专利名称：癌症调节抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症调节抗体(CDMAB)的分离和生产，以及CDMAB在治疗和诊断过程中的应用，可选择的和一种或多种化学治疗剂联合使用。本发明进一步涉及利用本发明的CDMAB进行的结合测定(binding assays)。
背景技术：
每一患有癌症的个体都是独特的，由于个体差异，每个人所患的癌症和其它癌症都不一样。尽管如此，现有疗法都是在同样的时期、以同样的方式来治疗患有同种癌症的患者。至少30％的患者的一线治疗是失败的，从而增加了额外的疗程以及治疗失败、病毒转移和最终死亡的可能性。治疗的优选方法将是针对特定个体的个性化治疗。目前唯一的个性化治疗方法是手术。化学治疗和放射治疗无法针对患者具体情况，而在大多数情况下单靠手术不足以治愈癌症。
随着单克隆抗体的出现，开发个性化治疗方法的可能性变得更加现实，因为每个抗体能够针对单一的抗原表位。而且，也可以生产针对多个相关抗原表位的组合抗体，所述多个相关抗原表位唯一确定了某一特定个体的肿瘤。
已经认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差别是癌细胞含有对变异细胞来说具有特异性的抗原，科技界长期认为通过与癌抗原特异性结合，单克隆抗体能够被设计来特异靶向变异细胞；因此产生了这样的观点单克隆抗体能够作为“魔术子弹(MagicBullets)”来消灭癌细胞。
已经显示依照本发明方法分离的单克隆抗体以一种对患者有益的方式(如通过降低肿瘤负荷)来调节肿瘤疾病过程，在本文将被称为癌症调节抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
目前，癌症的治疗手段很少。已有的癌症治疗方法已经对全球的癌症存活率有所改善。然而，对于特定个体而言，这些改善的统计数据与他们的个人状况不是必然相关的。
因此，如果有一种方法学能够使医师单独处理同类肿瘤患者的每个肿瘤，将使每个患者可以用适合自己的独特方法进行治疗。理论上，这种治疗过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足人们长期感受到的需要。
过去，多克隆抗体已经被应用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但是很少获得持久的改善或应答。而且，缺乏重现性，也没有比化疗多出额外的优点。实体瘤(如乳癌、黑素瘤和肾细胞癌)也已经采用人血液、猩猩血清、人血清和马血清来治疗，但是相应的结果是不确定的和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在20世纪80年代，对人乳腺癌进行了至少4次利用抗体针对特异抗原或基于组织选择性的临床实验，在至少47例患者中只产生了1例应答者。直至1998年，才有1次成功的临床实验该实验联合使用了人源化抗Her2抗体与顺铂。在这次实验中，37例患者有反应，其中约1/4具有部分反应率，另外一半病情发展轻微或稳定。
研究结肠直肠癌的临床实验涉及同时抗糖蛋白和糖脂类靶的抗体。对腺癌有一定特异性的抗体，如17-1A，已经进行了超过60例患者的2期临床实验，其中仅有1例患者有部分反应。在其他应用17-1A的实验中，使用了附加的环磷酰胺，52例受试患者中仅有1例完全反应和2例轻微反应。其它涉及17-1A的实验得到了类似的结果。首次批准人源化的鼠单克隆抗体用于显像诊断，也没有产生肿瘤消退。到目前为止，还没有一个抗体对结肠直肠癌有效。同样，对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌和胃癌，结果也一样糟糕。使用抗GD3单克隆抗体治疗黑素瘤获得了某种有限的成功。因此，可以看到尽管作为人类临床实验前提的小动物实验取得了成功，但是迄今为止，试验过的抗体绝大部分是没有效果的。
现有专利US5750102公开了一种方法，用MHC基因转染患者肿瘤细胞，MHC基因可以从患者的组织或细胞中克隆。然后将这些经转染的细胞用于接种患者。
US4861581公开了一种方法，该方法包括如下步骤获得单克隆抗体，该抗体对哺乳动物的肿瘤细胞及正常细胞的内部细胞成分有特异性而对外部成分没有特异性；标记单克隆抗体；将标记抗体与已经接受过肿瘤细胞杀灭治疗的哺乳动物组织接触；以及通过测定标记抗体与退化肿瘤细胞内部细胞成分的结合来确定治疗的效果。在制备导向人类细胞内抗原的抗体的过程中，专利权人认识到癌细胞是这类抗原的一个方便来源。
US5171665提供了一种新型抗体和该抗体的生产方法。具体的，该专利说明了单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体具有与人类肿瘤相关蛋白抗原(如结肠和肺的)牢固结合的性质，而与正常细胞的结合程度要小得多。
US5484596提供了一种癌症的治疗方法，该方法包括手术去除癌症患者的肿瘤组织；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其存活但没有致瘤性质；以及用这些细胞为患者制备疫苗，该疫苗能够抑制原发性肿瘤的复发并同时抑制病灶转移。该专利公开了与肿瘤细胞表面抗原具有反应性的单克隆抗体的研制。如第4栏第45行等处说明，专利权人在对人类肿瘤具有活性特异的免疫治疗的单克隆抗体研发过程中，利用了自体肿瘤细胞。
US5693763说明了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性不依赖于原发的上皮组织。
US5783186说明了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体产生抗体的杂交瘤细胞系，使用抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。
US5849876描述了用于生产单克隆抗体的新型杂交瘤细胞系，所述抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中提纯的粘蛋白抗原。
US5869268公开了生成人体淋巴细胞的方法，该淋巴细胞产生对目标抗原具有特异性的抗体，同时公开了一种生产单克隆抗体的方法及由该方法生产的单克隆抗体。该专利特别公开了用于诊断和治疗癌症的抗HD人类单克隆抗体的生产。
US5869045涉及和人体癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机理是双重的，因为这些抗体一方面与展示在人体癌细胞表面的膜抗原具有反应性，另外这些抗体还能够陷入癌细胞，随后结合，使它们特别用于形成抗体-药物和抗体-毒素结合物。以未修饰形式出现的抗体在特定浓度下也表现出细胞毒性质。
US5780033公开了自体抗体用于肿瘤治疗和预防。不过，该抗体是从成年哺乳动物中得到的抗细胞核自体抗体。这里，自体抗体是指在免疫系统中发现的一种天然抗体。因为自体抗体来源于“成年哺乳动物”，因此就不要求自体抗体真正来源于受治患者。此外，该专利公开了来自成年哺乳动物的天然的单克隆抗细胞核自体抗体以及生成单克隆抗细胞核自体抗体的杂交瘤细胞系。
发明内容
本发明已经被授予美国专利US6180357，发明名称为“个体化患者特异抗癌抗体”，直接涉及用于治疗癌症的个性化抗癌抗体的个体化筛选方法。
本发明部分使用专利US6180357中的生产患者特异性抗癌抗体的方法，用以分离编码癌症调解单克隆抗体的杂交瘤细胞系。可以为一种肿瘤而专门制备这些抗体，从而使癌症的个性化治疗成为可能。在本发明公开的内容中，具有杀灭细胞(细胞毒素的)或抑制细胞生长(细胞生长抑制的)性能的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒。这些抗体用于帮助癌症分期和诊断，也可用于治疗肿瘤转移。
个性化抗癌治疗将给患者的治疗方式带来变化。一种可能的临床情境是在一种肿瘤出现时就取样并入库。通过该样品，能够通过预存的癌症调节抗体库对该肿瘤进行分类。可以对肿瘤患者进行常规分期，但可用抗体能够用于患者的进一步分期。可以用已有的抗体立即对患者进行治疗，肿瘤特异的抗体库的形成可以使用本发明公开的方法，也可以使用噬菌体展示库并结合本发明公开的筛选方法。生成的所有抗体将被添加入抗癌抗体库，因为可能其它的肿瘤细胞具有与被治疗的肿瘤相同的抗原表位。根据本方法生产的抗体可以用于治疗任何数量的患有与这些抗体结合的癌症的患者。
除了抗癌抗体外，患者可以选择接受现在推荐的治疗方法作为多重疗法的一部分。本发明方法分离的抗体对非癌细胞相对无毒性的事实允许了高剂量抗体与常规疗法的结合使用或单独使用。高治疗指数也将允许短期内的再次治疗，从而降低治疗抵抗细胞出现的可能性。
而且，本发明还包括将本发明的CDMAB和标准的化学治疗药征(如放射性核素)结合起来，从而集中了所述化疗的作用。
如果患者的初期治疗没有效果或发生了转移，则可以重复肿瘤特异抗体生成过程来进行治疗。而且，抗癌抗体可以和患者的红细胞结合并再次注入来治疗病灶转移。目前对转移癌症的有效治疗很少，转移通常预示着糟糕的出院率而导致死亡。不过，转移的肿瘤通常有较好的血管生成，通过红细胞进行的抗癌抗体的输送具有将抗体聚集在肿瘤位置的作用。甚至在转移前，大多数癌细胞依靠宿主血液供应来存活，而与红细胞结合的抗癌抗体同样能有效抵抗原位肿瘤。可选择的，抗体可以和其它造血细胞结合，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞，等等。有五种抗体，每种抗体具有一种其重链所赋予的功能。通常认为通过裸露抗体(nakedantibodies)的癌细胞杀伤作用由抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)来介导。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过与补体系统中的C-1组分结合来激活人类补体，从而激活补体激活的经典途径，这能导致肿瘤细胞溶解。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠同种型抗体IgG2a和IgG3在俘获具有Fc受体的细胞毒性细胞过程中起作用，导致由单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人类同种型抗体IgG1和IgG3都介导ADCC。
抗体介导的癌细胞杀伤作用的另一种可能的机制是可以通过利用抗体催化功能，来水解细胞膜与其结合的糖蛋白或糖脂之间的化学键，即所谓的催化抗体。
还有两种被普遍接受的抗体调节癌细胞杀伤的机理。第一种是利用抗体作为疫苗来诱导机体对肿瘤细胞表面的特定癌抗原产生免疫反应。第二种是利用抗体来靶向生长受体并干扰其功能或下调该受体以使其功能丧失。
肿瘤药物的临床应用基于该药物在可接受的危险评估之下的受益。在癌症的治疗中，存活率通常是最重要的受益目标，但是除了延长寿命外，还有一些其它公认的受益。这些对存活没有负面影响的其它受益包括症状的减轻、防止负面影响、延长复发周期或无瘤存活时间和延长疾病进程。这些标准被普遍接受，美国食品药品监督管理局(FDA)等管理机构批准产生这些受益的药物(Hirschfeldet al.Critical Reviews in Oncology/Hematology 42137-1432002)。除了这些标准外，人们充分认识到还有其他特征可以预示这些受益类型。部分的，美国FDA的快速审批程序确认了有替代特征可能预测患者的受益。到2003年末，有16个药物被批准进入这个程序，其中四个已经进入全面审批，即，后续研究证明了替代特征所预示的直接的患者受益。确定实体瘤药物疗效的一个重要指标是通过测试治疗效果来评价肿瘤负荷(Therasse et al.Journal of theNational Cancer Institute 92(3)205-2162000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤疗效评价标准工作组颁布，该工作组由国际癌症专家组成。和参照RECIST标准的客观疗效所显示的一样，与适当的对照组相比，对实体瘤有确切疗效的药物易于最终产生直接的患者受益。在临床前条件下，肿瘤负荷通常更容易被评估和记录。因为临床前研究可以被转化为临床条件，所以在临床前模型中产生存活延长的药物具有最大的、所期望的临床效用。与产生对临床治疗有益反应相类似，在临床前条件下降低肿瘤负荷的药物也可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长生命是癌症药物治疗最重要的目标，但是还有其他受益具有临床效用，显然，肿瘤负荷的降低也能够导致直接的受益并具有临床效果(Eckhardt etal.Developmental TherapeuticsSuccesses and Failures ofClinical Trial Designs of Targeted Compounds；ASCO EducationalBook，39th Annual Meeting，2003，pages 209-219)。
因此，本发明的目的是利用一种方法从来源于特定个体的细胞中生产对癌细胞有细胞毒性而同时对非癌细胞相对无毒的癌症调节抗体(CDMAB)，目的是分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的单克隆抗体及其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是说明CDMAB及其抗原结合片段。
本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒作用通过抗体依赖性细胞毒来介导。
本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒作用通过补体依赖性细胞毒来介导。
本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒作用是其因为其能够催化细胞化学键的水解。
本发明另一个目的是生成CDMAB，该CDMAB在癌症的诊断、预测和监测的结合试验中是有用的。
本发明其它的目的和优点通过本发明下述的说明、举例和实施例将变得显而易见。
图1表示的是AR36A36.11.1和导向几种癌细胞和非癌细胞系的抗EGFR抗体的FACS图；图2比较了杂交瘤细胞上清液对细胞系PC-3、LnCap和CCD-27sk的细胞毒性(Cytotoxicity)与结合(Binding)水平的百分比；图3是AR36A36.11.1的细胞毒性与阳性对照和阴性对照的比较；图4表示了AR36A36.11.1对抗EGFR对照的结合，以及列表化的平均荧光强度高出同种型对照的倍增。结果定性表示为1.5-5(+)；5-25(++)；25-50(+++)；和高于50(++++)；图5说明了AR36A36.11.1在MB-231胸腺癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线表示抗体给药的时间。数据点表示平均+/-SEM；图6说明了AR36A36.11.1在MB-231胸腺癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM；
图7说明了AR36A36.11.1在已构建的MB-231胸腺癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线表示抗体给药时间。数据点表示平均与/-SEM；图8说明了AR36A36.11.1在已构建的MB-231胸腺癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM。
图9说明了AR36A36.11.1在SW1116结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线表示抗体给药的时间。数据点表示平均+/-SEM；图10说明了AR36A36.11.1在SW1116结肠癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM；图11说明了AR36A36.11.1在PC-3结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线表示抗体给药时间。数据点表示平均+/-SEM；图12说明了AR36A36.11.1在PC-3前列腺癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM。
具体实施例方式
实例1杂交瘤生产-杂交瘤细胞系AR36A36.11.1根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR36A36.11.1于2004年1月28日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)，位于加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部微生物局，保藏编号为280104-02。根据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时取消对公众获取该保藏材料的限制。
为了生成产生抗癌抗体的杂交瘤AR36A36.11.1，在PBS(磷酸盐缓冲液)中制备新鲜的、PC-3前列腺癌细胞系的单细胞悬浮液，所述PC-3前列腺癌细胞系已经在SCID小鼠中生长为实体瘤。与IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，Netherlands)佐剂轻轻混合后待用。通过皮下注射50微升含2百万细胞的抗原-佐剂对5-7周的BALB/c鼠进行免疫。初次免疫后2-5周，将新鲜制备的含2百万细胞的50微升抗原-佐剂腹腔注入被免疫的小鼠。最后一次免疫之后3天，使用脾进行融合。通过NSO-1骨髓瘤和分离的脾细胞的融合制备杂交瘤。检测融合上清液中杂交瘤的亚克隆。
为了确定杂交瘤细胞分泌的抗体是否为IgG或IgM同种型，进行了酶联免疫测定试验(ELISA)。将在包被液(Coating buffer，0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH为9.2-9.6)中的浓度为2.4微克/毫升的山羊抗鼠IgG+IgM(H+L)加入到ELISA酶标板(100微升/孔)，4℃过夜。酶标板经洗涤缓冲液洗涤(PBS+0.05％吐温)三次。加入100微升/孔的封闭液(洗涤缓冲液中含有5％牛奶)，室温1小时，洗涤缓冲液洗涤三次。加入100微升/孔的杂交瘤上清液，室温培养1小时。用洗涤缓冲液洗涤酶标板三次，加入100微升/孔的山羊抗鼠IgG或IgM与山葵过氧物酶的结合物的1/100000稀释液(在含有5％牛奶的PBS中稀释)。室温培养1小时后，洗涤缓冲液洗涤酶标板三次。加入100微升/孔的TMB溶液，室温培养1-3分钟。加入100微升/孔的2M的H2SO4终止颜色反应，Perkin-Elmer HTS7000读板机于450nm下读板。图2表明了AR36A36.11.1杂交瘤分泌的主要抗体是IgG同种型(Isotype)。
经过一轮有限稀释，检测杂交瘤上清液中靶向ELISA细胞的抗体。检测了两种人前列腺癌细胞系和一种人正常皮肤细胞系，分别是PC-3、LnCap和CCD-27sk。铺板细胞在使用前先被固定。酶标板用含有MgCl2和CaCl2的PBS室温洗涤三次。每个板孔中加入100微升、2％多聚甲醛PBS溶液，室温10分钟，弃掉溶液。孔板再次用含有MgCl2和CaCl2的PBS室温洗涤三次。用100微升/孔的含有5％牛奶的洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)室温封闭1小时。孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，加入杂交瘤上清液(100微升/孔)，室温放置1小时。孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，加入100微升/孔的、与山葵过氧物酶(在含有5％牛奶的PBS中稀释)结合的山羊抗鼠IgG或IgM抗体稀释液(1/25000稀释)。室温培养1小时，孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，加入TMB培养基(100微升/孔)，室温培养1-3分钟。加入2M H2SO4(100微升/孔)终止反应，Perkin-Elmer HTS7000读板机于450nm下读板。如图2列表，结果被表示为高出背景的倍数(Fold)，对照为实验室标准的IgG同种型，事先已经证明该对照不能与被测细胞系结合。杂交瘤来自杂交瘤AR36A36.11.1的抗体表现出与前列腺癌细胞系PC-3的结合，与另一前列腺癌细胞系LnCap较弱结合。AR36A36.11.1还表现出与正常皮肤细胞系之间可检测到的结合水平。
在进行抗体结合实验的同时，在同一细胞系PC-3、LnCap和CCD-27sk中测试了杂交瘤上清液的细胞毒作用。从Molecular Probes公司获得Live/Dead细胞毒性测定法。测定根据生产者的要求进行，做了下述改变。测定前将细胞以预先确定的适当浓度进行铺板。2天后，将100μl杂交瘤微量滴定板中上清液转移至细胞孔板，于5％CO2的培育箱中培养5天。将阳性对照板孔中空气吸空，加入100微升的叠氮化钠(NaN3)或环己酰亚胺。经过5天的处理后，孔板经倒空并吸干。通过多通道塑料挤压瓶将室温下的、含有MgCl2andCaCl2的DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲液)分入每个孔中，轻敲三次，倒空，然后吸干。将用含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升的荧光钙黄绿素染料加入到每个孔中，在5％CO2培养箱中37℃培养30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板机读板，数据用Mcrosoft Excel进行分柝。结果在图2中列出。杂交瘤AR36A36.11.1对PC-3细胞产生了17％的特异细胞毒性，别是阳性对照叠氮化钠(NaN3)和环己酰亚胺(Cycloheximide)对PC-3细胞毒性的46％和25％。AR36A36.11.1杂交瘤还对LnCap细胞产生了25％的特异性细胞毒性，分别是阳性对照叠氮化钠和环己酰亚胺对LnCap细胞毒性的36％和69％。如图2所示，尽管AR36A36.11.1与CCD-27sk正常细胞系细胞高度结合，但却没有产生细胞毒性。公知的非特异性细胞毒试剂环己酰亚胺和叠氮化钠总体上产生了预期的细胞毒性。
实例2抗体生产通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤AR36A36.11.1来生成单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用琼脂糖凝胶Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d’Urfé，QC)进行标准的抗体纯化过程。本发明的范围包括利用人源化的、嵌合的(chimerized，即部分人源化以消除免疫原性)或鼠源单克隆抗体。
细胞毒性实验试验中，将AR36A36.11.1和许多阳性对照(抗EGFR(C225，IgGI，kappa，5pg/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、环己酰亚胺(CHX，0.5μg/ml，Sigma，Oakville，ON)和NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和阴性对照(107.3(抗TNP)，IgGI，kappa，20μg/ml，BD Bioscience，Oakville，ON)和IgG Buffer(3％))进行了比较(图3)。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，NCI-MCF-7(MCF-7))、结肠癌(DLD-1，Lovo，SW1116)、卵巢癌(OVCAR-3)、胰腺癌(BxPC-3)和前列腺癌(PC-3，LnCap，DU-145)，以及非-癌的皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888.Lu)细胞系都进行了测试(全部来自美国典型培养物保藏中心ATCC，Manassas，VA)。Live/Dead细胞毒性测定法获自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。测定根据生产者的要求进行，做了下述改变。测定前将细胞以预先确定的适当浓度进行铺板。2天后，将100μl纯化的抗体或对照稀释后转移至细胞孔板，于5％CO2的培育箱中培养5天。孔板经倒空并吸干。通过多通道塑料挤压瓶将室温下的、含有MgCl2and CaCl2的DPBS分入每个孔中，轻敲三次，倒空，然后吸干。将用含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升的荧光钙黄绿素染料加入到每个孔中，在5％CO2培养箱中37℃培养30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板机读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果在图3中列出。图中数据代表了四组试验(每组实验有三次平行测定值)的平均值，用下述方式定性表示3/4-4/4的实验结果是细胞毒性高出背景>15％(++++)；2/4的实验结果是细胞毒性高出背景>15％(+++)；至少2/4的实验结果是细胞毒性高出背景10-15％(++)；2/4的实验结果是细胞毒性高出背景8-10％(+)；至少2/4的实验结果是细胞毒性高出背景7％(+/-)。图3中没有标记的细胞表示不连续或作用未达到临界细胞毒性。相对于同种型和缓冲液阴性对照，AR36A36.11.1抗体在LnCap前列腺癌细胞系中产生了细胞毒性，且高于所观察到的良好特征的抗EGFR抗体对LnCap的细胞毒性。重要的是，AR36A36.11.1对非癌细胞系如CCD-27sk或Hs888.Lu没有产生超过阴性对照的细胞毒性，这表明该抗体对癌细胞有特异性。应该注意的是抗EGFR抗体对CCD-27产生了细胞毒性，因为CCD-27这种上皮细胞系预期表达上皮生长因子受体。化学细胞毒性试剂产生了非特异性的细胞毒性。
通过流式细胞计量术(FACS)评价了AR36A36.11.1与上述癌细胞及正常细胞系的结合。DPBS(不含Ca离子和Mg离子)洗涤单层细胞，准备进行FACS。然后用细胞离解缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)37℃条件下将细胞从细胞培养板上分离出来。离心收集细胞，用4℃的、含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS悬浮细胞，计数，稀释到适当的细胞浓度，离心沉淀细胞，用4℃的、含有20μg/ml的测试抗体(AR36A36.11.1)或对照抗体(同种型对照，抗EGFR)的染色液悬浮细胞，冰上放置30分钟。在加入结合了荧光染料Alexa Fluor 488的二抗之前，细胞用染色液洗涤一次。然后加入染色液中的Alexa Fluor 488结合抗体，经过30分钟。最后洗涤一次细胞，并悬浮于固定液(含有1.5％多聚甲醛的染色液)。通过FACSan上的流动样品来评价流式细胞计数的细胞获取，FACSan使用CellQquest软件(BD Biosciences，Oakville，ON)。细胞的前向散射(FSC)和测向散散(SSC)通过调节FSC和SSC检测器的电压和幅度(amplitude)来设置。通过只经Alexa Fluor 488结合二抗染色的流动细胞来调整荧光(FITC)检测器通道，这样，该细胞具有均匀的峰，约为1-5单位的中等荧光强度。对于每个样品，需要约10000个被染色固定的细胞用于分析，结果如图4所示。
图4列出了高出同种型对照的平均荧光强度倍增，定性表示如下1.5-5(+)；5-25(++)；25-50(+++)；和高于50(++++)。图1汇集了有代表性的AR36A36.11.1抗体柱状图AR36A36.11.1表现出与所有被测细胞系的结合。这些数据证明AR36A36.11.1显示了功能特异性，因为尽管与所有类型癌有明显结合，但是仅对LnCap前列腺癌细胞具有细胞毒性。相反，抗EGFR抗体展现出结合与细胞毒性之间更高的相关度，一个例证是非癌表皮衍生细胞系CCD-27sk。
实例3体内MDA-MB-231肿瘤试验参考图5和6，给4-8周雌性SCID小鼠颈背皮下注射100微升含有5百万结肠癌细胞(MB-231)的生理盐水。小鼠被随机分为两个治疗组，每组5只。植入后第一天，腹腔注射300微升的AR36A36.11.1测试抗体(20mg/kg)或同种型对照缓冲液(已知不与MB-231细胞结合)，所述抗体溶液由保存浓缩液稀释获得，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO4、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。以同一方式每周注射一次抗体，持续7周。大约每7天用测量仪测定肿瘤的生长，持续至8周，或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)规定的极限。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。
在人类乳腺癌预防性体内模型中，AR36A36.11.1抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在植入后的第55天，最后一次治疗后6天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液同种型对照治疗组的0％(p＝0.0002，t检验，图5)。
在整个研究中，没有毒性的临床症状。每周测得的体重是健康状态和停止生长的象征。如图6所示，在治疗结束时，两组之间的体重没有显著差别(p＝0.0676，t检验)。因此，AR36A36.11.1在乳腺癌异种移植模型中耐受良好并降低了肿瘤负荷。
实例4体内MB-231构建的肿瘤试验参考图7和8，给5-6周的雄性SCID小鼠颈背皮下注射植入100微升含有5百万MB-231人类乳腺癌细胞(PC-3)的生理盐水。通过测量仪(calipers)测试每周的肿瘤生长。植入后59天，大部分受试鼠达到了约为100m3的平均肿瘤体积(波动范围60-140m3)，将10只小鼠随机分入两个治疗组。腹腔注射300微升的AR36A36.11.1测试抗体稀释液(20mg/kg)或对照缓冲液，所述抗体溶液由保存浓缩液稀释而来，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO4、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。以同样方式每周注射3次共10次剂量，直至植入后81天。大约每7天用测量仪测定肿瘤的生长，直至植入后90天或动物个体达到了加拿大动物护理委员会(CCAC)规定的极限。在研究的过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。
在建立的人类乳腺癌预防性体内模型中，AR36A36.11.1抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在植入后的第83天，最后一次治疗后2天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组的46％(p＝0.0038，t检验，图7)。这对应平均T/C32％。
在整个研究中，没有毒性的临床症状。每周测得的体重是健康状态和停止生长的象征。图8显示，在治疗结束时，两组之间的体重没有显著差别(p＝0.6493，t检验)。
总结，在SCID小鼠中建立的人类乳腺癌预防性体内模型中，AR36A36.11.1良好耐受并明显比缓冲液对照组更有效抑制了肿瘤生长。经过3周的治疗，AR36A36.11.1取得了平均T/C肿瘤体积低于对照50％的指标。在被充分认识的人类癌症疾病模型中观察到了治疗受益，表明这种抗体在其他包括人在内的哺乳动物治疗的药理和药剂方面的受益。
实例5体内SW1116肿瘤试验参考图9和10，给4-8周的雌性SCID小鼠颈背皮下注射100微升含有5百万结肠癌细胞(SW1116)的生理盐水。小鼠被随机分为两个治疗组，每组5只。植入后第一天，腹腔注射300微升的AR40A603.13测试抗体溶液(20mg/kg)或对照缓冲液，所述抗体溶液由保存浓缩液稀释而来，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO4、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。以同一方式每周注射一次抗体，持续7周。大约每7天用测量仪测定肿瘤的生长，直至8周或个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)规定的极限。在研究过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。
在人类结肠癌预防性体内模型中，AR36A36.11.1抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在植入后的第55无最后一次治疗后的5天，AR40A603.13治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组的51％(p＝0.0055，t检验，图9)。
在整个研究中，没有毒性的临床症状。每周测得的体重是健康状态和停止生长的象征。如图10所示，在治疗结束时，两组之间的体重没有显著差别(p＝0.4409，t检验)。因此，AR36A36.11.1在结肠癌异种移植模型中耐受良好并降低了肿瘤负荷。
实例6体内PC-3肿瘤试验参考图11和12，给4-8周的雄性SCID小鼠颈背皮下注射100微升含有1百万前列腺癌细胞(PC-3)的生理盐水。小鼠被随机分为两个治疗组，每组5只。植入后第一天，腹腔注射300微升的AR36A36.11.1测试抗体溶液(20mg/kg)或对照缓冲液，所述抗体溶液由保存浓缩液稀释而来，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO4、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。以同一方式每周注射一次抗体，持续整个研究过程中。大约每7天用测量仪测定肿瘤的生长。研究在6次注射后(41天)结束，由于动物大面积的溃烂而达到了加拿大动物护理委员会(CCAC)规定的极限。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。
在人类前列腺癌预防性体内模型中，AR36A36.11.1抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在植入后的第41天，最后一次治疗后的5天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组的14％(p＝0.0009，t检验，图11)。
在PC-3前列腺癌异种移植模型中，体重可以作为疾病发展的表征(Wang et al.Int J Cancer，2003)。如图12所述，在研究结束时，第41天，对照组动物体重从研究开始下降了27％。相反，AR36A36.11.1治疗组的体重显著高于对照组(p＝0.017)。总体上，AR36A36.11.1治疗组体重仅下降了6％，比对照组的体重下降要少27％。
因此，在前列腺癌异种移植物模型中，AR36A36.11.1有很好的耐受性并降低了肿瘤负荷及恶病质。
参考文献Wang Z，Corey E，Hass GM，et al.Expression of the humancachexia-associated protein(HCAP)in prostate cancer and ina prostate cancer animal model of cachexia.Int J Cancer.2003；105(1)123-9.
权利要求
1.一种分离的单克隆抗体，该抗体由保藏在IDAC的克隆编码，该克隆的保藏编号为280104-02。
2.根据权利要求1所述的抗体，该抗体是人源化的。
3.根据权利要求1所述的抗体，该抗体是嵌合的。
4.一种分离的克隆，保藏在IDAC，保藏编号为280104-02。
5.一种启动人类肿瘤组织样品癌细胞的抗体诱导的细胞毒作用的方法，包括提供所述人类肿瘤的组织样品；提供一种分离的单克隆抗体，该抗体由保藏在IDAC、保藏编号为280104-02的克隆编码，或者提供诱导抗原结合片段的细胞毒；和将所述的分离的单克隆抗体或诱导抗原结合片段的细胞毒与所述的样品组织接触。
6.根据权利要求5所述的方法，其中人类肿瘤组织样品从一种肿瘤发生组织获得，该肿瘤发生组织选自结肠、卵巢、前列腺、胰腺和乳腺组织。
7.一种权利要求1所述的分离的单克隆抗体的抗原结合片段。
8.一种权利要求2所述的人源化抗体的抗原结合片段。
9.一种权利要求3所述的嵌合抗体的抗原结合片段。
10.根据权利要求1、2、3、7、8和9中任意一项权利要求所述的分离的抗体或抗原结合片段，它与细胞毒部分、酶、放射性化合物和造血细胞中的一种结合。
11.一种治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞毒敏感的人类肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤表达与单克隆抗体特异性结合的抗原，该抗体具有保藏在IDAC、保藏编号为280104-02的克隆编码的单克隆抗体的细胞毒诱导特性或诱导抗原结合片段的细胞毒性，该方法包括对所述哺乳动物给予有效量的所述单克隆抗体或其所述抗原结合片段，来诱导细胞毒性，从而降低所述哺乳动物的肿瘤负荷。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体结合到细胞毒性部分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的细胞毒性部分是放射性同位素。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体激活补体。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体介导抗体依赖性细胞毒作用。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体是人源化的。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体是嵌合的。
全文摘要
本发明涉及一种利用新型筛选模型来生产癌症调节抗体的方法。通过使用癌细胞毒性作为指标来分离抗癌抗体，该方法使得生产用于治疗和诊断的抗癌抗体成为可能。该抗体可以用于癌症分期和诊断，并可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。抗癌抗体可以和毒素、酶、放射性化合物、造血细胞结合。
文档编号C12Q1/68GK1934246SQ200580006018
公开日2007年3月21日 申请日期2005年2月28日 优先权日2004年2月26日
发明者大卫·S·F·杨, 苏姗·E·哈恩, 丽莎·M·瑟琪桃 申请人:阿里乌斯研究公司