列重叠的14-3-3 η区域。单克隆抗体、杂交瘤及其制备方法在一个实施方案中，本发明提供了抗14-3-3 η抗体，其为抗14_3_3 η单克隆抗 体。还提供了能够产生此类抗体的杂交瘤细胞系。还提供了用于产生此类杂交瘤的方法以 及产生此类抗体的方法。所提供的抗14-3-3 η单克隆抗体包括与本文所述14-3-3 η环、螺旋和非螺旋肽 结合的抗体。在一个方面中，本发明提供了通过融合来源于小鼠的脾细胞而产生的杂交瘤，其 中所述小鼠用包含14-3-3 η环、螺旋或非螺旋肽的免疫原进行免疫。还提供了此类杂交瘤 产生的单克隆抗体。本发明还提供了产生这些单克隆抗体或其衍生物的方法，包括在合适条件下培养 本发明的杂交瘤，由此产生单克隆抗体，并从细胞和/或细胞培养基获得抗体和/或其衍生 物。本领域技术人员可容易地制备抗体。由杂交瘤制备单克隆抗体的一般性方法 已是本领域公知的。参见例如Μ. Schreier等人，HybridomaTechniques (Cold Spring Harbor Laboratory) 1980 ；Hammerling 等 人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier Biomedical Press)1981。在一些实施方案中，这些方法包括在合适条件下培养产生所述抗体的杂交瘤细 胞，以及从所述细胞和/或细胞培养基获得抗体和/或其衍生物。本发明还考虑到使用噬菌体文库来筛选能够结合本文所述之目的14-3-3肽的抗 体。例如参见 Konthur 等人，Targets, 1 :30_36，2002。可通过本领域技术人员已知的方法来纯化通过任意方法制备的抗体。纯化方法 包括选择性沉淀、液相色谱、HPLC、电泳、色谱聚焦和多种亲和技术等。选择性沉淀可使用 硫酸铵、乙醇(Cohn沉淀)、聚乙二醇或其它本领域可用的试剂。液相色谱介质包括离子 交换介质DEAE、聚天冬氨酸、羟磷灰石、尺寸排阻(例如，基于交联琼脂糖、丙烯酰胺、葡聚 糖等的尺寸排阻)、疏水性基质(例如Blue S印harose)。亲和技术通常依赖于与免疫球 蛋白Fc结构域相互作用的蛋白质。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的蛋 白A可用于纯化基于人Y 1、Y 2或γ 4重链的抗体(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62 1-13 (1983))。来自C群和G群链球菌的蛋白G可用于所有小鼠同种型和人Y 3 (Guss等人， EMBO J. 5 15671575 (1986))。蛋白 L (一种大消化链球菌(P印tostr印tococcusmagnus)细 胞壁蛋白质，其通过κ轻链相互作用与免疫球蛋白(Ig)结合(BD Bioscience/ClonTech. Palo Alto, CA)可用于Ig亚类IgM、IgA、IgD、IgG、IgE和IgY的亲和纯化。这些蛋白质的 重组形式也有市售。如果所述抗体含有金属结合残基(例如构建成含有组氨酸标签的噬菌 体展示抗体)，可使用金属亲和色谱法。当有足够量的特异性细胞群可用时，可用细胞制备 抗原亲和基质以提供纯化所述抗体的亲和方法。在一个优选实施方案中，分离包括使用14-3-3 η或其片段的亲和色谱法。
本发明提供了本文所述的抗体，以及相应的抗体片段和抗原结合部分。所有这些 都涵盖在术语“抗14-3-3 η抗体”中。本文所用的本发明术语“抗体片段”或抗体的“抗 原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留了特异性结合抗原能力的一个或多个抗体片 段。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来实现。术语“抗体片段”或抗体的 “抗原结合部分”所涵盖的结合片段实例包括(i)Fab片段——由VL、VH、CL和CHl结构域 组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段——包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二 价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂上的VL和VH结构 域组成的 Fv 片段，(ν) dAb 片段(例如，Ward 等人，(1989)Nature 341 :544_546)，其由 VH 结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)，和(vii)双特异性单链Fv 二聚体(例如PCT/ US92/09965)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但可以通过 合成的接头使用重组方法将它们连接，所述接头使得它们能够制备成单个蛋白质链，其中 VL和VH区域对形成单价分子(称为“单链Fv (scFv) ”；参见例如Bird等人(1988) Science 242 423-426 ；以及 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883)。这样的 单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规 技术获得这些抗体片段，使用与完整抗体同样的方式筛选片段。可对所述抗体片段进行修 饰。例如，可通过整合入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定所述分子(Reiter等人，1996， Nature Biotech. 14 1239-1245)。可将免疫球蛋白分子切割成片段。所述分子的抗原结合区域可分为F(ab' )2或 Fab片段。F(ab' ) 2片段是二价的，可用于Fc区域是不期望的或不需要的特征时。Fab片 段是单价的，可用于抗体对其抗原具有非常高的亲和力时。从抗体中去除Fc区域降低了 Fc 区域与具有Fc受体之细胞之间的非特异性结合。为了得到Fab或F(ab' )2片段，用酶消 化抗体。在免疫球蛋白分子的铰链区进行切割的蛋白酶保留了连接Fab结构域的二硫键， 使它们在切割后仍连在一起。适于此目的的蛋白酶是胃蛋白酶。为产生Fab片段，选择蛋白 酶以使得切割发生在含有连接重链之二硫键的铰链区以上，但其仍保留了连接重链和轻链 的完整二硫键。适于制备Fab片段的蛋白酶是木瓜蛋白酶。通过上述方法纯化所述片段， 需要完整Fc区域的亲和方法除外(例如蛋白A亲和色谱法)。可通过抗体的有限蛋白水解产生抗体片段，其称为蛋白水解抗体片段。这些包括 但不限于F(ab' ) 2片段、Fab'片段、Fab' -SH片段和Fab片段。通过将抗体有限暴露于 蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或无花果蛋白酶)而从抗体释放“F(ab' )2片段”。F(ab' )2 片段包含两个“臂”，其中每个臂均包含针对共同抗原并与其特异性结合的可变区。两个 Fab'分子通过重链铰链区中的链间二硫键连接；所述Fab'分子可以针对相同(二价)或 不同(双特异性)的表位。“Fab'片段”含有单个抗原结合结构域，其包含Fab以及穿过铰 链区的额外重链部分。“ Fab' -SH片段”通常由F(ab' ) 2片段制备，其在F (ab ‘ )2片段 中由H链之间的二硫键连接在一起。用弱还原剂(例如但不限于，巯基乙胺)处理，断 裂二硫键，继而从一个F(ab' ) 2片段释放两个Fab'片段。Fab' -SH片段是单价且单特 异性的。“Fab片段”(即含有抗原结合结构域并包含轻链和由二硫键桥连之部分重链的抗 体片段)可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生。简便的方法是使用固定于树脂上的木瓜 蛋白酶，从而可容易地除去所述酶并终止消化。Fab片段不具有F(ab' )2片段中存在的H 链之间的二硫键。
“单链抗体”是一类抗体片段。术语“单链抗体”常缩写为“scFv”或“sFv”。这些 抗体片段使用DNA重组技术制备。单链抗体由多肽链组成，所述多肽链包含Vh和\结构 域，其相互作用以形成抗原结合位点。所述Vh和\结构域通常由10 25个氨基酸残基的 肽连接。术语“单链抗体”还包括但不限于二硫键连接的Fv(dSFv)，其中两个单链抗体 (每个可针对不同的表位)通过二硫键连接在一起；双特异性sFv，其中具有不同特异性的 两个独立的scFv通过肽接头相连；双抗体(当第一 sFv的Vh结构域与第二 sFv的\结构域 组装以及所述第一 sFv的\结构域与所述第二 sFv的Vh结构域组装时形成的二聚化sFv ； 双抗体的两个抗原结合区域可针对相同或不同的表位)；以及三抗体(三聚化sFv，以类似 于双抗体的方式形成，只是其中在单个复合物中形成三个抗原结合结构域；所述三个抗原 结合结构域可针对相同或不同的表位)。“互补决定区肽”或“CDR肽”是另一种抗体片段形式。在一个实施方案中，本发明 提供了这样的⑶R肽。在一个优选实施方案中，此类⑶R肽用作14-3-3 η拮抗剂。⑶R肽 (也称为“最小识别单位”)是对应于单个互补决定区(OTR)的肽，并且可通过构建编码目 的抗体之CDR的基因来制备。例如通过使用聚合酶链式反应从产生抗体之细胞的RNA合成 可变区来制备这些基因。参见，例如Larrick等人，Methods :A Companion toMethods in Enzymology 2 :106，1991。在“经半胱氨酸修饰的抗体”中，通过基因操作将半胱氨酸插入或替换于抗体表面 上，用于将所述抗体与另一分子通过例如二硫桥进行缀合。抗体的半胱氨酸替换或插入已 有描述(参见美国专利No. 5，219，996)。将Cys残基引入IgG抗体恒定区中用于抗体之位 点特异性缀合的方法描述于Stimmel等人(J. Biol. Chem 275 =330445-30450,2000)。本公开内容还提供了人源化和非人源化的抗体。人源化形式的非人(例如小鼠) 抗体是尽可能少地含有来源于非人免疫球蛋白之序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是非 人抗体，其可变结构域框架区替换为人抗体中存在的序列。人源化抗体可以是这样的人免 疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者高变区的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或 非人灵长类)的具有期望特异性、亲和力和容量的高变区(供者抗体)的残基所替换。在 一些情形中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基所替换。此外，人源化抗 体可包含在受者抗体或供者抗体中均不存在的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体的性 能。一般地，人源化抗体会包含至少一个以及通常两个可变结构域的基本上全部，其中全 部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白中的高变环，并且全部或基本上全部的FR 是人免疫球蛋白序列中的FR。任选地，人源化抗体还会包含至少部分的免疫球蛋白恒定区 (Fe)(通常是人免疫球蛋白的Fe)。—般地，在人源化抗体中，除⑶R以外的整个抗体均由人源的多核苷酸编码，或者 除了⑶R以外均与此抗体一致。将⑶R(其中一些或全部由非人生物来源之核酸编码)“嫁 接”于人抗体可变区的片层框架，产生特异性由所“嫁接”⑶R决定的抗体。这些抗体 的产生描述于例如 W092/11018，Jones，1986，Nature 321 :522_525，Verhoeyen 等人，1988， Science239 =1534-1536中。人源化抗体还可使用具有遗传改造之免疫系统的小鼠来得到， 例如 Roque 等人，2004，Biotechnol. Prog. 20 :639_654。在效应物功能方面对本发明抗体进行修饰可以是理想的。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区域，从而允许在该区域中形成链间二硫键。还可使用异双功能交联剂来制 备同二聚化抗体，例如Wolff等人CancerResearch, 53 =2560-2565 (1993)。或者，可改造 抗体使其具有两个Fc区域。参见例如，Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design, 3 219-230(1989)。经修饰抗体在一个实施方案中，本发明提供了抗14-3-3 η抗体，其为经修饰的抗体。经修饰 抗体包括如本文所述的重组抗体。本领域技术人员会了解多种类型的经修饰抗体或重组抗体。合适类型的经修饰或 重组抗体包括但不限于经改造单克隆抗体(例如嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体)、 结构域抗体(例如Fab、FV、VH、ScFV和dsFv片段)、多价或多特异性抗体(例如双抗体、微 抗体(minibody)、微抗体(miniantibody)、(scFv) 2、三抗体和四抗体)以及如本文所述的 抗体缀合物。在一方面中，本发明提供了作为结构域抗体的抗14-3-3 η抗体。“结构域抗体”是 抗体的功能性结合结构域，其对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗 体可具有约13kDa的分子量或者小于完整抗体大小的十分之一。它们在多种宿主中很好 地表达，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统。另外，结构域抗体高度稳定，并且甚至在经 历严苛条件(例如冷冻干燥或热变性)之后仍保持活性。参见例如，美国专利6，291，158 ； 6，582，915 ；6，593，081 ；6，172，197 ；美国序列号 No. 2004/0110941 ；欧洲专利 0368684 ；美 国专利 6，696，245、W004/058821、W004/003019 和 W003/002609。在一个实施方案中，本发 明的结构域抗体是单结构域。单结构域抗体可如例如美国专利No. 6，248，516中所述来制 备。在另一方面中，本发明包括多特异性抗体。多特异性抗体包括双特异性、三特异性 抗体等。双特异性抗体可通过重组手段制备，例如通过使用亮氨酸拉链部分(即，来自Fos 和Jun蛋白，其优先形成异二聚体；例如Kostelny等人，1992，J. Immnol. 148 1547)或者其 它锁钥相互作用结构域结构来实现，例如美国专利No. 5，582，996中所述。其它可用的技术 包括美国专利No. 5，959，083和美国专利No. 5，807，706中所述的技术。双特异性抗体有时也称为“双抗体”。它们是与两种(或更多种)不同抗原结合的 抗体。本领域中还已知三抗体(三聚化sFv，以类似于双抗体的形式形成，只是其中在单个 复合物中形成三个抗原结合结构域；所述三个抗原结合结构域可针对相同或不同表位)或 四抗体(在单个复合物中形成四个抗原结合结构域，其中所述四个抗原结合结构域可针对 相同或不同表位)。双抗体、三抗体或四抗体可采用本领域中已知的各种方法来制备(例如 Holliger 和 Winter, 1993，Current Opinion Biotechnol. 4 :446_449)，例如化学方法制备 或者从杂交瘤制备。另外，这些抗体及其片段可通过基因融合来构建(例如，Tomlinson等 人，2000，Methods Enzymo 1. 326 461-479 ；W094/13804 ；HolIiger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :6444_6448)。在另一实施方案中，本发明提供了微抗体，其是最小化的抗体样蛋白质，包含与 CH3结构域连接的scFv(其来源于抗14-3-3 η抗体)。微抗体可如本领域中所述来制备 (例如，Hu 等人，1996, Cancer Res. 56 3055-3061)。在另一实施方案中，本发明提供了 14-3-311结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白可包含与免疫球蛋白铰链区多肽融合的14-3-3 11 结合结构域多肽，所述铰链区多肽与融合了免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽的免疫球蛋 白重链CH2恒定区多肽融合。在本发明中，14-3-3抗体融合蛋白可通过本领域技术人员 所了解的方法来制备(参见例如，公开的美国专利申请No. 20050238646、20050202534、 20050202028、2005020023、2005020212、200501866216、20050180970 和 20050175614)。在另一实施方案中，本发明提供了来源于抗14-3-3 η抗体的重链蛋白。已利用 天然重链抗体(例如不具有轻链的骆驼抗体)开发抗体衍生的治疗性蛋白质，其通常保 留了天然重链抗体的结构和功能性质。它们在本领域中称作“纳米抗体(nanobody)”。可 通过本领域技术人员了解的方法来制备来源于抗14-3-3 11重链抗体的重链蛋白(参见 例如，公开的美国专利申请 No. 20060246477、20060211088、20060149041、20060115470 和 20050214857)。此外，有关在轻链缺陷型小鼠中生产仅含重链的抗体，参见例如Zou等人， JEM, 204 :3271-3283，2007。在一个实施方案中，本发明提供了作为人抗体的经修饰抗14-3-3 η抗体。在一 个实施方案中，提供了全人14-3-3抗体。“全人抗体”是指仅具有来源于人染色体之抗体 基因序列的人抗体。所述抗14-3-3全人抗体可通过使用产生人抗体的小鼠的方法获得， 所述小鼠具有含人抗体重链和轻链基因的人染色体片段[参见例如，Tomizuka, K.等人， Nature Genetics, 16，133-143 页，1997 ;Kuroiwa，Y.等人，Nuc. Acids Res.，26，3447-3448 页，1998 ;Yoshida, H.等人，Animal Cell Technology :Basic and Applied Aspects 卷 10,69-73 页(Kitagawa, Y. , Matuda, Τ.禾口 Iijima, S.编)，Kluwer AcademicPub 1 ishers, 1999 ；Tomizuka, K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000]；或者通过用 选择人抗体文库的噬菌体展示获得人抗体的方法获得(参见例如，fformstone, I. M.等 人’ Investigative Ophthalmology &Visual Science. 43(7),2301-8 页，2002 ;Carmen, S.等人，Briefings inFunctional Genomics and Proteomics, 1 (2), 189-203 页，2002 ; Siriwardena, D.等)κ, Ophthalmology, 109 (3)，427-431 Μ, 2002)。在一个方面中，本发明提供了作为抗体类似物的14-3-3抗体，其有时称作“合成 抗体”。例如，可使用“嫁接”了 CDR的替代性蛋白质骨架或人工骨架。这些骨架包括但不限 于例如由生物相容性聚合物组成的合成骨架。参见例如，Korndorfer等人，2003，Proteins Structure, Function, andBioinformatics,卷 53, Issue 1 :121_129 ；Roque 等人，2004, Biotechnol. Prog. 20 :639_654。此夕卜，可使用肽抗体模拟物(ρ印tide antibody mimetics, “PAM”)以及利用纤连蛋白组分作为支骨架的抗体模拟物。在一个实施方案中，本发明提供了交联抗体，其包含彼此结合形成抗体复合物的 本文所述两个或更多个抗体。交联抗体也称为抗体多聚体、同缀合物和异缀合物。在一些实施方案中，本文提供的抗体复合物包括多聚体形式的抗14-3-3抗体。例 如，本发明的抗体复合物可采用单体免疫球蛋白分子的抗体二聚体、三聚体或更高级多聚 体的形式。可通过本领域已知的多种方法进行抗体的交联。例如，抗体交联可通过抗体的 天然聚集、通过化学或重组连接技术或本领域已知的其它方法来实现。例如，经纯化的抗体 制备物可自发地形成含有抗体同二聚体以及其它更高级抗体多聚体的蛋白质聚集体。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合14-3-3 η的同二聚化抗体。可通过本领域已知的连接技术对抗体进行交联或二聚化。可利用非共价连接方法。在一个具体实施方案中，可通过使用第二交联剂抗体来实现抗体的交联。所述交联剂 抗体可来源于不同于目的抗体的动物。例如，可将山羊抗小鼠抗体(Fab特异性)添加到小 鼠单克隆抗体中以形成异二聚体。该二价交联剂抗体识别两个目的抗体的Fab或Fc区域， 从而形成同二聚体。在本发明的一个实施方案中，使用山羊抗小鼠抗体(GAM)交联特异性结合14-3-3 抗原的抗体。在另一实施方案中，GAM交联剂识别两种抗体的Fab或Fc区域，其中每种抗 体均特异性结合14-3-3 η。还可使用共价或化学连接抗体的方法。化学交联剂可以是同双功能的或异双功能 的，并且会共价结合两个抗体，形成同二聚体。交联剂是本领域中公知的；例如，公知同双 功能接头或异双功能接头(参见，2006 PierceChemical Company Crosslinking Reagents Technical Handbook ；Hermanson, G. Τ. , Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA(1996) ；Aslam Μ.禾口 Dent AH. , Bioconjugation :protein couplingtechniques for the biomedical sciences, Houndsmills, England :MacmillanPublishers (1999)； Pierce Applications Handbook & Catalog, PerbioScience, Ermbodegem, Belgium(2003-2004) ；Haughland, R. P. , Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene，第 9 版，MolecularProbes, OR(2003)以及美国专利 No. 5，747，641)。 本领域技术人员会了解多种官能团对修饰抗体氨基酸(包括交联)的适合性。用于抗体 交联的合适化学交联剂实例包括但不限于SMCC[4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸 琥珀酰亚胺酯]、SATA[S-硫代乙酰基-乙酸N-琥珀酰亚胺酯]、N-羟基琥珀酰亚胺的半 琥珀酸酯；N-羟基硫代琥珀酰亚胺；羟基苯并三唑和对硝基酚；二环己基碳二亚胺(DCC)、 1-(3_ 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亚胺(EOT)和1-(3_ 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亚 胺甲碘化物(EDCI)(参见例如，美国专利No. 4，526，714，其公开内容通过引用整体并入本 文)。其它连接试剂包括谷胱甘肽、3-( 二乙氧基磷酰氧基)_1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮 (3- (diethoxyphosphoryloxy)-1,2, 3-benzotriazin-4 (3H) -one, DEPBT)、基于鐵盐的偶联 剂、基于聚环氧乙烷的异双功能交联试剂等(Haitao等人，Organ Lett 1 =91-94(1999)； Albericio 等人，J Organic Chemistry63 9678-9683 (1998) ；Arpicco 等人，Bioconjugate Chem. 8 327-337 (1997) ；Frisch 等人，Bioconjugate Chem. 7 180-186 (1996) ；Deguchi 等 人，Bioconjugate Chem. 10:32-37(1998) ；Beyer 等人，J. Med. Chem. 41 :2701_2708 (1998)； Drouillat 等人，J. Pharm. Sci. 87 :25_30(1998) ；Trimble 等人，Bioconjugate Chem. 8 416-423(1997))。用于形成抗体同二聚体的示例性方案在美国专利公开20060062786中 给出。将治疗性化合物与抗体缀合的方法也描述于Arnon等人，"Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancers Therapy,"Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Reisfeld 等人编，243-256 页，Alan R. Liss, Inc. (1985) ；Thorpe 等人 ‘‘The Preparation and Cytotoxic Properties of AntibodyToxin Conjugates, ”Immunol. Rev. 62 119-58(1982)以及 Pietersz，G. A.，"The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatmentof cancer, '^Bioconjugate Chemistry 1(2) 89-95 (1990)中，所有参考文献均通过弓I用并入本文。另外，本发明的抗体_抗体缀合物可通过本领域已知的技术彼此共价结合，例 如使用异双功能交联试剂——GMBS(maleimidobutryloxysuccinimide,马来酰亚胺丁氧基琥珀酰亚胺)和SPDP(3-(2_吡啶二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯)[参见例如， Hardy, “ Purification And Coupling OfFluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry" ，Handbook OfExperimental Immunology，卷 1，Immunochemistry, Weir 等人 (编)，31·4-31· 12 页，第 4 版，(1986)以及 Ledbetter 等人，美国专利 No. 6，010，902]。另外，抗体可通过硫醚交联进行连接，如美国专利公开20060216284、美国专利 No. 6，368，596中所述。如本领域技术人员所了解地，抗体可以在Fab区域交联。在一些实 施方案中，理想的是，化学交联剂不与抗体的抗原结合区域相互作用，因为这可能影响抗体 功能。缀合抗体本文公开的抗14-3-3 η抗体包括与无机或有机化合物缀合的抗体，包括例如但 不限于其它蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇和脂质(参见例如，Green等人，Cancer Treatment Reviews, 26 :269_286 (2000)。所述化合物可以具有生物活性。“生物活性”是指 与未暴露于化合物的细胞相比，所述化合物对细胞具有生理作用。生理作用是生物过程中 的变化，包括例如但不限于DNA复制和修复、重组、转录、翻译、分泌、膜周转、细胞粘附、信 号转导、细胞死亡等。生物活性化合物包括药物化合物。在一个实施方案中，将抗14-3-3 η 抗体与14-3-3拮抗剂肽(优选R-18)缀合，优选通过接头进行缀合。有关R18，参见例如 Wang等人1999-参考文献35。药物组合物、施用和剂量可将本发明的抗14-3-3 η抗体掺入适于向对象施用的药物组合物中。通常，所述 药物组合物包含本发明的抗14-3-3 η抗体以及可药用载体。本文使用的“可药用载体”包 括任意及全部的生理相容性溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延 迟剂等。可药用载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合中 的一种或多种。在许多情形中，优选在所述组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露 醇、山梨醇)或氯化钠。可药用物质例如润湿物质或少量辅助物质(如润湿剂或乳化剂、防 腐剂或缓冲剂)提高了抗14-3-3 η抗体的保存期或有效性。在一个优选实施方案中，抗14-3-3 11抗体靶向位于细胞外的14_3_3 η蛋白。 因此，配制治疗性组合物并施用，以使得这样递送的抗14-3-3 11抗体可供与细胞外的 14-3-3 n蛋白结合之用。本发明的组合物可采用多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液 体溶液(例如注射液和输注液)、分散系或混悬液、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。优 选形式取决于预定的施用模式和治疗性应用。典型的优选组合物采用注射液或输注液的 形式，例如与用其它抗体对人进行被动免疫时使用的组合物类似的组合物。优选的施用模 式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内，其中尤其优选囊内)施用。在一个实施方 案中，所述抗14-3-3 η抗体通过静脉内输注或注射施用。在另一优选实施方案中，所述抗 14-3-3 n抗体通过肌内或皮下注射施用。在一个优选实施方案中，直接注射进滑膜内。治疗性组合物通常必须是无菌的并且在制备和储存条件下是稳定的。所述组合 物可以配制成溶液、微乳剂、分散系、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。可如下制 备无菌注射液将所需量的活性化合物掺入根据需要含有一种上文所列成分或成分组合的 合适溶剂中，随后过滤除菌。一般地，如下制备分散系将所述活性化合物掺入含有基础分散介质和所需的其它上文所列成分的无菌载体中。对于用来制备无菌注射液的无菌粉末来 说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到来自先前经过滤灭菌之溶液的活性成 分和任意额外所需成分的粉末。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散系的情形中通 过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。注射用组合物的延长 吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。本发明的抗14-3-3 η抗体可通过本领域已知的多种方法来施用，包括静脉内注 射或输注。直接施用至滑膜是一种优选的施用途径。如本领域技术人员所了解地，施用途径 和/或模式将根据期望结果而有所不同。在某些实施方案中，所述活性化合物可与保护该 化合物免于快速释放的载体一起制备，例如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊 化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酐、聚乙醇 酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸。制备这些制剂的许多方法都是专利方法或者是本领域技术 人员——般所知白勺。参见例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 编，Marcel Dekker, Inc. ,New York, 19780 代表性的制备技术在 Remington : The Science andPractice of Pharmacy，第19片反，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995) 禾口 Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版，Kibbe, A. H.编，Washington DC, American Pharmaceutical Association(2000)等中有教导。在某些实施方案中，本发明的抗14-3-3 η抗体可经口施用，例如，与惰性稀释剂 或可吸收食用载体一起施用。所述化合物(及其它成分，如果需要的话)还可封装在硬壳 或软壳明胶胶囊中，压制成片剂或者直接掺入对象的饮食中。为了经口治疗性施用，所述活 性化合物中可掺入赋形剂并采用可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、 薄片等形式。为了通过肠胃外施用之外的方式施用本发明化合物，可能有必要使用防止其 失活的材料对所述化合物进行包衣或者与所述化合物共施用。还可将补充性活性化合物掺入所述组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗 14-3-3 η抗体与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。例如，DMARD或DMOAD或 另一种抗体。这样的联合治疗可有利地利用较低剂量的所施用治疗剂，从而避免了与各种 单一治疗相关的可能毒性或并发症。本发明的药物组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体。“治疗 有效量”是指在必要的剂量和时间下有效实现期望治疗结果的量。所述抗14-3-3 η抗体的 治疗有效量可根据例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重以及所述抗14-3-3 η抗体在该 个体中引发期望应答的能力等因素而有所不同。治疗有效量也是治疗有益作用胜过抗体任 何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间下有效实现期望预防结果 的量。通常，由于预防性剂量在疾病之前或早期阶段用于对象，因此预防有效量会少于治疗 有效量。可以调整给药方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性或预防性应答)。例如，可 施用单次剂量，可随时间施用若干分开的剂量，或者可根据治疗情况的迫切性来按比例减 少或增加剂量。配制成剂量单位形式的胃肠外组合物是尤其有利的，因为这便于施用且剂 量均一。本文使用的“剂量单位形式”是指适合作为待治疗哺乳动物对象之单次剂量的物 理上离散的单位；每单位含有经计算产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的 药物载体。本发明剂量单位形式的规格由(a)所述活性化合物的独特特性和待实现之特定治疗或预防效果，以及(b)在制备这样的活性化合物以用于个体敏感治疗的领域中固有的 限制所决定并直接取决于它们。本发明抗体的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围是0. 1 20mg/kg，更优 选1 10mg/kg。应当注意，剂量值可随着待缓解病症的类型和严重程度而变化。还应理解， 对于任何特定对象来说，具体给药方案应根据个体需要以及施加或指导施用所述组合物的 人的专业判断随时间进行调整，本文所设定的剂量范围仅为示例性的且不意在限制所要求 保护之组合物的范围或实施。本文所述的药物组合物可置于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿或小瓶/ 管)中。此类容器通常以保持所述制剂的无菌和稳定性直至使用的方式进行密封。一般地， 制剂可作为油或水性介质中的混悬液、溶液或乳剂来保存，如上文所示。或者，药物组合物 可以冻干状态保存，其仅需要在临使用前加入无菌液体载体即可。抗14-3-3 η抗体的治疗性用途本文中“治疗”意指针对疾病、病症或不希望的状况的治疗性或预防性治疗或者抑 制性手段。“治疗”涵盖在疾病症状出现之前和/或疾病的临床表现或其它表现之后向对象 施加适当形式的抗14-3-3 η抗体，从而降低疾病的严重程度、停止疾病发展或消除疾病。 疾病的预防包括拖延或延迟疾病或病症之症状的出现，优选在疾病易感性提高的对象中。在一个方面中，本发明提供了治疗涉及14-3-3 η之疾病的方法。所述方法包括向 患者施用治疗有效量的本发明抗14-3-3 η抗体。在一些实施方案中，所述方法包括联合治 疗。在一个实施方案中，本发明提供了治疗关节炎的方法，包括治疗下列疾病的方法 强直性脊柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合 征、纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节 炎、佩吉特病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性 关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个实施方案中，所述方法涉及联合治疗，其中除了施用一种或多种本发明的 抗14-3-3 η抗体之外还施用至少一种另外的治疗剂。在一个优选实施方案中，所述治 疗剂选自改变病因的抗风湿药物(DMARD)、改变病因的骨关节炎药物(DM0AD;例如参见 Loeser, Reumatologia, 21 104-106，2005)、抗 TNF α 抗体、抗 IL-1 抗体、抗 CD4 抗体、抗 CTLA4抗体、抗CD20抗体、抗IL-6抗体、来氟米特、柳氮磺吡啶和甲氨蝶呤。诊断、预后和治疗性诊断(theragnostic)方法以及治疗监测在一个方面中，本发明提供了用于诊断涉及14-3-3 11之疾病和病症的方法。所 述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体来检测14-3-3 η蛋白的变化，例如表达、定位、 功能等的变化。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14-3-3 II抗体进行免疫沉 淀。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体进行ELISA。在一个实施 方案中，检测包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体进行Western印迹。在一个实施方案中， 检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于免疫组织化学中。在一个实施方案中，检测包括 将本发明的抗14-3-3 η抗体用于免疫荧光中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗 14-3-3 η抗体用于FACS分析中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗 体用于放射性免疫测定中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于试条测试中。在一个实施方案中，检测包括将本发明的抗14-3-3 η抗体用于床边检验中。 在一个实施方案中，将检测14-3-3 11与检测另一种疾病标志物(例如，针对关节炎的MMP、 抗CCP抗体、抗RF抗体和/或CRP)联用。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断炎性病症的方法。在一个优选实施方 案中，提供了诊断关节炎的方法。包括诊断选自以下之疾病的方法强直性脊柱炎、白塞病、 弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌痛、痛风、感染 性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特病、风湿性多 肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类风湿性关节 炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。一般地，可基于患者的滑膜液、血浆或血清中14-3-3 η的存在来检测患者的关节 炎。换句话说，细胞外的14-3-3 11蛋白可用作指示关节炎的标志物。此外，14-3-3 η的存在或者包括14-3-3 η在内的14_3_3蛋白同工型的相对水平 (如通过使用本发明的抗14-3-3 η抗体以及其它抗14-3-3抗体所测定地)可作为早期关 节炎在发展成衰弱形式之前的预后指示物。早期预后或诊断的优点是较早实施治疗方案。14-3-3 η的存在或相对水平可与患者样品中另一些蛋白质(例如基质金属蛋白 酶(MMP)，如MMP-I或ΜΜΡ-3)的存在或相对水平相关联。已鉴定出至少25种不同的ΜΜΡ。 检测患者样品中的14-3-3 η以及至少一种MMP可用于诊断关节炎。另外，患者样品中的 14-3-3 η以及至少一种MMP的存在或相对水平可用作早期关节炎在发展成衰弱形式之前 的预后指示物。在一个实施方案中，所述方法包括检测患者的滑膜液、血浆或血清中的14-3-3 η 蛋白。在一个实施方案中，通过使用本发明的抗14-3-3 η抗体对来自滑膜液、血浆或血清 的14-3-3 η蛋白进行免疫沉淀来进行检测。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗 14-3-3 η抗体进行ELISA。在一个实施方案中，检测包括使用本发明的抗14_3_3 η抗体对 包含患者的滑膜液、血浆或血清的样品进行Western印迹。在一个实施方案中，检测包括使 用放射性免疫测定。在一个实施方案中，检测包括使用试条测试。在一个实施方案中，检测 包括使用床边检验。在一个实施方案中，将检测14-3-3 11与检测另一种关节炎标志物(例 如，MMP、抗CCP抗体、抗RF抗体和/或CRP)联用。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断神经性病症的方法。在一个优选实施 方案中，提供了用于诊断选自细菌性脑膜炎和克_雅病之疾病的方法。在一个实施方案中， 检测脑脊液中14-3-3 11的存在。在一个方面中，本发明提供了用于确定患者对炎性疾病之治疗的响应潜力的方 法。在一个优选实施方案中，提供了确定患者对关节炎治疗之响应潜力的方法。包括确定 针对选自以下疾病之治疗的响应潜力的方法强直性脊柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚 症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节 炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉特病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、 假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合 征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体确定患者样品 中的14-3-3 11水平。在一个优选实施方案中，将患者样品中的14-3-3 11水平与来自治疗响应能力已知的对象中的样品进行比较。与来自非炎症对象的样品和/或来自另一炎 症患者的样品相比，第一患者样品中相对较高的14-3-3 η水平可指示该第一患者是用抗 14-3-3 η抗体或替代性的DMARD疗法(例如抗TNF抗体)进行治疗的优选候选者。相反， 与来自另一炎症患者的样品相比，第一患者样品中相对较低的14-3-3 11水平可指示该第 一患者不是用抗14-3-3 η抗体或替代性的DMARD疗法(例如抗TNF抗体)进行治疗的优 选候选者，尤其是当所述水平接近于非炎症对象中样品的水平时。在一个方面中，本发明提供了用于区分炎性疾病亚型的方法。在一个优选实施 方案中，提供了区分关节炎亚型的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用本发明的 抗14-3-3 η抗体确定患者样品中的14-3-3 η水平。在一个优选实施方案中，将患者中的 14-3-3 η水平与炎性疾病亚型或预后已知的对象之样品中的14-3-3 η水平进行比较。在一个方面中，本发明提供了用于预防涉及14-3-3 η之疾病发生的预防性方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于在具有发生炎性疾病之风险的对象中预防 炎性疾病发生的预防性方法。在一个优选实施方案中，提供了用于在具有发生关节炎之风 险的对象中预防关节炎的预防性方法。包括用于预防选自以下疾病的预防性方法强直性 脊柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、纤维 肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、佩吉 特病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关节炎、 类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。所述方法包括向对 象施用本发明的抗14-3-3 η抗体。在一个实施方案中，将所述抗14-3-3 η抗体作为本文 所述联合治疗的组分来施用。在一个方面中，本发明提供了用于监测炎性病症之治疗的方法。在一个优选实施 方案中，提供了用于监测关节炎治疗的方法。包括用于监测选自以下疾病之治疗的方法强 直性脊柱炎、白塞病、弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)、埃-当综合征(EDS)、费尔蒂综合征、 纤维肌痛、痛风、感染性关节炎、幼年性关节炎、狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、骨关节炎、 佩吉特病、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛风、银屑病关节炎、雷诺现象、反应性关 节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔病和韦格纳肉芽肿病。在一个实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体测定患者样品 中的14-3-3 η水平，以及监测进行治疗的患者中14-3-3 η的水平。在一个方面中，本发明提供了用于检测患者样品中14-3-3 11以及任选地其它 标志物(例如MMP)之存在的试剂盒，所述试剂盒可用于提供适于诊断或区分多种涉及 14-3-3 11之疾病类型的诊断或预后结果。试剂盒包含本发明的抗14-3-3 η抗体。此试剂 盒还可包含特异性针对特定MMP (其为关节炎标志物)的检测试剂。所述试剂盒还可包含 免疫检测14-3-3 11所需的其它试剂，例如带标记的第二抗体、生色或发荧光的试剂、聚合 剂和/或出于诊断或预后目的使用所述试剂盒的说明。有关诊断方法，还参见2007年5月9日提交的WO 2007/128132。对于使用抗体来检测样品中的蛋白质标志物来说，存在多种本领域技术人员已知 的测定形式。参见例如，Harlow 禾P Lane, Antibodies :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，关节炎或其它涉及14_3_3 η之病症的存在与否或者患 者预后可如下确定(a)将从患者获得的生物样品与本发明的抗14-3-3 11抗体接触；(b)检测样品中与所述抗体结合的14-3-3 η水平；以及(C)将多肽水平与预定截断值(即对 照)进行比较。在一个优选实施方案中，所述测定包括使用固定于固体支持物上的本发明抗 14-3-3 η抗体来结合14-3-3 η蛋白并将其从样品剩余物中除去。然后，可使用含有报告基 团并且特异性结合抗体/蛋白质复合物的检测试剂来检测所结合的14-3-3 η蛋白。这样的 检测试剂可包含例如特异性结合14-3-3蛋白的结合剂。或者，可利用竞争性测定，其中用 报告基团标记14-3-3 11蛋白，并在将所述抗体与所述样品孵育后使之结合经固定的抗体。 样品中的组分抑制经标记14-3-3 11蛋白与抗体结合的程度指示样品与经固定抗体的反应 性。在这些测定中使用的合适蛋白质包括全长14-3-3 η蛋白以及与抗体结合的其多肽部 分。所述固体支持物可以是本领域技术人员已知的任何材料。例如，所述固体支持物 可以是微量滴定板中的测试孔或者硝酸纤维素膜或其它合适的膜。或者，所述支持物可以 是珠或盘，例如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物还 可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如美国专利No. 5，359,681中公开的那些。所述抗体可以 使用本领域技术人员所知的多种方法固定在固体支持物上，其充分地描述于专利和科学文 献中。在本发明中，术语“固定”是指非共价结合(例如吸附)和共价连接(可以是抗体与 支持物上官能团的直接连接，或者可以是通过交联剂的连接)。优选通过吸附固定于微量滴 定板的孔中或膜上。在此情形中，可以通过在合适缓冲液中将抗体与固体支持物接触一段 合适的时间来实现吸附。接触时间随温度而变化，但通常为约1小时至约1天。在一个实 施方案中，使用经链霉亲和素包被的微量滴定板与生物素化抗体相组合。抗体与固体支持物的共价连接一般可通过下述方式实现首先将支持物与双功能 试剂反应，所述双功能试剂与支持物和抗体均能发生反应。在某些实施方案中，所述测定是双抗体夹心测定。该测定可通过下述方式进行首 先将已固定于固体支持物(通常为微量滴定板的孔)的抗体与样品接触，从而使样品中的 14-3-3 η蛋白与经固定的抗体结合。然后，从经固定的蛋白质-抗体复合物中除去未结合 之样品，加入含有报告基团的检测试剂(优选能够结合所述多肽上不同位点的第二抗体)。 然后，使用适合于特定报告基团的方法测定仍与固体支持物结合的检测试剂的量。经固定的抗体和检测抗体优选是不同的。在一个优选实施方案中，经固定抗体是 本发明的抗14-3-3 η抗体，而检测抗体是本发明的另一种抗14-3-3 η抗体或者能够结合 14-3-3 η的另一种抗14-3-3抗体。在一个实施方案中，所述检测抗体是泛14_3_3抗体。在另一实施方案中，所述检测抗体是本发明的抗14-3-3 η抗体，而经固定抗体是 本发明的另一种抗14-3-3 η抗体或者能够结合14-3-3 η的另一种抗14-3-3抗体。在一 个实施方案中，所述经固定抗体是泛14-3-3抗体。所述方法包括使用本发明的抗14-3-3 η抗体。作为所述第二抗体的替代方案，可 使用与14-3-3 η结合的另一种配体来与本发明的抗14-3-3 η抗体相组合。这种配体的实 例有R18 (Wang等人1999-参考文献35)。抗体一经如上所述固定于支持物上，通常就将支持物上剩余的蛋白质结合位点封 闭。本领域技术人员已知的任何合适封闭剂，例如牛血清白蛋白或脱脂奶粉。然后，将经固 定抗体与样品一起孵育，使14-3-3 η蛋白与抗体结合。可在孵育前用合适的稀释剂(例如磷酸盐缓冲液(PBS))稀释样品。一般地，合适的接触时间(即孵育时间)是足以检测获得 自患关节炎或其它涉及14-3-3 η之病症的个体样品中14-3-3 η蛋白存在的时间。优选 地，接触时间足以实现这样的结合水平，即在结合和未结合之14-3-3 n蛋白平衡状态下所 实现水平的至少约95%。本领域技术人员会了解，可通过测定在一段时间内发生结合的水 平来容易地确定实现平衡所需的时间。在室温下，约30分钟的孵育时间通常是足够的。然后，可通过用合适的缓冲液(例如含有0. 吐温20 的PBS)清洗固体支持物 以除去未结合的样品。然后，可将含有报告基团的第二抗体加至固体支持物。适于本发明 方法的报告基团是本领域公知的。然后，将检测试剂与经固定的抗体-蛋白质复合物一起孵育足以检测所结合 14-3-3 n蛋白的时间。合适的时间一般可通过测定一段时间内发生的结合水平来测定。然 后除去未结合的检测试剂，使用报告基团检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法 取决于报告基团的性质。对于放射性基团来说，闪烁计数或放射自显影方法一般是合适的。 光谱分析法可用于检测染料、发光基团和荧光基团。可使用与不同的报告基团(通常为放 射性或荧光基团或酶)偶联的亲和素来检测生物素。酶报告基团一般可通过加入底物(一 般保持特定的时间段)然后对反应产物进行光谱分析或其它分析来检测。为了确定是否存在关节炎或其它涉及14-3-3 η病症，一般将仍结合于固体支持 物之报告基团检测到的信号与对应于预定截断值(对照)的信号进行比较。在一个优选 实施方案中，所述截断值是当经固定抗体与来自未患关节炎或其它涉及14-3-3 11之病症 的患者样品一起孵育时获得的信号的平均值。一般地，认为产生高于预定截断值三倍标准 差之信号的样品是关节炎或其它涉及14-3-3 η之病症阳性的。在一个替代性优选实施方 案中，可使用接收者操作特征曲线(Receiver Operator Curve)来确定截断值，例如参见 Sackett等人，Clinical Epidemiology :A Basic Science for ClinicalMedicine,Little Brown and Co.，1985，106-7页的方法。简言之，在该实施方案中，截断值可根据对应于诊断 测试结果之每个可能截断值的真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100% -特异性)的配 对曲线来确定。曲线上最接近于左上角的截断值(即囊括了最大面积的值)是最精确的截 断值，产生高于根据该方法确定之截断值的信号的样品可认为是阳性的。或者，所述截断值 可以沿曲线向左移，从而使假阳性率最小，或者向右移，从而使假阴性率最小。一般地，产生 高于该方法确定之截断值的信号的样品被认为是关节炎或其它涉及14-3-3 n之病症阳性 的。在一个实施方案中，所述测定作为床边检验来提供。例如，在一个相关实施方案 中，所述测定采用流通(flow-through)形式或试条测试形式进行，其中所述抗体固定于膜 (例如硝酸纤维素膜)上。在流通测试中，随着样品与膜接触，样品中的14-3-3蛋白结合 至经固定的抗体。然后，随着含有第二结合剂的溶液接触所述膜，第二经标记结合剂结合 至结合剂-多肽复合物。然后，可如上所述对所结合的第二结合剂进行检测。在试条测试 形式中，将结合有抗体之膜的一端浸于含有样品的溶液中。样品沿膜迁移，通过含有第二 14-3-3 n结合剂的区域，到达经固定抗体的区域。在经固定抗体区域处的第二结合剂的浓 度指示关节炎或其它涉及14-3-3 n之病症或者患者预后等的存在情况。通常，该位点处第 二结合剂的浓度产生可目测的图案，例如线。没有该图案指示阴性结果。一般地，选择固定 于所述膜上的结合剂的量以使得当生物样品含有足以在双抗体夹心测定中产生阳性信号的多肽水平时产生肉眼可辨别的图案(以上述形式)。用于这些测定的优选结合剂是抗体 及其抗原结合片段。这些测试通常可使用很少量的生物样品并且可随时进行。在一个优选实施方案中，所述经固定抗体是本发明的抗14-3-3 η抗体。所述第二 结合剂是另一种14-3-3 η配体，其是否选择性地结合14-3-3 η蛋白均可。在另一实施方案中，所述第二结合剂是本发明的抗14-3-3 η抗体，最优选其抗原 结合片段，所述经固定抗体是能够结合14-3-3 η蛋白的抗14-3-3抗体。所述抗体是否选 择性地结合14-3-3 η蛋白均可。当然，还存在许多其它适用于本发明抗14-3-3抗体的测定方案。以上描述仅旨在 举例。为了改善灵敏度，可在给定样品中测定多种标志物。特别地，可与14-3-3蛋白相 结合地测定关节炎或其它涉及14-3-3 n之病症的一种或多种其它标志物或者预后指示物 等。这些另外的标志物可以是蛋白质或核酸。在一个优选实施方案中，其中所述疾病是关 节炎，一种或多种其它标志物是MMP蛋白或核酸或者其它常用作关节炎指示物的因子，例 如抗CCP抗体、抗RF抗体、CRP等。基于参考序列分离和测定核酸的方法是本领域中公知 的。可同时或依次进行组合测定。可基于常规实验选择标志物，以确定得到最佳灵敏 度的组合。本发明还提供了用于上述任何诊断方法中的试剂盒。这些试剂盒通常包含进行诊 断测定所需的两种或更多种组分。组分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒 中的一个容器可含有本发明的抗14-3-3 η单克隆抗体。如上所述，可提供连接至支持物材 料的这些抗体。一个或多个另外的容器可容纳测定中所用的要件，例如试剂或缓冲液。这 样的试剂盒还可包含如上所述的检测试剂，其含有适于直接或间接检测抗体结合的报告基 团。试剂盒还可包含检测其它关节炎标志物的试剂，包括编码特定MMP的特定mRNA。实验表1:14-3-3 η 表位
SEQ ID NO 193-107螺旋LETVCNDVLSLLDKFSEQ ID NO 2191-199螺旋EQACLLAKQSEQ ID NO 3144-155螺旋NSVVEASEAAYKSEQ ID NO 4144-152螺旋NSVVEASEASEQ ID NO 5147-155螺旋VEASEAAYKSEQ ID NO 6163-170螺旋EQMQPTHP
权利要求
抗14 3 3η抗体，其中所述抗体能够特异性结合天然构型的人14 3 3η蛋白，并且其中所述抗体表现出相对于其它的人14 3 3蛋白同工型来说对所述人14 3 3η蛋白的选择性。
2.根据权利要求1的抗14-3-3η抗体，其中所述抗体不与位于所述人14-3-3 η蛋白 N端的表位结合。
3.根据权利要求1的抗14-3-3η抗体，其中所述抗体能够结合包含选自以下η肽的 表位14-3-3 n环肽、14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽。
4.根据权利要求3的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够结合包含14-3-3 n环肽的 表位，其中所述14-3-3 n环肽包含选自SEQ ID NO 11-16的氨基酸序列。
5.根据权利要求3的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够结合包含14-3-3 n螺旋肽 的表位，其中所述14-3-3 n螺旋肽包含选自SEQ IDNO :1_10的氨基酸序列。
6.根据权利要求3的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够结合包含14-3-3 n非螺旋 肽的表位，其中所述14-3-3 n非螺旋肽包含选自SEQID NO 17-32的氨基酸序列。
7.根据权利要求4的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够结合包含LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO 30)的表位。
8.根据权利要求4的抗体，其中所述抗体能够结合包含KKLEKVKAYR(SEQID NO 31)的表位。
9.根据权利要求4的抗14-3-3η抗体，其中所述抗体能够结合包含 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO 32)的表位。
10.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体表现出相对于人14-3-3 α、β、 δ、ε、Υ、τ和ξ蛋白来说对所述人14-3-3 η蛋白的选择性。
11.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够从包含所述14-3-3 n蛋白 之生物溶液中免疫沉淀所述14-3-3 η蛋白。
12.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体当用于ELISA中时，能够在对包 含所述人14-3-3 n蛋白的生物溶液进行所述ELISA时特异性结合所述生物溶液中的所述 人14-3-3 η蛋白。
13.根据权利要求11或12的抗14-3-3n抗体，其中所述生物溶液包含来自关节炎患 者之滑膜液、血浆或血清的样品。
14.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体能够抑制14-3-3 n对MMP的诱 导，其中所述MMP选自MMP_1、3、8、9、10、11和13。
15.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
16.根据权利要求1的抗14-3-3n抗体，其中所述抗体是人源化单克隆抗体。
17.抗14-3-3η抗体，其与权利要求2或3的抗体竞争结合天然构型的人14-3-3 η蛋 白，其中所述抗体表现出相对于其它的人14-3-3蛋白同工型来说对所述人14-3-3 n蛋白 的选择性。
18.制备权利要求1的抗14-3-3η抗体的方法，其包括用选自14_3_3 η环肽、 14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽的肽免疫哺乳动物。
19.诊断关节炎的方法，其包括使用权利要求1的抗14-3-3n抗体来检测包含来自患 者之滑膜液、血浆或血清的样品中的14-3-3 n蛋白。
20.权利要求1-16中任一项的抗14-3-3η抗体用于检测包含来自患者之滑膜液、血浆 或血清的样品中的14-3-3 η蛋白以诊断关节炎的用途。
21.用于诊断关节炎的试剂盒，其包含权利要求1的抗14-3-3η抗体和实施权利要求 19之方法的说明。
22.用于治疗关节炎的方法，其包括向有此治疗需要的患者施用治疗有效量的权利要 求1-16中任一项之抗14-3-3 η抗体。
23.权利要求1-16中任一项的抗14-3-3η抗体用于治疗患者中关节炎的用途。
24.权利要求1-16中任一项的抗14-3-3η抗体用于制备治疗患者中关节炎之药物的 用途。
25.权利要求1-16中任一项的抗14-3-3η抗体，其用于治疗患者中的关节炎。
26.药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的抗14-3-3η抗体。
全文摘要
本发明提供了抗14-3-3η抗体，其特异性结合天然构型的人14-3-3η蛋白同工型，同时表现出相对于人14-3-3α、β、δ、ε、γ、τ和ξ蛋白同工型的选择性。还提供了包含所述特异性抗14-3-3η抗体的方法、试剂盒和药物组合物，用于诊断和治疗关节炎。
文档编号A61K39/395GK101952313SQ200880125676
公开日2011年1月19日 申请日期2008年11月26日 优先权日2007年11月27日
发明者安东尼·马罗塔 申请人:不列颠哥伦比亚大学