专利名称：癌症疾病改善抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症疾病改善抗体(CDMAB)的分离和制备以及这些CDMAB在治疗和诊断过程中的应用，选择性地与一种或多种化疗试剂组合应用。本发明进一步涉及运用本发明的CDMAB进行的结合实验。
背景技术：
每个患有癌症的个体是独特的，正如人的身份有所不同，其所患癌症不同于其它癌症。尽管如此，当前治疗采用相同的方法治疗患有同类癌症处于同样阶段的所有病人。这些病人中至少有30％在一线治疗(first line treatment)中失败，由此造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、癌症转移和最终死亡的可能性。治疗的最佳方法是针对特定个体制定专门化疗法。当前唯一的专门化的疗法是外科手术。化疗和放疗不能针对病人进行设计，而手术本身在大多数病例中不足以治愈癌症。
伴随着单克隆抗体的出现，开发用于专门化治疗的方法的可能性变得更加现实，因为各抗体可以导向单个抗原决定簇。进一步地，制备导向一群抗原决定簇的抗体组合成为可能，这些抗原决定簇唯一地定义了特定个体的癌症。
在认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差异在于癌细胞含有转化细胞所特有的抗原后，科学界长期认为可以设计单克隆抗体通过与这些癌抗原专一性的结合专一地作用于转化细胞；由此产生信念认为单克隆抗体可以作为“魔术子弹”去除癌细胞。
根据本发明公开的方法分离出的单克隆抗体已经显示能够以有利于病人的方式改善癌症疾病的进程，例如通过降低肿瘤负荷。这些单克隆抗体在此被称作癌症疾病改善抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
当前，癌症病人的治疗选择通常很少。统一而严格的癌症治疗方法在整体存活和发病率方面有所改善。然而，对于特定个体，这些改善了的统计数字和他们个人情况的改善没有必然关联。
因此，如果采用方法学使得操作者能够在同组病人中独立于其他病人治疗每一例癌症，该方法学将允许针对每个人进行独特设计的治疗。理想地，这样的治疗过程将提高治愈率，产生更好的效果，由此满足长期需要。
历史上，多克隆抗体在人癌症的治疗中已取得了有限的成功。已经采用人血浆对淋巴瘤和白血病进行了治疗，但是几乎没有长期的缓解或应答。此外，该方法缺乏可重复性，和化疗相比没有额外的益处。已经采用人全血、黑猩猩血清、人血浆和马血清对实体瘤如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌进行了治疗，相应产生了无法预测和无效的结果。
已经进行了很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在20世纪80年代针对人乳腺癌进行了至少4次临床实验，用针对特定抗原或基于组织选择性的抗体在至少47名病人中只产生了1名应答者。直到1998年才使用人源化抗Her 2抗体结合顺铂进行了成功的临床实验。在该实验中对37名病人的应答进行了观察，其中大约四分之一有部分应答率，另一半具有较慢或稳定的疾病进程。
研究结直肠癌的临床实验采用了针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。诸如对腺癌有一定专一性的17-1A抗体，已经进入了二期临床，在60名病人中只有1名产生了部分应答。在其它实验中，在附加使用环磷酰胺的方法中，17-1A的使用在52名病人中只产生了一个完全应答和两个微弱应答。其它使用17-1A的实验产生的效果相似。起初被批准用来成像的人源化鼠单克隆抗体的使用同样不能引起肿瘤的消退。迄今为止还没有能够有效治疗结直肠癌的抗体。同样的，对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗效果均不能令人满意。用抗GD3单克隆抗体治疗黑素瘤已经取得了有限的成功。因此，可以看出尽管有成功的小动物实验，这些实验是人临床试验的前提，已测试的抗体大部分还是无效的。
现有专利美国专利号5,750,102公开了一种用MHC基因转染病人肿瘤细胞的过程，MHC基因可以从病人的细胞或组织克隆。随后用这些转染的细胞对病人进行预防接种。
美国专利号4,861,581公开的过程包括的步骤有获取对哺乳动物肿瘤和正常细胞的一种细胞内组分而非胞外组分具有专一性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将标记后的抗体与接受治疗的哺乳动物组织进行接触以杀死肿瘤细胞；以及通过测定标记抗体与降解的肿瘤细胞胞内组分的结合确定疗效。在制备针对人胞内抗原的抗体时，专利权人认识到恶性细胞代表了这类抗原的便捷来源。
美国专利号5,171,665提供了一种全新抗体及该抗体的制备方法。特别地，该专利对一种单克隆抗体的形成进行了揭示，该单克隆抗体可以和人肿瘤相关蛋白抗原发生很强地结合，例如结肠癌和肺癌，但和正常细胞的结合程度小得多。
美国专利号5,484,596提供了一种癌症治疗的方法，该方法包括从癌症患者体内手术去除肿瘤组织；处理肿瘤组织获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其可以存活但不再是致瘤的；以及采用这些细胞为病人制备疫苗，该疫苗能够抑制原发瘤的复发并同时抑制肿瘤转移。该专利对与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发进行了指导。如第4列第45行及其以后所述，专利权人用内源性肿瘤细胞开发单克隆抗体，在人肿瘤形成中形成有活性的专一免疫疗法。
美国专利号5,693,763提供了以人癌症为特征的糖蛋白抗原，且其不依赖于其来源的上皮组织。
美国专利号5,783,186提出了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体，生成抗体的杂交瘤细胞系，用抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利号5,849,876描述了新的杂交瘤细胞系，该细胞系可生成从肿瘤和非肿瘤组织源中纯化出的粘蛋白抗原的单克隆抗体。
美国专利号5,869,268提出了人淋巴细胞的生成方法，该淋巴细胞产生专一针对目标抗原的抗体，生产单克隆抗体的方法以及用这种方法生产的单克隆抗体。该专利特别提到一种抗-HD人单克隆抗体的制备，该抗体可用于癌症的诊断和治疗。
美国专利号5,869,045涉及与人体癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机制是双重的，分子与人癌表面上的细胞膜抗原反应，进一步地抗体在结合之后能够内化进癌细胞，使它们特别适于形成抗体-药物和抗体-毒素偶联物。在特定浓度下未修饰的抗体同样具有明显的细胞毒性。
美国专利号5,780,033公开了自身抗体在肿瘤治疗和预防中的应用。但是，该抗体是源自老年哺乳动物的抗细胞核自身抗体。在该例中，自身抗体据称是免疫系统中发现的一类天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，因此不要求自身抗体真正来自接受治疗的病人。此外该专利公开了老年哺乳动物中的天然和单克隆抗核自身抗体，以及制备单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
发明内容
本发明的发明者此前已被授予名为“个性化的病人专一性抗癌抗体(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美国专利6,180,357。该专利提出了个性化定制的用于治疗癌症疾病的抗癌抗体的选择方法。
本申请使用‘357专利中制备病人专一性抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，这些细胞系编码癌症疾病改善单克隆抗体。这些抗体可以专一性地针对一种肿瘤制备，由此使得癌症治疗的专门化成为可能。在本申请全文中，具有杀死细胞(细胞毒性的)或抑制细胞生长(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在此后将被称作细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的定级和诊断，也可用于肿瘤转移的治疗。
个性化抗癌治疗的前景将给病人的管理方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并储存肿瘤样品。通过这个样品，可以用一组既存的癌症疾病改善抗体检测肿瘤的类型。病人将会按常规定级但是适用的抗体可以用于对病人进一步的定级。可以用存在的抗体立即对病人进行治疗，一组肿瘤专一抗体可以使用在此概述的方法或通过噬菌体表面展示文库结合在此记载的筛选方法制备。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤存在部分相同的抗原决定簇。根据本方法生产的抗体可用于治疗任意数量病人的癌症疾病，如果这些病人的癌症可以与这些抗体结合。
除了抗癌抗体，病人可以选择接受目前推荐的治疗方法作为多重模式治疗策略的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌症细胞相对无毒，这使得抗体组合物可以在高剂量下独立使用或与传统治疗结合使用。高的治疗指数还允许在短时间内进行再治疗，由此应当可以降低对治疗产生抗性的细胞出现的可能性。
此外，将标准化疗模式如放射核与本发明的CDMAB偶联由此关注所述化疗的应用在本发明的范围内。
如果病人的治疗起始阶段或转移发展难以控制，可以重复生成肿瘤专一性抗体的过程以进行再治疗。此外，抗癌抗体可以与患者的血红细胞偶联并重新注射入患者体内用于转移的治疗。对于转移型癌症几乎还没有有效的疗法且转移通常意味着很不理想的治疗效果并导致死亡。但是，转移型癌症通常高度血管化，通过血红细胞传递抗癌抗体可以在肿瘤位点聚集抗体。甚至在转移前，很多癌症细胞的存活依赖于宿主血液的供应，与血红细胞偶联的抗癌抗体也可以有效对抗原发肿瘤。可选择地，抗体也可以和其它造血细胞偶联，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。
抗体分为五类，每一类抗体均由重链赋予其相关功能。通常认为裸抗体杀死癌细胞是由抗体依赖的细胞毒性或补体依赖的细胞毒性介导的。例如鼠的IgM和IgG2a抗体可以通过与补体系统C-1组分的结合激活人体的补体，由此激活经典的补体激活通路并引起肿瘤的退化。对于人抗体而言，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠的IgG2a和IgG3同型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，这些受体将导致细胞被单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞杀死。人的IgG1和IgG3同型抗体介导ADCC。
通过抗体介导杀死癌症的另一种可能的机制可能是通过使用能够催化细胞膜以及其相关糖蛋白或糖脂内多种化学键的水解的因此被称作催化抗体的抗体。
抗体介导杀死癌细胞的另外两种机制被更为广泛地接受。第一种机制是使用抗体作为疫苗，诱导身体针对肿瘤细胞上的推定癌症抗原产生免疫反应。第二种机制是使用抗体靶向生长受体并干扰受体功能或下调受体的表达由此有效地造成受体功能丧失。
因此，本发明的目的是利用通过从特定个体衍生出的细胞中制备癌症疾病改善抗体的方法，来分离杂交瘤细胞系以及相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离出的单克隆抗体和其抗原结合片段，该疾病改善抗体对癌症细胞有细胞毒性而同时对非癌症细胞相对无毒。
本发明的另一个目的是对癌症疾病改善抗体及其抗原结合片段进行指导。
本发明进一步的目的是制备癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性通过抗体依赖细胞毒性介导。
本发明的另一目的是制备癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性通过补体依赖细胞毒性介导。
本发明的进一步目的是制备癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性作为其催化细胞化学键水解能力的一种功能。
本发明的进一步的目的是制备癌症疾病改善抗体用于癌症诊断、预后和监测的结合实验。
本发明的其它目的和优势通过以下说明将是显而易见的，该说明通过本发明的图解和例证、特定具体实施方案进行。
图1包含10A304.7抗体、同型对照抗体、抗EGFR抗体对数种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。
实施例1杂交瘤制备——杂交瘤细胞系10A304.7
根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系10A304.7在2002年11月26日保藏于美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，弗吉尼亚马纳萨斯大学大街10801，20110-2209，其保藏号为PTA-5065。根据37CFR1.808，保藏者保证在专利授权后将永久取消被保藏材料在公众使用方面的所有限制。
为了制备产生抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备来自于HT-29结肠癌细胞系的SCID小鼠中生长的结肠瘤单细胞悬浮液。温和振荡IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，荷兰)佐剂备用。在微离心管中将100微升IMMUNEASYTM小鼠佐剂加入1千万个HT-29细胞中并混合且在室温放置15分钟。通过向8-9周大的BALB/c小鼠肌肉注射100微升含有2.5百万个细胞的抗原-佐剂使小鼠免疫。在初始免疫两周后用新鲜制备的含有2.5百万个细胞的250微升抗原-佐剂通过腹膜内注射激活免疫后的小鼠。在最后一次免疫至少两天后使用脾进行融合。通过融合分离出的脾细胞和NSO-1骨髓瘤细胞制备杂交瘤。对融合物的上清液进行杂交瘤亚克隆检测。
为了确定通过杂交瘤细胞分泌出的抗体是否是IgG或IgM同型抗体，进行了ELISA实验。将含有浓度为2.4μg/ml的羊抗鼠IgG+IgM(H+L)的包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.2-9.6)在4℃按100μl/孔加入ELISA板中过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)将ELISA板洗3次。将封闭缓冲液(含有5％牛奶的洗涤缓冲液)按100μl/孔于室温加入板中1小时并随后用洗涤缓冲液洗涤三次。加入100μl/孔的杂交瘤细胞上清并将板在室温培养1小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次后，按100μl/孔加入羊抗鼠IgG或IgM山葵过氧化物结合酶的1/5000稀释液(稀释于含有1％牛血清蛋白的PBS)。将板在室温培养1小时后，用洗涤缓冲液将板洗涤3次。100μl/孔的TMB溶液在室温放置1-3分钟。通过加入100μl/孔的2M H2SO4中止显色反应并用Perkin-Elmer HTS7000平板读取器读取该板在450nm的吸收值。如表1中所示10A304.7杂交瘤分泌的基本为IgG同型抗体。
在一轮限制性稀释后，在细胞ELISA实验中检测杂交瘤上清液中与靶细胞结合的抗体。测试使用3种结肠癌细胞系HT-29、SW1116和SW620。在使用前先将板中细胞固定。用含有MgCl2和CaCl2的PBS在室温将板洗涤3次。将100μl含有2％多聚甲醛的PBS加入每孔中在室温放置10分钟后弃去。再次用含有MgCl2和CaCl2的PBS在室温将板洗涤3次。用100μl/孔含有5％牛奶的洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)在室温进行1小时的封闭。用洗涤缓冲液将板洗涤3次并在室温将杂交瘤细胞上清以100μl/孔加入板中1小时。用洗涤缓冲液将板洗涤3次后按100μl/孔加入山葵过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG或IgM抗体的1/5000稀释液(稀释于含有1％牛血清蛋白的PBS)。在室温放置1小时后用洗涤缓冲液将板洗涤3次并于室温加入100μl/孔的TMB放置1-3分钟。通过加入100μl/孔的2M H2SO4中止反应并用Perkin-Elmer HTS7000平板读取器读取板在450nm的吸收值。在表1中的实验结果用减去背景值后与IgG同型对照(3BD-27)相比的倍数值表示。来自10A304.7杂交瘤细胞的抗体在背景以上在HT-29、SW1116和SW620细胞中的结合分别增强了22.8倍、13.1倍和23.9倍。这些结果意味着抗体与抗原结合，该抗原在一些癌细胞中的表达比在其它细胞中多。
与抗体结合测试相关联，用同样的结肠腺癌细胞系对杂交瘤上清液的细胞毒效应进行了测试HT-29、SW1116和SW620。活/死细胞毒性实验据自Molecular Probes(Eu，OR)。根据厂商说明书及下述变化进行实验。在试验前以事先确定的合适的细胞密度将细胞分板。2天后，将杂交瘤微量滴定板中的100μl上清液转移至细胞培养板中并在5％CO2培养箱中培养5天。将作为阳性对照的孔吸空后加入100μl的叠氮化钠和/或环己酰亚胺。因为已知3BD-27单克隆抗体不会和HT-29结肠癌细胞结合，因此同样加入该抗体作为同型对照。抗EGFR抗体(C225)同样用于实验作为参照。在处理5天后，通过倾倒和吸干将板清空。用多通道洗瓶将含有MgCl2和CaCl2的室温DPBS分配至各孔中，轻敲3次，通过倾倒和吸干将盘清空。在各孔中加入50μl稀释于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光活/死染料，并于37℃在5％CO2培养箱中培养30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读取器中读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果制成表1。10A304.7杂交瘤在SW1116细胞中产生了11％的专一性细胞毒性，与抗EGRF抗体C225所获得的结果相似。10A304.7和SW1116细胞的强结合意味着该水平的抗体结合足以介导该抗体对这些癌症细胞的细胞毒性。尽管在细胞ELISA实验中10A304.7抗体与HT-29及SW620癌细胞有强结合，结合并没有诱导细胞毒性。该结果暗示抗体结合本身不足以介导10A304.7对HT-29和SW620细胞的细胞毒性。如表1中所列，3BD-27抗体，10A304.7抗体的同型抗体，此前已知不和HT-29结肠癌细胞结合，在该癌细胞系中不产生细胞毒性。已知的非专一性细胞毒试剂叠氮化钠和环己烯亚胺产生了预期的细胞毒性。作为对比，十分明确的抗癌抗体C225在SW1116癌细胞中产生了13％的细胞毒性。表1的结果意味着10A304.7与癌细胞的结合可能是产生细胞毒性的重要步骤但其本身不足以介导该事件的发生。
实施例2抗体制备在CL-1000烧瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤，每周进行两次收集和再接种，用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(AmershamBiosciences，Baie d′Urfé，QC)的标准抗体纯化步骤制备10A304.7单克隆抗体。使用人源化的、嵌合的或鼠的单克隆抗体在本发明的范围内。在细胞毒性实验中将10A304.7与一些阳性对照(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20mg/ml，eBioscience，San Diego，CA)、抗Her2/neu(IgG1，kappa，10mg/ml，Inter Medico，Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5mg/ml，Cedarlane，Hobby，ON)、环己酰亚胺(100mM，Sigma，Oakville，ON)和NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和阴性对照(107.3(抗TNP，IgG1，kappa，20mg/ml，BD Biosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，kappa，20mg/ml)、IgG缓冲液(2％)对照组进行了比较(表2)。对乳腺癌(MB-231、MCF-7)、结肠癌(Caco-2、DLD-1、Lovo、HT-29、SW1116、SW620)、卵巢癌(OVCAR)、胰腺癌(BxPC-3)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD 27sk、Hs888Lu)细胞系进行了测试(均来自ATCC，Manassas，VA)。活/死细胞毒性试验据自Molecular Probes(Eugene，OR)。根据生产商说明书和下述变化进行实验。
在实验前以事先确定的合适的细胞密度将细胞分板。2天后，将100μl纯化的抗体稀释在培养基中并随后转移至细胞培养板中并在5％CO2培养箱中培养5天。通过倾倒和吸干将板清空。用多通道洗瓶将含有MgCl2和CaCl2的室温DPBS分配至各孔中，轻敲3次，通过倾倒和吸干将板清空。在各孔中加入50μl稀释于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光活/死染料并于37℃在5％CO2培养箱中培养30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读取器中读取板的读数，数据用Microsoft Excel进行分析并将结果制成表2。数据代表了4个实验3次重复的平均值并用以下方式定性表示4/4实验在背景以上均具有15％的细胞毒性(++++)，2/4实验在背景以上具有15％的细胞毒性(+++)，至少2/4实验在背景以上具有10-15％的细胞毒性(++)，以及至少2/4实验在背景以上具有8-10％的细胞毒性(+)。表2中未标记的细胞代表细胞毒性结果不一致或效应低于下限值。10A304.7抗体产生的细胞毒效应是已被充分描述的抗EGFR抗体C225的35％，C225在SW1116结肠细胞系中诱导了31％的细胞毒性。两个抗体对该细胞系的效应与表1中的结果一致。此外，10A304.7和C225相比对其它癌细胞具有显著高的细胞毒性，包括乳腺癌细胞系MDA MB231(111％)和MCF-7(850％)、前列腺癌细胞系PC-3(375％)、和卵巢癌细胞系OVCAR(667％)。重要地，10A304.7对一些非癌细胞如CCD 27sk或Hs888Lu不产生细胞毒性，意味着该抗体对各种癌细胞具有专一性。化学细胞毒试剂产生了预期的细胞毒性，而考虑到生物细胞实验的局限性，其它一些用作对照的抗体也呈现了预期的行为。
制备用于FACS的细胞时，首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗涤单层细胞。随后在37℃使用细胞消化液(Invitrogen)将细胞从细胞培养板上解离。在经过离心和收集后，用含有MgCl2、CaClC2和25％胎牛血清的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(洗涤培养基)在4℃将细胞重悬并计数、分至合适的细胞密度、离心沉淀细胞并以20μg/ml将细胞重悬于含有10A304.7或对照抗体(同型对照、抗EGFR或抗Fas)的染色培养基中(含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS)，在冰上放置30分钟。在加入Alexa Fluor 488-偶联二级抗体之前，用洗涤培养基洗涤细胞一次。随后将染色培养基中的Alexa Fluor 488-偶联抗体加入20分钟。最后一次洗涤细胞并将其重悬于含有1μg/ml的碘化丙啶的染色培养基中。使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACScan上运行样品进行细胞的流式细胞计数。通过调节FSC和SSC检测仪的电压和振幅增益设置细胞的前散射光(FSC)和侧散射光(SSC)。运行用纯的同型对照抗体及随后用Alexa Fluor 488-偶联二级抗体染色的细胞对3个荧光通道(FL1、FL2和FL3)的检测仪进行校准使得细胞具有均一的峰且荧光强度的中值大约为1-5个单位。通过FSC选通和碘化丙啶排除获得活细胞。对于每个样品，大约获得10,000个活细胞用于分析，分析结果在表3中呈现。
表3中列出了超过同型对照的平均荧光强度增加倍数且定性地表示如下小于3到5(+)；5到25(++)；25到50(+++)；50以上(++++)。图1中列出了10A304.7抗体的代表性直方图，结合特征的证据包括在某些情况下的双峰图。10A304.7与所有细胞系非特异性结合，包括与非癌细胞CCD-27sk和Hs888.Lu的高度结合，但是在不同细胞系之间结合程度有所不同。因此10A304.7以不同水平与细胞系选择性地结合。表2和3的结果意味着10A304.7与肿瘤细胞的结合对抗体介导的细胞毒性是必需的但其还不足以诱发该事件。
本说明书中提及的所有专利和公开物对于本发明所属技术领域的技术人员具有说明性。所有的专利和公开物在此以相同程度被引为参考，就如同各独立的公开物被专门且个别地说明在此引作参考一样。
应当明白的是尽管说明了本发明的特定形式，发明不限于在此描述和显示的特定形式或各部分的排列。对于本领域的技术人员而言，显然可以在不背离本发明的范围的情况下进行各种修改，并且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员将容易地认识到当前发明非常适于实现目标并获得所述的及发明本身所固有的结果和益处。在此描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、步骤和技术是当前优选具体实施方案的代表，可以被效仿而不应对范围发生限制。遵照本发明的精神和所附权利要求书的范围定义，本领域技术人员可以对发明进行修改和其它使用。虽然本发明结合特定的优选具体实施例进行了说明，应当明白权利要求的发明不应不恰当地受到这些特定具体实施方案的限制。事实上，对于本领域的技术人员显而易见的对实现此发明的上述模式的各种修改都应该包含在随后的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种保藏于ATCC的保藏号为PTA-5065的克隆所编码的分离出的单克隆抗体。
2.如权利要求1中的抗体，所述抗体是人源化抗体。
3.如权利要求1中的抗体，所述抗体是嵌合抗体。
4.一种保藏于ATCC保藏号为PTA-5065的分离出的克隆。
5.一种确定选自人肿瘤的组织样品中存在癌细胞的结合实验，包括提供所述人肿瘤的组织样品；提供保藏于ATCC保藏号为PTA-5065的克隆编码的分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段；将所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品接触；以及确定所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；由此说明在所述组织样品中所述癌细胞的存在。
6.如权利要求5中的结合实验，其中人肿瘤组织样品获取自源于组织的肿瘤，所述组织选自结肠、卵巢、肺和乳腺组织。
7.一种在选自人肿瘤的组织样品中分离或筛选癌细胞的方法，包括提供所述人肿瘤的组织样品；提供保藏于ATCC保藏号为PTA-5065的克隆编码的分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段；将所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品接触；以及确定所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；由此所述癌细胞通过所述结合得到分离且其在所述组织样品中的存在得以确定。
8.如权利要求7中的方法，其中人肿瘤组织样品获取自源于组织的肿瘤，所述组织选自结肠、卵巢、肺和乳腺组织。
9.如权利要求1中的分离出的单克隆抗体的抗原结合片段。
10.如权利要求2中的人源化抗体的抗原结合片段。
11.如权利要求3中的嵌合抗体的抗原结合片段。
12.如权利要求1、2、3、9、10或11任一项中的分离出的抗体或抗原结合片段与选自细胞毒成份、酶、发射性化合物和造血细胞的物质偶联。
全文摘要
本发明涉及使用一种全新筛选方式来制备病人癌症疾病改善抗体的方法。该方法使用癌症细胞毒性作为指标分离抗癌抗体，使得制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。抗体可用于帮助进行癌症的定级和诊断，还可用于治疗原发肿瘤和肿瘤转移。抗癌抗体可以与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。
文档编号A61P35/00GK1802387SQ200480015677
公开日2006年7月12日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年4月14日
发明者戴维·S·F·扬, 苏珊·E·哈恩 申请人:阿里乌斯研究公司