专利名称：通过检测gpc3诊断癌症的方法
技术领域：
本发明涉及一种血液中可溶解的癌症标记，且具体地涉及通过检测临床样品中的可溶性磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)诊断癌症的方法。
背景技术：
已经报道称磷脂酰肌醇聚糖家族为存在于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的新家族。迄今为止，已报道了五种磷脂酰肌醇聚糖家族的成员磷脂酰肌醇聚糖(磷脂酰肌醇聚糖1，磷脂酰肌醇聚糖2，磷脂酰肌醇聚糖3，磷脂酰肌醇聚糖4和磷脂酰肌醇聚糖5)。这些家族成员具有相同大小的核心蛋白(大约60kDa)，共有的特异性并且较保守的半胱氨酸序列，以及通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚结合于细胞膜。
已知磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)参与细胞分裂，或发育过程中细胞分裂模式的调控，而且GPC3基因在肝癌细胞中高度表达。因此，GPC3基因可被用作肝细胞瘤标记。
我们以前发现了抗-GPC3抗体具有ADCC活性和CDC活性，且可用于治疗肝肿瘤，并已经申请了专利(日本专利申请号2001-189443)。
GPC3是一种膜-结合蛋白。目前还没有关于分泌型GPC3存在于血液中以及GPC3蛋白可用作癌症标记的报道。
发明概述我们发现了磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)在第358精氨酸和第359丝氨酸之间裂解，且因此假设可溶解的GPC3被分泌在肝癌病人的血液中。然后我们建立了GPC3的夹心ELISA系统，并揭示了GPC3存在于高度表达GPC3基因的HepG2(人肝癌细胞)的培养物上清液中。此外，我们还在用HepG2移植小鼠的血浆中以及人肝癌患者的血清中成功测定了可溶性GPC3。因为肝癌中GPC3的基因表达比作为癌标记的AFP的基因表达在更早的阶段被观察到，所以GPC3蛋白的检测被认为可用于癌症的诊断。此外，利用可识别C-末端片段的抗-GPC3抗体检测可溶性GPC3稍微有些困难。据推断分泌性GPC3蛋白主要含有N-末端片段。因此，我们推测识别N-末端的GPC3抗体可用于检测可溶性，由此完成了本发明。
GPC3蛋白的表达同样在除了肝癌细胞系外的癌细胞系中被检测到，诸如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和淋巴癌。因此，GPC3可能被用于肝癌以及许多其它癌症的诊断。
本发明如下。
(1)一种诊断癌症的方法，其包括检测试验样品中的可溶性GPC3蛋白。
(2)根据(1)所述的诊断癌症的方法，其中的可溶性GPC3蛋白是GPC3的N-末端肽。
(3)根据(2)的诊断癌症的方法，其中GPC3的N-末端肽是在GPC3第1位氨基酸到第374位氨基酸的氨基酸序列中，或在GPC3第1位氨基酸到第358位氨基酸的氨基酸序列中所含的肽片段。
(4)根据(1)到(3)任一项的诊断方法，其中试验样品选自血液、血清和血浆。
(5)根据(1)到(4)任一项的诊断方法，其中的癌症为肝癌。
(6)根据(1)到(5)任一项的方法，包括使用抗-GPC3抗体。
(7)根据(6)的方法，包括使用固定在载体上的抗-GPC3抗体和用标记物质标记的抗-GPC3抗体。
(8)根据(7)的方法，其中的标记物质是生物素。
(9)一种癌症诊断试剂，包括抗-GPC3抗体。
(10)根据(9)的诊断试剂，包括利用在载体上的抗-GPC3抗体和用标记物质标记的抗-GPC3抗体。
(11)根据(9)或(10)的诊断试剂，其中的癌症为肝癌。
(12)根据(9)到(11)任一项的诊断试剂，其中抗-GPC3抗体识别GPC3的N-末端肽。
(13)一种诊断试剂盒，包括抗-GPC3抗体，和(14)根据(13)的诊断试剂盒，包括固定在载体上的抗-GPC3抗体，和用标记物质标记的抗体。
本发明详细描述如下。
本发明涉及一种通过检测试验样品中的可溶性磷脂酰肌醇聚糖检测癌症的方法。
“检测”的含义包括定量检测和定性检测。定性检测的实例包括仅仅测定GPC3蛋白质是否存在，测定确定GPC3蛋白含量是否大于基线水平，以及测定比较试验样品与另一个样品(例如，对照样品)中GPC3蛋白质的水平。定量检测的实例包括测定GPC3蛋白的浓度以及测定GPC3蛋白的水平。
试验样品包括任意可能含有GPC3蛋白的样品。试验样品优选地取自生物体诸如哺乳动物，且进一步优选地取自于人。试验样品的特异性实例包括血液、细胞间液、血浆、血管外液体、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液和尿液。优选的试验样品为血液、血清和血浆。本发明的试验样品同样也包括获自试验样品，例如获自生物体的细胞的培养基的试验样品。
本发明的待诊断的癌症包括，但不限于，肝癌，胰腺癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和淋巴癌，优选地为肝癌。
1.抗-GPC3抗体的制备本发明使用的抗-GPC3抗体可获自任意来源，且可以为任意类型(单克隆的或多克隆的)和任意的形式，只要其与GPC3蛋白特异性结合。具体地，可使用已知的抗体，诸如小鼠抗体，大鼠抗体，人抗体，嵌合的抗体或人源化抗体。
抗体可以是多克隆抗体，但优选地为单克隆抗体。
此外，固定在载体上的抗-GPC3抗体和用标记物质标记的抗-GPC3抗体可识别GPC3分子上的相同表位，但优选识别不同表位。
优选地，抗体识别的表位存在于GPC3蛋白的N-末端片段上(从第1位氨基酸Met到第358位氨基酸Arg，或第1位氨基酸Met到第374位氨基酸Lys)。
本发明中使用的抗-GPC3抗体可以为利用已知技术获得的多克隆或单克隆抗体。尤其是，作为抗-GPC3抗体，获自哺乳动物的单克隆抗体优选地用于本发明中。获自哺乳动物的单克隆抗体的实例包括通过杂交瘤产生的抗体以及通过利用含有抗体基因的表达载体的遗传工程技术转化的宿主产生的抗体。
产生单克隆抗体的杂交瘤可利用已知技术如下进行制备。根据标准免疫方法用GPC3作为免疫原免疫动物获得免疫细胞，然后通过标准细胞融合法融合到已知的亲本细胞中来制备杂交瘤。融合细胞通过标准筛选法用于单克隆抗体-产生细胞的筛选。
具体地，单克隆抗体可通过如下过程进行制备。
通过表达Lage，H.等(Gene 188(1997)，151-156)公开的GPC3(MXR7)基因首先获得用作增加抗体的免疫原的GPC3。具体地，将编码GPC3的基因序列插入到已知的表达载体系统中，转化合适的宿主细胞，然后通过已知的方法由宿主细胞或培养物上清液纯化目的人GPC3蛋白。
此外，自然存在的GPC3也可以被纯化和使用。
然后，纯化的GPC3蛋白被用作免疫原。或者，GPC3的部分肽可用作免疫原。在这种情况下，通过基于人GPC3的氨基酸序列化学合成；将GPC3基因的一部分结合到表达载体中；或用蛋白水解酶降解天然的GPC3可获得部分肽。被用作部分肽的GPC3的区域不局限于任意特异性区域。为获得识别存在于N-末端片段上的表位的抗体，可使用从GPC3的第1位氨基酸Met到第358位氨基酸Arg范围的肽或从第1位氨基酸Met到第374位氨基酸Lys范围的肽。含有这些区域的表位但小于上述肽的肽也可以被使用。
用免疫原免疫的哺乳动物没有具体的限制，且优选考虑到与用于细胞融合的配对细胞具有相容性的哺乳动物。例如，通常应用啮齿类诸如小鼠、大鼠、仓鼠或兔，或猴。
根据已知的方法用免疫原免疫动物。例如，用免疫原腹腔内或皮下注射哺乳动物进行免疫。具体地，免疫原用合适体积的PBS(磷酸盐缓冲盐水)，生理盐水等稀释或悬浮于其中；如有必要，与合适体积的标准佐剂诸如弗氏完全佐剂混合；乳化；然后每4到21天施用于哺乳动物若干次。此外，在用免疫原免疫后，还可以使用合适的载体。尤其当具有小分子量的肽片段被用作免疫原时，肽优选地结合于载体蛋白诸如白蛋白或匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)，然后被用于免疫接种。
如上所述免疫的哺乳动物被测定其血清中增加的目的抗体的效价。随后，由所述哺乳动物收集免疫细胞，然后进行细胞融合。尤其优选的免疫细胞为脾细胞。
哺乳动物骨髓瘤细胞被用作与上述免疫细胞融合的配对细胞。优选地在这里使用的骨髓瘤细胞系的实例包括各种已知的细胞系诸如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)，P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)，FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)以及R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可基本上根据已知的方法来进行，例如，Khler和Milstein等的方法(Khler G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
更具体地，在存在例如细胞-融合促进剂的条件下下，在标准营养培养基中进行上述的细胞融合。细胞-融合促进剂包括，例如，聚乙二醇(PEG)，仙台病毒(HVJ)等等。如果需要，还可以加入助剂诸如二甲亚砜来进一步增强融合效率。
在这里可以使用任意比例的免疫细胞与骨髓瘤细胞。例如，优选免疫细胞的数量大于骨髓瘤细胞数量的1至10倍。作为用于上述细胞融合的培养基，可使用例如，适于上述骨髓瘤细胞系生长的RPMI1640培养基或MEM培养基，或用于此种类型细胞培养物的其它标准培养基。此外，血清液诸如胎牛血清(FCS)可被组合使用。
如下所述进行细胞融合通过在上述培养基中充分混合特定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，加入在约37℃预热的PEG(例如，具有大约1000到6000的平均分子量)溶液(以30到60％(w/v)的浓度)，然后混合溶液以形成融合细胞(杂交瘤)。随后，依次加入合适的培养基、通过离心除去上清液并重复这些步骤来除去不利于杂交瘤生长的细胞融合试剂等等。
通过在标准选择性培养基诸如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基)中培养杂交瘤来选择由此获得的杂交瘤。在上述HAT培养基中持续培养足以杀死非-融合细胞(除了目的杂交瘤外)的一段时间(典型地，几天到几个星期)。随后，通过标准极限稀释法筛选和单克隆那些产生目的抗体的杂交瘤。
可通过基于已知的抗原-抗体反应的筛选方法进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。例如，将抗原结合于载体诸如聚苯乙烯磁珠等或市售的96-孔微量滴定板，并将杂交瘤的培养上清液添加到微孔板中与抗原反应。冲洗载体之后，加入酶标记的次级抗体等来测定与免疫原反应的抗体是否包含在培养上清液中。产生目的抗体的杂交瘤可通过极限稀释法等来进行克隆。用于免疫接种的抗原可被用于此筛选中。为获得抗GPC3的N-末端片段的抗体，N-末端片段可被用作用于筛选的抗原。
除上述通过用抗原免疫非-人动物获得杂交瘤的方法之外，也可以通过用GPC3体外敏化人淋巴细胞，并导致敏化淋巴细胞与获自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞融合来获得具有GPC3结合活性的目的人源抗体(参见日本专利公开(Kokoku)No.1-59878B(1989))。或者，GPC3抗原可被施用于具有所有人抗体基因库的转基因动物来获得产生抗-GPC3抗体的细胞，然后可从获自灭活的抗-GPC3抗体-产生细胞获得人抗GPC3抗体(参见国际专利公开WO94/25585，WO93/12227，WO92/03918和WO94/02602)。
由此制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可被传代培养在标准培养基中，或可在液氮中长期储存。
由杂交瘤获得单克隆抗体方法的一个实例包括根据标准方法培养杂交瘤以及获得培养物上清液中的单克隆抗体。另一个方法包括将杂交瘤施用于适合的哺乳动物并由其腹水中获得单克隆抗体。前一方法适于获得高度纯化的抗体，而后面的方法适合于抗体的批量生产。
在本发明中，通过遗传工程技术产生的重组单克隆抗体同样可被用作单克隆抗体。通过由杂交瘤克隆抗体基因，将所述基因导入到合适的载体中，将载体导入到宿主中，然后引起宿主产生重组单克隆抗体来制备重组单克隆抗体(例如，参见Vandamme，A.M.等的，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具体地，编码抗-GPC3抗体可变(V)区的mRNA分离自产生抗-GPC3抗体的杂交瘤。通过已知的方法诸如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)分离总RNA。然后利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等由总的RNA制备mRNA。此外，还可以利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备mRNA。
利用逆转录酶从由此获得的mRNA合成抗体可变(V)区的cDNA。例如，利用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(SEIKAGAKU公司)等合成cDNA。为合成和扩增cDNA，例如可使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和利用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.等Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。
由获得的PCR产物纯化目的DNA片段，然后与载体DNA连接来制备重组载体。然后将载体导入到大肠杆菌等，选择菌落，由此制备目的重组载体。通过已知的方法确定DNA片段的核苷酸序列，诸如二脱氧核苷酸链终止法。
一旦获得编码抗-GPC3抗体V区的DNA，这些DNA被引入到含有编码抗体目的恒定区(C区域)的DNA表达载体中。
为产生本发明中使用的抗-GPC3抗体，抗体基因被插入到表达载体中使得基因在基因表达调控区域，例如增强子和启动子的调节下表达。随后，用表达载体转化宿主细胞，使宿主细胞表达抗体。
可通过将编码抗体重链(H-链)或编码抗体轻链(L-链)的DNA分别插入到表达载体中，然后同时用载体转化宿主细胞来表达抗体基因；或通过将编码H-链和L-链的DNAs插入到一个单独的表达载体中，然后用载体转化宿主细胞来表达抗体基因(参见WO94/11523)。
除上述宿主细胞外，转基因动物也可以用来产生重组抗体。例如，将抗体基因插入在编码仅在乳汁中产生的蛋白(例如，山羊β酪蛋白)的基因中来制备融合基因。将含有包括抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，然后这些胚胎导入到雌性山羊中。由已经接受胚胎或其后代的转基因山羊产生的乳汁获得目的抗体。为增加含有转基因山羊产生的目的抗体的乳汁量，根据需要可将激素施用于转基因山羊(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
在本发明中，除上述抗体外，也可使用人工改造的重组抗体诸如嵌合的抗体或人源化抗体。这些改造的抗体可利用已知方法来制备。
嵌合抗体可如下所述进行制备将编码上述抗体V-区的DNA与编码人抗体C-区的DNA相连接，导入产物到表达载体中，然后导入载体到宿主中来使宿主产生抗体。利用这种已知的方法，获得了可用于本发明的嵌合抗体。
人源化抗体也称为改造的人抗体，其通过嫁接非人哺乳动物，诸如小鼠的抗体CDR(互补决定区)到人抗体的CDR来制备。常规的基因重组技术是本领域公知的(参见欧洲专利申请公开No.EP125023和WO96/02576)。
具体地，通过利用具有人抗体的小鼠抗体CDR和构架区(FR)部分重叠末端区域的几个寡核苷酸作为引物进行PCR来合成被设计用于连接小鼠抗体CDR与人抗体的构架区(FR)的DNA序列(参见WO98/13388所描述的方法)。
选择通过CDR连接的人抗体的构架区，因此CDR将形成良好的抗原结合位点。抗体可变区构架区中的氨基酸根据需要可被取代，使得改造的人抗体的CDR形成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，CancerRes.(1993)53，851-856)。
获自人抗体的C区域被用于嵌合抗体和人源化抗体的C区域。例如，H-链可使用Cγ1，Cγ2，Cγ3或Cγ4C，L-链可使用Cκ或Cλ。此外，为改进抗体的稳定性或其生产方法，可以修饰人抗体C-区域。
嵌合抗体包括获自非人哺乳动物的抗体的可变区以及获自人抗体的恒定区，而人源化抗体包括获自非人哺乳动物的抗体的CDR，和获自人抗体的构架区和C区域。因为预计人源化抗体的抗原性在人体内降低，所以可用作本发明治疗药物的有效成分。
用于本发明中的抗体不局限于完整的抗原分子，而是包括抗体片段或其修饰产物，只要其结合于GPC3。二价抗体和单价抗体两种被包括在内。抗体片段的实例包括Fab，F(ab′)2，Fv，具有一个Fab和一个完整Fc的Fab/c，和单链Fv(scFv)其中H-链和L-链的Fv通过合适的接头相连接。具体地，抗体片段可通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来制备，或通过其中构建编码这些抗体片段的基因，导入到表达载体中，然后在合适的宿主细胞中表达的方法进行制备(参见例如，Co.，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.，Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods inEnzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methodsin Enzymology(1989)121，663-669，和Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过连接抗体的H-链V-区域和L-链V-区域获得scFv。在scFv中，H-链V-区域和L-链V-区域通过接头连接，优选地为肽接头(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H-链V-区域和L-链V-区域可获自本说明书中描述的任一抗体。作为链接V-区域的肽接头，例如，可使用任意包括12到19个氨基酸残基的单链肽。
编码scFv的DNA可通过如下过程。通过利用编码目的氨基酸序列的完整的或部分DNA(编码上述抗体的H-链或H-链V-区域的DNA，和编码L-链或L-链V-区域的DNA)作为模板并利用对两个末端具有特异性的引物对进行PCR来进行扩增。然后利用编码肽接头部分和对连接于H-链和L-链的每一末端特异性的引物对进行进一步的扩增。
此外，一旦制备了编码scFv的DNA，可根据标准方法获得含有DNA的表达载体，以及用表达载体转化的宿主。此外，通过利用宿主，可根据标准方法获得scFv。
这些抗体片段可通过类似于上述方法的方式获得其基因然后在宿主中表达基因来产生。本发明中的“抗体”包括这种抗体片段。
结合于各种分子诸如标记物质的抗磷脂酰肌醇聚糖抗体可被用作修饰的抗体。本发明中的“抗体”也包括这些修饰的抗体。这种修饰抗体可通过化学修饰如上所述获得的抗体来获得。修饰抗体的方法是本领域已知的。
此外，本发明中使用的抗体可以是一个双特异性抗体。双特异性抗体可具有识别GPC3分子上不同表位的抗原结合位点。或者，一个抗原结合位点可识别GPC3且另一个抗原结合位点可识别标记物质等等。双特异性抗体可通过结合两种类型抗体的H-L对，或通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤来制备。此外，其还可以通过基因工程技术来制备。
抗体可由如上所述通过已知方法构建的抗体基因来表达。在哺乳动物细胞的情况下，抗体可通过可操作地连接有用的常规启动子，待表达的抗体基因，及其3′下游的polyA信号来表达。启动子/增强子包括，例如，人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子。
此外，另一个可用于本发明抗体表达的启动子/增强子的实例包括病毒启动子/增强子，诸如逆转录酶病毒，多形瘤病毒，腺病毒或猿猴病毒40(SV40)，或获自哺乳动物细胞诸如人延伸因子1a(HEF1a)的启动子/增强子。
当使用SV40启动子/增强子时，可通过Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)较容易地表达抗体，且当使用HEF1a启动子/增强子时，可通过Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)较容易地表达抗体。
在利用大肠杆菌的情况下，可操作地连接有用的常规启动子、用于抗体分泌性信号序列和抗体基因，使得基因表达。启动子包括lacz启动子和araB启动子。当使用lacz启动子时，抗体基因可通过Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)来表达，或当使用araB启动子时，抗体基因可通过Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)来表达。
作为用于抗体分泌的信号序列，当抗体在大肠杆菌的卵周质中产生时，可使用pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。卵周质中产生的抗体被分离之后，抗体的结构被恰当地再折叠和使用。
复制起点可以来源于SV40，多形瘤病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒(BPV)等等。此外，为扩增宿主细胞系统中的基因的拷贝数，表达载体可含有氨基糖苷类转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等等作为选择标记。
为产生用于本发明中的抗体，可使用任意的表达系统诸如真核细胞系统或原核细胞系统。真核细胞的实例包括动物细胞诸如建立的哺乳动物细胞系或昆虫细胞系的细胞，以及丝状真菌细胞和酵母细胞。原核细胞的包括细菌细胞诸如大肠杆菌细胞。
优选地，本发明中使用的抗体在哺乳动物细胞诸如CHOC，OS，骨髓瘤，BHK，Vero或HeLa细胞中表达。
然后，体外或体内培养转化的宿主细胞，使得宿主细胞产生目的抗体。宿主细胞可根据已知的方法进行培养。例如，DMEM，MEM，RPMI1640，IMDM等等可被用作培养基。血清液诸如胎牛血清(FCS)可被组合使用。
如上所述表达和产生的抗体可分离自细胞或宿主动物，并纯化为具有均一性。可利用亲和柱进行用于本发明的抗体的分离和纯化。蛋白A柱的实例为HyperD，POROS，SepharoseF.F.(Pharmacia)。任意其它标准的分离和纯化蛋白质的方法可以被使用。例如，除了上述亲和柱之外的层析柱，过滤，超滤，盐析，透渗析等等可被适当地选择和组合使用，从而分离和纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
2.GPC3的检测本发明所检测的GPC3没有特定的限制，且可以是全长的GPC3或其片段。当检测GPC3片段时，片段可以是N-末端或C-末端片段，且优选地为N-末端片段。或者，待检测的GPC3可以是硫酸乙酰肝素等所附着的GPC3蛋白，或GPC3核心蛋白。
试验样品中GPC3蛋白质的检测方法没有具体地限制。优选地，GPC3蛋白通过免疫学方法利用抗-GPC3抗体来检测。免疫学方法的实例包括放射免疫测定法，酶免疫分析，荧光免疫分析，发光免疫测定，免测沉淀法，免疫-比浊分析法，Western印迹，免疫染色以及免疫扩散技术。优选的检测方法为酶免疫分析，且尤其优选为酶联免疫吸附(ELISA)(例如，夹心ELISA)。上述的免疫学方法诸如ELISA可通过本领域的技术人员公知的方法来进行。
利用抗-GPC3抗体的常规检测方法的实例包括在载体上固定抗-GPC3抗体，将试验样品加至载体，温育载体来将GPC3蛋白结合于抗-GPC3抗体，冲洗，然后通过抗-GPC3抗体检测结合于载体的GPC3蛋白来检测试验样品中的GPC3蛋白。
本发明载体的实例包括不溶性的载体诸如不溶性的多糖(例如，琼脂糖或纤维素)，合成树脂(例如，硅树脂，聚苯乙烯树脂，聚丙烯酰胺树脂，尼龙树脂或聚碳酸酯树酯)以及玻璃。这些载体可以磁珠或微孔板的形式使用。在磁珠的情况下，柱等可以装满磁珠。在微孔板的情况下，多-孔微孔板(例如，96-孔多-孔微孔板)，生物传感器芯片等可以被使用。抗-GPC3抗体可通过任一的常规方法诸如化学结合或物理吸附与载体结合。在这里使用的大部分载体是可市售获得的。
抗-GPC3抗体与GPC3蛋白的结合通常在缓冲液中进行。缓冲液包括，例如，磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，柠檬酸缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。温育在已通常使用的条件下进行，例如，在4℃到室温的温度下温育1至24小时。温育后用不干扰GPC3蛋白与抗-GPC3抗体结合的任意溶液进行冲洗。例如，使用含有表面活性剂诸如Tween20的缓冲液。
在本发明检测GPC3蛋白的方法中，除含有待测GPC3蛋白的试验样品外，还可以设置对照样品。对照样品的实例包括不含有GPC3蛋白的阴性对照样品以及含有GPC3蛋白的阳性对照样品。在这种情况下，获自试验样品的结果与不含有GPC3蛋白的阴性对照的结果以及含有GPC3蛋白的阳性对照样品的结果相比较，从而检测试验样品中的GPC3蛋白。此外，制备具有连续不同浓度的一系列对照样品，获得每一对照样品的检测结果作为数值，制定标准曲线。根据标准曲线，可由获自试验样品的数值来定量测定试验样品中包含的GPC3蛋白。
一个优选的通过抗-GPC3抗体检测结合于载体的GPC3蛋白的实施方案为利用用标记物质标记的抗-GPC3抗体的检测方法。
例如，试验样品被允许与固定在载体上的抗-GPC3抗体接触。冲洗后，利用特异性识别GPC3蛋白的标记抗体来检测GPC3蛋白。
抗-GPC3抗体可通过已知的常规方法进行标记。标记物质是本领域技术人员公知的，诸如荧光染料，酶，辅-酶，化学发光物质或放射性物质可被使用。标记物质的特异性实例包括放射性同位素(例如，32P，14C，125I，3H和131I)，荧光素，若丹明，丹黄酰氯，伞形酮，荧光素酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，辣根过氧化酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，微过氧化物酶以及生物素。当使用生物素作为标记物质时，在添加生物素标记的抗体之后，其优选进一步加入结合于酶诸如碱性磷酸酶的抗生物素蛋白。为了结合标记物质与抗-GPC3抗体，可使用任意已知的方法诸如戊二醛法，马来酰亚胺法，吡啶基二硫化法或高碘酸法。
具体地，将含有抗-GPC3抗体的溶液添加给载体诸如微孔板以使抗-GPC3抗体固定在载体上。冲洗微孔板之后，用例如BSA，明胶，白蛋白等等封闭以避免蛋白的非特异性结合。再次冲洗微孔板之后，将试验样品添加至微孔板中。温育后，冲洗微孔板，然后加入已标记的抗-GPC3抗体。进行适当的温育后，冲洗微孔板，然后检测微孔板上保留的标记的抗-GPC3抗体。通过本领域技术人员公知的方法进行检测。例如，在用放射性物质标记的情况下，通过液体闪烁法或RIA法检测标记的抗体。在用酶标记的情况下，加入底物，并通过分光光度计检测底物酶促反应诸如显色的结果。底物的特异性实例包括2，2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)二胺盐(ABTS)，1，2-苯二胺(邻-苯二胺)以及3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TME)。在用荧光物质标记的情况下，标记抗体可通过荧光计进行检测。
本发明PC3蛋白检测方法的尤其优选的实施方案利用了生物素标记的抗-GPC3抗体和抗生物素蛋白。
具体地，将含有抗-GPC3抗体的溶液添加给微孔板诸如微孔板以使抗-GPC3抗体被固定在微孔板上。冲洗微孔板并用BSA等进行封闭以避免蛋白的非特异性结合。再次冲洗微孔板之后，然后将试验样品添加至微孔板中。温育后，冲洗微孔板，然后加入生物素标记的抗-GPC3抗体。适当的温育后，冲洗微孔板，然后加入与酶诸如碱性磷酸酶或者过氧化物酶共轭结合的抗生物素蛋白。温育后，冲洗微孔板，加入与抗生物素蛋白结合的酶对应的底物，然后利用显示底物的酶促改变的指示剂检测GPC3蛋白。
本发明另一个GPC3蛋白检测方法的实施方案包括利用特异性识别GPC3蛋白的初级抗体，以及特异性识别初级抗体的次级抗体。
例如，使试验样品与固定在支持物上的抗-GPC3抗体接触。在温育和冲洗后，利用初级抗-GPC3抗体和特异性识别初级抗体的次级抗体检测冲洗后GPC3蛋白的结合。在这种情况下，次级抗体优选地用标记物质标记。
具体地，将含有抗-GPC3抗体的溶液添加至载体诸如微孔板中以使抗-GPC3抗体固定于微孔板。冲洗微孔板并用BSA等进行封闭以避免蛋白的非特异性结合。再次冲洗微孔板之后，然后将试验样品添加至微孔板中。温育和冲洗后，加入初级的抗-GPC3抗体。适当温育后，冲洗微孔板。随后，加入特异性识别初级抗体的次级抗体。适当温育后，冲洗微孔板，然后检测微孔板上保留的次级抗体。次级抗体可通过以上所描述的方法进行检测。
本发明另一个GPC3蛋白检测方法的实施方案包括利用凝集反应。在此方法中，利用抗-GPC3抗体致敏的载体来检测GPC3。任意载体可被用于抗体的敏化，只要其是不溶的，不引起非特异性反应并稳定。例如，胶乳粒子，膨润土，火棉胶，高岭土或固定化绵羊红细胞可被使用。优选地使用胶乳粒子。本发明中使用的胶乳粒子包括，例如，聚苯乙烯胶乳粒子，苯乙烯-丁二烯共聚物胶乳粒子或聚乙烯甲苯胶乳粒子。优选地使用聚苯乙烯胶乳粒子。致敏粒子与样品混合，然后搅拌混合物一段时间来观察凝集作用。样品中包含的GPC3抗体的浓度越高，所观察到的粒子的凝集程度越大。由此，可通过肉眼观察凝集作用来检测GPC3。此外，GPC3还可以通过利用分光光度计等测定凝集作用产生的混浊度来测定。
本发明另一个GPC3蛋白检测方法的实施方案包括一个利用所述表面细胞质团谐振现象的生物传感器。通过利用表面细胞质团谐振现象的生物传感器，可仅利用没有标记的痕量蛋白以表面细胞质团共振信号的形式实时地观察蛋白质-蛋白质相互作用。例如，通过利用BIAcore的生物传感器(Pharmacia)等，可检测GPC3蛋白与抗-GPC3抗体的结合。具体地，使试验样品与已经固定了抗-GPC3抗体的传感器芯片接触，然后根据共振信号的变化可检测结合于抗-GPC3抗体的GPC3蛋白。
本发明的检测方法也可以利用各种自动测试系统自动进行，使得可同时测试大量的样品。
本发明的另一个目的是提供检测试验样品中的GPC3蛋白来诊断癌症的诊断试剂或试剂盒。本发明的诊断试剂或试剂盒至少含有抗-GPC3抗体。当诊断试剂或试剂盒基于ELISA方法时，试剂或试剂盒可含有用于固定抗体的载体，或抗体预先已结合于载体。当诊断试剂或试剂盒基于利用载体诸如胶乳的凝集作用方法时，试剂或试剂盒可含有具有吸附在其上抗体的载体。此外，试剂盒也可适当地含有封闭溶液，反应溶液，反应终止溶液，处理样品的试剂，等等。
附图的简要说明
图1显示了利用基因芯片分析GPC3 mRNA表达的结果。图1A显示GPC3的表达，以及图1B显示了α-胎蛋白(AFP)的表达。横坐标上的NL，CH，LC，WD，MD和PD分别表示正常的肝脏，慢性肝炎部位，肝硬化部位，高度分化恶性肿瘤，中度-分化恶性肿瘤以及低度-分化恶性肿瘤。
图2表示纯化的硫酸乙酰肝素-附着的GPC3和GPC3核心蛋白的CBB染色的图像。
图3显示了人肝癌中GPC3基因的表达。
图4显示了利用抗-GPC3抗体可溶性核心蛋白进行Western印迹的结果。
图5显示了利用抗-GPC3抗体进行夹心ELISA的原理。
图6表示利用M6B1和M18D4进行GPC3夹心ELISA的标准曲线。
图7为表示GPC3结构的示意图。
图8表示ELISA中抗-GPC3抗体的组合。
图9表示利用不同抗-GPC3抗体组合的GPC3夹心ELISA系统的标准曲线。
发明的最佳实施方式本发明具体描述如下。然而，本发明不受这些实施例的限制。
在本申请说明书中描述的实施例中，使用下列的材料。
作为可溶性GPC3和可溶性GPC3核心蛋白的表达载体，使用已通过导入DHFR基因和新霉素-抗性基因到pCAGGS中来制备的pCXND2和pCXND3。
在这里使用的DXB11细胞购自ATCC。为了进行培养，使用5％FBS(GIBCO BRL CAT#10099-141，LOT#A0275242)/极限必需培养基α培养基(αMEM(+))(GIBCO BRL CAT#12571-071)/1％青霉素-链霉素(GIBCO BRL CAT#15140-122)。为筛选DXB11细胞，500μg/mL遗传霉素(GIBCO BRL CAT#10131-027)/5％FBS/(不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的αMEM(GIBCO BRL CAT#12561-056)(αMEM(-))/PS被单独使用或与补充终浓度为25nM的MTX一起使用。
在这里使用的HepG2细胞购自ATCC，并维培养在10％FBS/Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(GIBCO BRLCAT#11995-065)/PS中。
杂交瘤培养在10％FBS/RPMI1640/1×HAT补料培养基中，(SIGMACAT#H-0262)/0.5×BM-Condimed H1杂交瘤克隆补料培养基(RocheCAT#1088947)中。
实施例1人GPC(GPC3)cDNA的克隆和表达分析编码人磷脂酰肌醇聚糖3(以下简称GPC3)的全长cDNA的克隆利用通过标准方法由结肠癌细胞系Caco2作为模板制备的第一链cDNA和Advantage2试剂盒(CLONTECH，Cat.No8430-1)进行PCR反应来扩增编码人GPC3的全长cDNA。具体地，50μl含有2μl获自Caco2的cDNA，1μl正义引物(SEQ ID NO1)，1μl反义引物(SEQ ID NO2)，5μl的Advantage2 10×PCR缓冲液，8μldNTP混合物(1.25mM)，以及1.0μl的Advantage聚合酶混合物的反应溶液被用于35个循环的由94℃1分钟，63℃30秒以及68℃3分钟组成的反应循环。利用ABI3100DNA测序仪对PCR扩增产物(利用pGEM-T Easy载体系统I(Promega，Cat.No.A1360)插入在TA载体pGEM-T easy中)进行测序来确定编码全长人GPC3的cDNA被分离。序列SEQ ID NO3表示人GPC3基因的核苷酸序列，且序列SEQ ID NO4表示人GPC3蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO1GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGTSEQ ID NO2GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC利用基因芯片分析人GPC3 mRNA的表达利用GeneChipTMUG95A Target(Affymetrix)分析24个肝癌病例(高度分化恶性肿瘤WD；中度分化恶性肿瘤MD；低度-分化恶性肿瘤PD)，16个非肝癌病例(慢性肝炎部分CH；肝硬化部分LC))以及8个正常肝脏病例(NL)的样品中mRNA的表达。这些样品在告知许可的情况下获自东京大学医学研究生院和医学院，以及Saitama肿瘤中心。具体地，利用ISOGEN(Nippon基因有限公司)由上述的各种组织制备总的RNA，然后根据表达分析技术手册(Affymetrix)对15μg的各种总RNA进行基因表达分析。
如图1所示，可观察到在很多病例中无论肝癌的任意分化阶段，肿瘤组织中人GPC3基因(探针系列ID39350_at)的mRNA的表达比正常肝脏组织中的高。此外，人GPC3基因的mRNA表达量与α胎蛋白(探针系列ID40114_at)的mRNA表达量进行比较，其中甲胎蛋白是目前最经常使用的肝癌诊断标记。结果，在高度分化癌病例中观察到GPC3充分地增强mRNA的表达，其中几乎没有观察到α胎蛋白mRNA的表达，且其显示了GPC3的增强的mRNA表达的发生率高于AFP。基于以上所述的结果，我们认为GPC3检测可用于作为肝癌的早期诊断方法。
实施例2抗-GPC3抗体的制备可溶性人GPC3的制备制备在C-末端侧缺少疏水性区的可溶性GPC3蛋白作为制备抗-GPC3抗体的材料。
利用含有全长人GPC3 cDNA的质粒DNA构建可溶性GPC3cDNA表达质粒DNA，其中全长的人GPC3 cDNA由东京大学的尖端科学和技术研究中心提供。利用设计用于消除C-末端侧疏水性区域(氨基酸564到氨基酸580)的下游引物(5′-ATA GAA TTC CAC CAT GGCCGG GAC CGT GCG C-3′(SEQ ID NO5))和含有EcoRI识别序列和Kozak序列的上游引物(5′-ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATGAAC GTT C-3′(SEQ ID NO6))进行PCR。由此获得的PCR片段(1711bp)被克隆到pCXND2-Flag中。将由此制备的表达质粒DNA导入到CHO细胞系DXB11中。通过利用500μg/mL遗传霉素选择获得高度表达可溶性GPC3的CHO细胞系。
利用1700cm2摇瓶进行高度表达可溶性GPC3的CHO细胞系的大规模培养。收集并纯化培养上清液。培养上清液被用于DEAE琼脂糖速流柱(Amersham CAT#17-0709-01)。冲洗后，用含有500mM NaCl的缓冲液洗脱产物。然后，利用抗-Flag M2琼脂糖亲合凝胶(SIGMACAT#A-2220)亲合纯化产物，并通过200μg/mL的FLAG肽进行洗脱。利用Centriprep-10(Millipore CAT#4304)浓缩后，通过利用Superdex 200HR 10/30(Amersham CAT#17-1088-01)凝胶过滤除去FLAG肽。最后，利用DEAE琼脂糖速流柱浓缩蛋白，并利用不含Tween20的PBS(含有500mM NaCl)进行缓冲液置换来进行洗脱。
可溶性人GPC3核心蛋白的制备利用上述的野生型人GPC3 cDNA作为模板进行装配PCR来制备第495丝氨酸和第509丝氨酸被用丙氨酸取代的cDNA。此时，设计引物在其C-末端添加His标记。将由此获得的cDNA克隆到pCXND3载体中。将由此制备的表达质粒DNA导入到DXB11细胞系中。通过利用500μg/mL遗传霉素筛选获得高度表达可溶性GPC3核心蛋白的CHO细胞系。
利用1700cm2摇瓶进行大规模培养。收集和纯化培养上清液。培养上清液被用于Q琼脂糖速流柱(Amersham CAT#17-0510-01)。冲洗后，利用含有500mM NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱产物。然后，利用螯合琼脂糖速流柱(Amersham CAT#17 0575-01)亲合纯化产物，并用10到150mM梯度的咪唑洗脱。最后，利用Q琼脂糖速流柱浓缩产物，然后利用含有500mM NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示50到300kDa的模糊条带和一个大约40kDa的条带。图2显示了电泳的结果。GPC3是一种在69kDa的C-末端具有硫酸乙酰肝素添加序列的蛋白多糖。模糊条带被认为是用硫酸乙酰肝素修饰的GPC3。氨基酸测序显示大约40kDa的条带含有GPC3 N-末端侧的片段，这表明GPC3已受到一定的裂解。
为除去在下面杂交瘤筛选中抗硫酸乙酰肝素的抗体，可溶性GPC3核心蛋白被制备。也即，两个用作硫酸肝素添加信号序列的氨基酸残基丝氨酸495和丝氨酸509被用丙氨酸取代。如上所述制备高度表达蛋白的CHO细胞系，然后利用His-标记亲和纯化培养物上清液。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出70kDa，40kDa和30kDa的三个条带。氨基酸测序揭示30kDa的条带是GPC3的C-末端侧上的片段，此表明了GPC3在358精氨酸和359丝氨酸之间已经受到酶的裂解。在硫酸乙酰肝素-附着的GPC3中没有观察到30kDa的条带，可能是因为硫酸乙酰肝素附着于GPC3引起了条带模糊。GPC3在特定的氨基酸序列被酶解的事实是一种新的发现，且其生物学意义还没有被说明。
根据这些结果，我们假定薄膜上的GPC3也在肝癌患者中被裂解，且可溶性类型的GPC3被分泌在血液中。早期肝癌患者中的GPC3与AFP相比具有较高水平的基因表达，其中AFP是肝癌肿瘤标记物(图1)。因此，为研究GPC3作为比AFP具有较高临床实用性的可能的新肿瘤标记物的能力，根据实施例2以及随后实施例所描述的方法制备抗-GPC3抗体和构建夹心ELISA系统。
抗-GPC3抗体的制备因为人GPC3和小鼠GPC3具有氨基酸水平94％的高度同源性，其被认为当用人GPC3免疫正常小鼠时很难获得抗-GPC3抗体。由此，具有自身免疫疾病MRL/lpr小鼠的被用于免疫接种。用可溶性GPC3免疫5个MRL/lpr小鼠(CRL)。制备100μg/小鼠的免疫蛋白用于首次免疫，然后利用FCA(弗氏完全佐剂(H37 Ra)，Difco(3113-60)，BectonDickinson(cat#231131))乳化。乳化产物经皮下给药。两周以后，制备50μg/小鼠的蛋白，然后利用FIA(弗氏不完全佐剂，Difco(0639-60)，Becton Dickinson(cat#_263910))进行乳化。乳化产物经皮下给药。随后，以1-周的间隔加强免疫总共5次。为进行最终的免疫，蛋白被以50μg/小鼠稀释在PBS中，然后经由臀脉给药。通过利用涂布GPC3核心蛋白的免疫平板进行ELISA证明抗GPC3的饱和血清抗体效价之后，在PEG1500(Roche Diagnostics，cat#783 641)的存在下混合小鼠脾细胞与P3U1小鼠骨髓瘤细胞来使细胞融合。融合细胞被接种在96-孔培养皿上，并利用HAT培养基从第二天开始选择，然后通过ELISA筛选培养物上清液。通过极限稀释法对阳性克隆进行单克隆化，继之以扩大培养，然后收集培养物上清液。通过利用与作为指示剂的GPC3核心蛋白的结合活性进行ELISA筛选，由此获得了6个具有强结合能力的抗-GPC3抗体。
用Hi Trap ProteinG HP(Amersham CAT#17-0404-01)纯化抗体。杂交瘤培养物上清液被直接上柱。用结合缓冲液(20mM磷酸钠(pH7.0))冲洗后，用洗脱缓冲液(0.1M glycine-HCl(pH2.7))洗脱抗体。洗脱物被收集在含有中和缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0))的试管中，使得产物被立即中和。收集抗体部分以及经抗0.05％Tween20 PBS过夜透析来替换缓冲液。将0.02％的NaN3添加给纯化的抗体，然后4℃储存混合物。
抗-GPC3抗体的分析用山羊抗-小鼠IgG(γ)(ZYMED CAT#62-6600)和碱性磷酸酶-山羊抗-小鼠IgG(γ)(ZYMED CAT#62-6622)进行小鼠IgG夹心ELISA。利用市售的纯化小鼠IgG1抗体(ZYMED CAT#02-6100)作为标准测定抗体浓度。
利用ImmunoPure单克隆抗体同种型试剂盒II(PIERCECAT#37502)按照所附的说明书进行抗-GPC3抗体的同种分型。同种分型的结果表明所有的抗体为IgG1型。
通过利用GPC3核心蛋白的Western印迹进行抗-GPC3抗体的表位分类。可溶性GPC3核心蛋白被以100ng/泳道用于10％SDS-PAGEmini(TEFCO CAT#01-075)。电泳之后(60V 30分钟，120V 90分钟)，利用转移-印迹半干电泳转移细胞(BIO-RAD)转移蛋白(15V 60分钟)至immobilon-P(MilliporeCAT#IPVHR85 10)。用TBS-T(0.05％Tween20，TBS)简单冲洗薄膜，然后振荡1小时(在室温下)或与含有5％脱脂乳的TBS-T一起振荡过夜(4℃)。与TBS-T振荡大约10分钟之后，加入用含有1％脱脂乳的TBS-T稀释至0.1至10μg/mL的各种抗-GPC3抗体，然后振荡1小时。用TBS-T冲洗后(10分钟×3次)，加入用含有TBS-T的1％脱脂乳稀释至1/1000的HRP-抗-小鼠IgG抗体(AmershamCAT#NA931)。振荡1小时后，用TBS-T冲洗薄膜(10分钟×3次)，利用ECL-Plus(Amersham RPN2132)展开，并在HyperfilmECL(Amersham CAT#RPN2103K)上成像。图4显示了Western印迹分析的结果。抗体根据抗体与识别N-末端上表位的40kDa条带反应，以及抗体与识别C-末端上表位的30kDa条带反应的事实进行分类。获得了识别N-末端侧的M6B1，M18D4和M19B11抗体，以及识别C-末端侧的M3C11，M13B3和M3B8抗体。利用BIACORE分析的结果，每一抗体的KD值在0.2和17.6nM之间。
实施例3可溶性GPC3的检测鼠异种移植模型3,000,000个HepG2人肝癌细胞被皮下移植到6周龄雌性SCID小鼠(Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl，CLEA Japan，Inc.)和裸鼠(BALB/cAJcl-nu，CLEA Japan，Inc.)的腹部。53天后(当肿瘤团已经充分地形成)，经HepG2-移植SCID小鼠#1，3和4的后腔静脉收集全血。利用Niproneo管(真空血液-收集管，NIPRO，NT-EA0205)在EDTA-2Na和抑肽酶的存在下制备血浆，然后-20℃储存至测定。此外，在移植HepG2后的第62天由HepG2-移植的SCID小鼠#2，以及移植后的第66天由HepG2-移植的裸鼠#1和2通过后腔静脉收集全血。作为对照，也通过类似过程由相同年龄的正常SCID小鼠制备血浆。
夹心ELISA为检测血液中的可溶性GPC3，构建GPC3的夹心ELISA系统。用M6B1涂布96-孔微孔板，并通过与生物素标记的M18D4抗体检测结合于M6B1的GPC3。为进行显色，使用AMPAK(DAKO)来实现高灵敏度的检测。
涂布抗-GPC3抗体的96-孔免疫平板用10μg/mL的涂布缓冲液(0.1M NaHCO3(pH9.6)，0.02％(w/v)NaN3)进行稀释，然后4℃温育过夜。在第二天，用300μL/孔冲洗缓冲液(0.05％(v/v)Tween20，PBS)冲洗3次，然后加入200μl的稀释缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.1)，1mMMgCl2，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween20，0.02％(w/v)NaN3，1％(w/v)BSA)进行封闭。微孔板维持在室温下几个小时或4℃过夜，加入用稀释缓冲液适当稀释的小鼠血浆或培养物上清液，室温下温育1小时。用300μL/孔的RB冲洗3次后，加入10μg/ml的用稀释缓冲液稀释的生物素标记的抗-GPC3抗体，在室温下温育1小时。用300μL/孔的RB冲洗3次后，加入用稀释缓冲液稀释到1/1000的AP-链霉亲和素(ZYMED)，室温下温育1小时。用300μL/孔冲洗缓冲液冲洗5次后，利用AMPAK(DAKO CAT#K6200)按照所附操作说明进行显色。利用微板阅读器测定吸光率。
生物素标记试剂盒(CAT#1 418 165，Roche)被用于抗体的生物素酰化。利用GlaphPad PRISM数据表程序(GlaphPad software Inc.ver.3.0)计算样品中可溶性GPC3的浓度。图5显示了这些实施例中夹心ELISA的原理。
利用纯化的可溶性GPC3制备标准曲线，从而构建具有几个ng/mL的检测极限的系统。图6显示了利用M6B1和M18D4进行GPC3夹心ELISA的标准曲线。利用这些系统，尝试了上述HepG2和已移植HepG2人肝癌细胞的小鼠血清的培养物上清液中GPC3的检测。在HepG2的培养物上清液中以及在已移植HepG2人肝癌细胞的小鼠的血清中检测到可溶性GPC3，而对照培养基和对照小鼠血清中的可溶性GPC3水平却低于检测极限。当用纯化的可溶性GPC3的浓度表示时，HepG2培养物上清液中的浓度为1.2μg/ml，且在小鼠血清中为23到90ng/mL(表1)。
表1HepG2-移植小鼠的血浆中可溶性GPC3浓度的测定(ng/mL)
分泌性GPC3的结构研究GPC3在358精氨酸和359丝氨酸之间是否被裂解以及是否如预先假设的一样进行分泌。如果分泌性GPC3是N-末端片段，其不可能用利用识别N-末端的抗体以及识别C-末端抗体的组合的夹心ELISA检测到这类GPC3。利用三种类型的识别N-末端片段和识别C-末端片段的抗体，构建具有不同抗体组合的夹心ELISA系统。图7显示了分泌性可溶性GPC3的结构，且图8显示了抗体的组合。图9显示了夹心ELISA的标准曲线。表1显示测定的结果。如表1所示，利用抗体的组合在HepG2的培养物上清液中以及在已移植HepG2人肝癌细胞的小鼠的血清中检测到高水平的分泌性GPC3，其中的两种抗体都识别N-末端片段。相反，由包括识别C-末端片段的抗体的系统获得的检测结果低于在很多小鼠中的检测极限。因此，根据本发明的发现可以预料N-末端片段在分泌性GPC3中是主要的。
工业实用性如这些实施例所示，可以表明GPC3在肝癌细胞中高度表达，且一部分GPC3以分泌性蛋白的形式存在于血液中。因为观察到GPC3在癌组织中比肝癌标记AFP的基因表达较早的阶段进行基因表达，因此GPC3的检测被认为可用于癌症诊断。GPC3也被发现在除了肝癌之外的癌症的细胞系中表达，诸如肺癌，结肠癌，恶性肿瘤，前列腺癌，胰腺癌或淋巴瘤。因此，GPC3也可用于除了肝癌之外的癌症的诊断。
此外，在这里显示的可能性为在第358位精氨酸和第359位丝氨酸之间裂解的N-末端片段显著存在于分泌性GPC3中。因此，我们认为识别N-末端片段的抗体可用作诊断抗体。此外，如果识别C-末端片段的抗体被用作治疗肝癌的具有ADCC活性和CDC活性的抗体，其可能有效地达到肝癌细胞而不会被血液中的分泌型GPC3捕获。
在这里引用所有的出版物，专利和专利申请全部引入作为参考。因此，本领域技术人员很容易地理解没有脱离附加权利要求书所述的本发明的技术思想和范围的条件下，对本发明进行的大量修饰和变化可以在本发明的范围内。本发明目的是包括这些修饰和变化。
序列表<110>株式会社英仙蛋白质科学(PERSEUS PROTEOMICS INC.)<120>通过检测GPC3诊断癌症的方法(A method for diagnosing cancer by detectingGPC3)<130>SCT050747-47<140>PCT/JP03/11320<141>2003-09-04<150>PCT/JP02/08997<151>2002-09-04<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic DNA<400>1gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t31<210>2<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic DNA<400>2gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c31<210>3<211>2300<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(109)..(1851)<400>3cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc 60gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg 117Met Ala Gly1acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc agc ttg gac 165Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp5 10 15ttc ccg gga cag gcg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt 213Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys20 25 30 35cac caa gtc cgc tcc ttc ttc cag aga ctg cag ccc gga ctc aag tgg 261His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp40 45 50gtg cca gaa act ccc gtg cca gga tca gat ttg caa gta tgt ctc cct 309Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro55 60 65
aag ggc cca aca tgc tgc tca aga aag atg gaa gaa aaa tac caa cta 357Lys Gly Pro Thr Cys Cys Set Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu70 75 80aca gca cga ttg aac atg gaa cag ctg ctt cag tct gca agt atg gag 405Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu85 90 95ctc aag ttc tta att att cag aat gct gcg gtt ttc caa gag gcc ttt 453Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe100 105 110 115gaa att gtt gtt cgc cat gcc aag aac tac acc aat gcc atg ttc aag 501Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys120 125 130aac aac tac cca agc ctg act cca caa gct ttt gag ttt gtg ggt gaa 549Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu135 140 145ttt ttc aca gat gtg tct ctc tac atc ttg ggt tct gac atc aat gta 597Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val150 155 160gat gac atg gtc aat gaa ttg ttt gac agc ctg ttt cca gtc atc tat 645Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr165 170 175acc cag cta atg aac cca ggc ctg cct gat rca gcc ttg gac atc aat 693Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn180 185 190 195gag tgc ctc cga gga gca aga cgt gac ctg aaa gta ttt ggg aat ttc 741Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe200 205 210ccc aag ctt att atg acc cag gtt tcc aag tca ctg caa gtc act agg 789Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg215 220 225atc ttc ctt cag gct ctg aat ctt gga att gaa gtg atc aac aca act 837Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr230 235 240gat cac ctg aag ttc agt aag gac tgt ggc cga atg ctc acc aga atg 885Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met245 250 255tgg tac tgc tct tac tgc cag gga ctg atg atg gtt aaa ccc tgt ggc 933Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly260 265 270 275ggt tac tgc aat gtg gtc atg caa ggc tgt atg gca ggt gtg gtg gag 981Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu280 285 290att gac aag tac tgg aga gaa tac att ctg tcc ctt gaa gaa ctt gtg 1029Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val295 300 305aat ggc atg tac aga atc tat gac atg gag aac gta ctg ctt ggt ctc 1077Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu310 315 320ttt tca aca atc cat gat tct atc cag tat gtc cag aag aat gca gga 1125Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly325 330 335
aag ctg acc acc act att ggc aag tta tgt gcc cat tct caa caa cgc 1173Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg340 345 350 355caa tat aga tct gct tat tat cct gaa gat ctc ttt att gac aag aaa 1221Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys360 365 370gta tta aaa gtt gct cat gta gaa cat gaa gaa acc tta tcc agc cga 1269Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg375 380 385aga agg gaa cta att cag aag ttg aag tct ttc atc agc ttc tat agt 1317Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser390 395 400gct ttg cct ggc tac atc tgc agc cat agc cct gtg gcg gaa aac gac 1365Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp405 410 415acc ctt tgc tgg aat gga caa gaa ctc gtg gag aga tac agc caa aag 1413Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys420 425 430 435gca gca agg aat gga atg aaa aac cag ttc aat ctc cat gag ctg aaa 1461Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys440 445 450atg aag ggc cct gag cca gtg gtc agt caa att att gac aaa ctg aag 1509Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys455 460 465cac att aac cag ctc ctg aga acc atg tct atg ccc aaa ggt aga gtt 1557His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val470 475 480ctg gat aaa aac ctg gat gag gaa ggg ttt gaa agt gga gac tgc ggt 1605Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly485 490 495gat gat gaa gat gag tgc att gga ggc tct ggt gat gga atg ata aaa 1653Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys500 505 510 515gtg aag aat cag ctc cgc ttc ctt gca gaa ctg gcc tat gat ctg gat 1701Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp520 525 530gtg gat gat gcg cct gga aac agt cag cag gca act ccg aag gac aac 1749Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn535 540 545gag ata agc acc ttt cac aac ctc ggg aac gtt cat tcc ccg ctg aag 1797Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys550 555 560ctt ctc acc agc atg gcc atc tcg gtg gtg tgc ttc ttc ttc ctg gtg 1845Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val565 570 575cac tga ctgcctggtg cccagcacat gtgctgccct acagcaccct gtggtcttcc1901His580tcgataaagg gaaccacttt cttatttttt tctatttttt tttttttgtt atcctgtata 1961cctcctccag ccatgaagta gaggactaac catgtgttat gttttcgaaa atcaaatggt 2021atcttttgga ggaagataca ttttagtggt agcatataga ttgtcctttt gcaaagaaag 2081
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<223>Description of Artificial SequenceSynthetic DNA<400>5atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c31<210>6<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic DNA<400>6ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c3权利要求
1.一种诊断癌症的方法，其包括检测试验样品中的可溶性GPC3蛋白。
2.根据权利要求1的诊断癌症的方法，其中的可溶性GPC3蛋白是GPC3的N-末端肽。
3.根据权利要求2的诊断癌症的方法，其中GPC3的N-末端肽是在GPC3第1位氨基酸到第374位氨基酸的氨基酸序列中，或在GPC3第1位氨基酸到第358位氨基酸的氨基酸序列中所含的肽片段。
4.根据权利要求1到3任一项的诊断方法，其中的试验样品选自血液、血清和血浆。
5.根据权利要求1到4任一项的诊断方法，其中的癌症是肝癌。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，包括使用抗-GPC3抗体
7.根据权利要求6的方法，包括使用固定在载体上的抗-GPC3抗体以及用标记物质标记的抗-GPC3抗体。
8.根据权利要求7的方法，其中的标记物质是生物素。
9.一种癌症的诊断试剂，包括抗-GPC3抗体。
10.根据权利要求9的诊断试剂，包括固定在载体上的抗-GPC3抗体和用标记物质标记的抗体。
11.根据权利要求9或10的诊断试剂，其中的癌症是肝癌。
12.根据权利要求9到11任一项的诊断试剂，其中的抗-GPC3抗体识别GPC3的N-末端肽。
13.一种诊断试剂盒，包括抗-GPC3抗体。
14.根据权利要求13的诊断试剂盒，包括固定在载体上的抗-GPC3抗体，以及用标记物质标记的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种通过检测新的癌症标记诊断癌症的方法。通过检测试验样品中的可溶性磷脂酰肌醇聚糖3可进行癌症的诊断。
文档编号G01N33/574GK1678911SQ0382107
公开日2005年10月5日 申请日期2003年9月4日 优先权日2002年9月4日
发明者油谷浩幸, 绿川泰, 中野清孝, 大泉严雄, 伊藤行夫, 时田进 申请人:株式会社英仙蛋白质科学