专利名称：Pgg的分离和纯化的制作方法
与相关申请的交互参考本申请要求2004年1月23日提交的美国临时专利申请60/538,698的优先权，该专利全文纳入本申请作为参考。
背景技术：
已证明PGG及其类似物具有抗糖尿病活性以及其它生物活性，这使它们可用于新药的研发。通常，要获得FDA批准的新药其纯度必须大于95％。当前，没有一种高效和成本有效的方法制备和纯化克-千克规模的PGG或其类似物。迄今，层析纯化方法是唯一已知可用于产生纯度为95％或更高的PGG或其类似物的方法。然而，层析方法非常昂贵，而且不能用于PGG及其类似物的大规模纯化。用当前已知的方法进行PGG的工业规模生长非常昂贵，因此不能进行。
因此，需要比当前已知方法便宜并且可进行大规模生产的分离和纯化PGG及其类似物的方法。
发明概述本文提供一种分离和纯化α-和β-形式的五-O-没食子酰-D-葡萄糖(PGG)的简单、便宜和高效的方法。具体地说，本文提供的方法可用于从含有α-PGG和β-PGG以及其它化合物的混合物中分离α-PGG或β-PGG。与以前的分离和纯化方法不同，本文所述的方法不需要HPLC步骤。因为不需要HPLC步骤，本文所述的方法可经改造用于纯化的α-PGG和β-PGG的大量生产。
本文提供从含有α-PGG和β-PGG的混合物中分离α-PGG的方法。本文提供从含有α-PGG和β-PGG的混合物中分离β-PGG的方法。本文所述的方法尤其适于从含有大于50％的α-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分离α-PGG，或从含有大于50％的β-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分离β-PGG。
本文还提供将α-PGG和β-PGG纯化至纯度大于95％的方法，在一种实施方式中，所述方法提供纯度大于98％的α-PGG或β-PGG。还提供生长α-PGG单晶和β-PGG单晶的方法。
本文还提供PGG的葡萄糖部分被其它糖取代的α-或β-PGG类似物的分离和纯化方法。一些实施方式中，所述糖是己糖、戊糖或丁糖。在葡萄糖被一种或多种己糖取代的实施方式中，己糖可选自但不限于，半乳糖、甘露糖、艾杜糖、塔罗糖、阿卓糖、阿洛糖、古洛糖(gulose)、果糖等。在葡萄糖被一种或多种戊糖取代的实施方式中，戊糖可选自但不限于，木糖、核糖、阿拉伯糖和来苏糖。在葡萄糖被丁糖取代的实施方式中，合适的丁糖包括但不限于苏糖和赤癣糖。本文提供的方法能够从含有α-形式和β-形式的混合物中分离α-和β-PGG类似物。根据本文所述的方法，从含有50％或更多α-形式的混合物中分离α-形式的类似物；从含有50％或更多β-形式的混合物中分离β-形式的类似物。在这两种情况下，α-形式和β-形式可被纯化到95％或更高纯度的水平。本文还提供生产纯度为98％或纯度更大的α-形式和β-形式PGG的方法。
本文还提供PGG中葡萄糖部分被其它糖如其它己糖、戊糖或丁糖取代并且这些糖类似物中的环氧被碳、氮或硫取代的α-和β-PGG类似物的分离和纯化方法。对于这些糖，本文所述的方法可分离α-PGG类似物和β-PGG类似物。当在不纯的起始物中分别存在大于50％的α-PGG类似物或大于50％的β-PGG类似物时，这种分离方法得到进一步增强。根据本文所述的方法，α-PGG类似物和β-PGG类似物均可纯化到95％或更高的纯度。本文还提供生产纯度为98％或纯度更高的α-形式或β-形式的方法。
本文还提供PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的α-和β-PGG类似物的分离和纯化方法。一些实施方式中，酚类包括但不限于2，3-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸和3，5-二羟基苯甲酸。根据本文所述的方法，可从α-PGG类似物和β-PGG类似物的混合物中分离α-PGG类似物和β-PGG类似物。一些实施方式中，用于分离α-形式类似物的起始物含有大于50％的α-形式，用于分离β-形式类似物的起始物含有50％多的β-形式。此外，可将没食子酸被其它酚类取代的α-PGG类似物和β-PGG类似物纯化到95％或更大纯度，98％或更大纯度。
从α-PGG和β-PGG混合物中分离α-PGG的方法包括以下步骤(a)将水加入含有50％或更多α-PGG和50％或更少β-PGG的样品中；(b)将PGG和水混合以溶解PGG；(c)滤除所有不溶颗粒；以及(d)不干扰滤液直到晶体形成。一些实施方式中，所用的水是双蒸水。一些实施方式中，水和PGG的比例约是1gPGG用20mL水。一些实施方式中，步骤中的混合进行约5分钟。任选地，混合步骤可在升高的温度下进行，以帮助PGG溶解。一些实施方式中，通过将烧瓶置于水浴器中等方式，使混合步骤在80℃进行。在一些实施方式中，过滤通过45μ的滤器进行。一些实施方式中，含有滤液的烧瓶置于室温，但烧瓶也可置于更低的温度下以加速晶体形成。可重复该方法以获得更纯的α-PGG。根据本文所述方法，用于纯化α-PGG的方法也可用于α-PGG类似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物；葡萄糖被糖类似物取代并且所述糖类似物的环氧被碳、氮或硫取代的类似物；和PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
从α-PGG和β-PGG混合物中分离β-PGG的方法包括以下步骤(a)将丙酮加入含有50％或更多β-PGG和50％或更少α-PGG的样品中；(b)将PGG和丙酮混合以溶解PGG；(c)滤除所有不溶颗粒；以及(d)不干扰滤液直到晶体形成。一些实施方式中，丙酮和PGG的比例约是1gPGG用5mL丙酮。一些实施方式中，步骤(b)中的混合进行约5分钟。任选地，混合步骤(b)可在升高的温度下进行，以帮助PGG溶解。一些实施方式中，通过将烧瓶置于水浴器中等方式，使混合步骤(b)在80℃进行。一些实施方式中，过滤通过滤纸进行。一些实施方式中，含有滤液的烧瓶置于室温，但烧瓶也可置于更低的温度下以加速晶体形成。根据本文所述方法，用于纯化β-PGG的方法也可用于β-PGG类似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物；葡萄糖被糖类似物取代并且所述糖类似物的环氧被碳、氮或硫取代的类似物；和PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
制备α-PGG单晶的方法包括以下步骤(a)将水加入纯化(95％或更高)的α-PGG样品中；(b)将α-PGG和水混合以溶解α-PGG；(c)滤除所有不溶颗粒，将滤液置于干净的容器中；以及(d)不干扰滤液直到晶体出现。一些实施方式中，在制备α-PGG单晶的方法使用双蒸水。一些实施方式中，水和α-PGG的比例约是1.0g α-PGG加入100mL水。一些实施方式中，步骤(b)中的混合进行约5分钟。任选地，混合步骤(b)中可加热溶液以帮助α-PGG溶解。一些实施方式中，混合步骤(b)在80℃进行。一些实施方式中，步骤(c)中通过滤纸过滤溶液。一些实施方式中，步骤(d)在室温进行约15天。根据本文所述方法，制备α-PGG单晶的方法也可用于α-PGG类似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物；葡萄糖被糖类似物取代并且所述糖类似物的环氧被碳、氮或硫取代的类似物；和PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
制备β-PGG单晶的方法包括以下步骤(a)将丙酮加入纯化(95％或更高)的β-PGG样品中；(b)将β-PGG和丙酮混合以溶解β-PGG；(c)滤除所有不溶颗粒，将滤液置于干净容器中；以及(d)不干扰滤液直到晶体出现。一些实施方式中，丙酮和PGG的比例约是每1.0g β-PGG用50mL丙酮。一些实施方式中，步骤(b)中的混合进行约5分钟。任选地，混合步骤(b)中可加热溶液以帮助PGG溶解。一些实施方式中，混合步骤(b)在80℃进行。一些实施方式中，步骤(c)中的通过滤纸过滤溶液。一些实施方式中，步骤(d)在室温进行约20天。用于制备β-PGG单晶的所述方法也可用于β-PGG类似物，包括但不限于，PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物；葡萄糖被糖类似物取代并且所述糖类似物的环氧被碳、氮或硫取代的类似物；和PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
附图简述
图1显示干涉相衬(differential interference contrast)显微镜下α-PGG(左)和β-PGG(右)的晶体结构。
发明详述本文提供通过结晶来分离和纯化PGG的α-和β-异构体的方法。本文所述的方法还可用于分离很多不同PGG类似物的α-和β-异构体，这些类似物包括可能用作药物的物质。本文所述方法可用于实验室规模的产量和千克规模产量，最高到吨产量，同时仍然产生纯度为95％或更高的异构体。此外，因为水是唯一需要的溶剂，本文所述方法具有很高的成本有效性和环境友好性。本文所述方法还可用于制备α-PGG、β-PGG或其类似物的单晶。
本文所述的方法可在千克至吨的规模上实现α-和β-PGG及其类似物的分离和纯化，因此这些方法适于工业应用。而且，本文所述的方法是很便宜的一唯一需要的溶剂是水，在实施发明方法时可使用标准仪器。此外，该方法在室温进行，不需要既昂贵又耗费时间的加热和/或冷却步骤。该方法是环境友好的，因为不需要有机溶剂，并且该实施方法可不进行加热和冷却。
迄今，可制备高纯度α-PGG和β-PGG异构体的唯一可用方法是高效液相色谱(HPLC)。HPLC有很多缺点，使其不适于分离大量物质。HPLC只能用于分离毫克至克水平数量的PGG。此外，HPLC比结晶要慢而且贵得多，它需要至少价格为$25,000-$30,000的复杂HPLC系统。而且，必须使用大量的溶剂来进行HPLC，为了保持高纯度必须损失(丢弃)大量的化合物，使回收的产物产率很低。
用本文所述的方法，可在水中或水系溶剂系统中分离和纯化PGG及其类似物，高效、成本很低并且产率高。本文所述的方法降低了PGG及其类似物异构体的总制备成本，纯度至少为95％或超过95％。
本文所述方法可用于从含有α-PGG和β-PGG的混合物中分离α-PGG，和用于从含有α-PGG和β-PGG的混合物中分离β-PGG。本发明方法尤其适用于从含有大于50％的α-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分离α-PGG，以及从含有大于50％的β-PGG的α-PGG和β-PGG混合物中分离β-PGG。
本文所述的结晶方法提供纯度大于95％的α-PGG和β-PGG及其类似物。在另一个实施方式中，本文所述的法提供纯度大于98％的α-PGG或β-PGG或其类似物。本文还提供生长α-PGG和β-PGG单晶的方法。
本文还提供α-和β-PGG的很多类似物的分离和纯化方法。在一种此类类似物中，PGG的葡萄糖部分被其它糖类，如己糖、戊糖或丁糖取代。可用的己糖包括但不限于半乳糖、甘露糖、艾杜糖、塔罗糖、阿卓糖、阿洛糖、古洛糖(gulose)、果糖等。可用的戊糖包括但不限于，木糖、核糖、阿拉伯糖和来苏糖。可用的丁糖包括但不限于苏糖和赤癣糖。本文所述方法能够从α-和β-PGG类似物的混合物中分离α-和β-类似物，包括存在大于50％的α-形式的情况和存在大于50％的β-形式的情况。两种情况下，α-形式和β-形式均可被纯化到95％或更高纯度水平。
适于用本文所述方法分离和纯化的第二类PGG-类似物是PGG的葡萄糖部分被葡萄糖、其它己糖、戊糖或丁糖的糖类似物取代，而这些糖类似物的环氧被碳、氮或硫取代的α-和β-PGG类似物。对于这些类似物，本文所述方法可分离α-PGG类似物和β-PGG类似物。这些方法适于存在大于50％的α-PGG类似物或大于50％的β-PGG类似物的混合物。根据本文所述方法，α-PGG类似物和β-PGG类似物均可被纯化到95％或更高纯度。
本文还提供PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的α-和β-PGG类似物的分离和纯化方法。可用的其它合适的酚类包括但不限于，2，3-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸和3，5-二羟基苯甲酸。根据本文所述方法，可从含有大于50％的α-形式或从含有大于50％的β-形式的α-PGG和β-PGG类似物的混合物中分离α-PGG类似物和β-PGG类似物。此外，没食子酸被另一种酚类取代的α-PGG类似物和β-PGG类似物可被纯化到95％或更高纯度。
方法结晶α-PGG或其类似物的标准操作方法结晶在实验室规模进行，如下所述(1)将含有纯度大于等于50％的α-PGG的1.0g样品加入100mL烧瓶中。(2)然后将20mL双蒸水加入烧瓶中。(3)将烧瓶置于80℃水浴器中约5分钟，轻轻摇动以溶解样品。(4)用0.45μm的滤膜除去所有不溶颗粒。滤液加到干净的烧瓶中。(5)不干扰烧瓶，室温放置约5-7天，直到晶体出现。
结晶的速度受温度影响，将烧瓶置于低于室温的温度可加速结晶。
如果需要更高纯度，过滤晶体，然后重复步骤1-5。重复这些步骤4次以上可获得纯度大于98％的样品。
为了放大该方法，每1g样品可加入20mL双蒸水，进行上述步骤。
生长α-PGG单晶的标准操作方法(1)将1.0g纯度大于或等于95％的α-PGG加入到200mL烧瓶中。(2)将100mL双蒸水加入烧瓶中。(3)将烧瓶置于80℃水浴器中约5分钟，轻轻摇动以溶解样品。(4)用滤纸除去所有不溶颗粒，将干净的滤液加到干净的烧瓶中。(5)不干扰烧瓶，室温放置约15天，直到一些细的、无色、针形晶体出现。(6)过滤晶体，将其存贮在密封的烧瓶中。
结晶β-PGG的标准操作方法β-PGG的结晶方法如下(1)将含有纯度大于或等于50％的β-PGG的1.0g样品加入到10mL烧瓶中。(2)将5.0mL丙酮加入烧瓶中。(3)将烧瓶置于80℃水浴器中约10分钟，轻轻摇动以溶解样品。(4)用滤纸过滤溶液，将滤液加到干净的烧瓶中。(5)不干扰烧瓶，室温放置约15天，直到一些无色针形晶体出现。(6)如果需要更高纯度，过滤晶体，重复步骤1-5。为了放大该方法，按每1g样品5g丙酮的比例加入样品，结晶β-PGG。
生长β-PGG单晶的标准操作方法(1)将含有纯的(95％或更大)β-PGG的1.0g样品加入到100mL烧瓶中。(2)将50mL丙酮加入烧瓶中。(3)将烧瓶置于80℃水浴器中约10分钟，轻轻摇动以溶解样品。(4)用滤纸过滤溶液，将滤液加到干净的烧瓶中。(5)不干扰烧瓶，室温放置约20天，直到一些无色针形晶体出现。(6)过滤晶体，将其存贮在密封的烧瓶中。
权利要求
1.从α-PGG和β-PGG或其类似物的混合物中分离α-五-O-没食子酰-D-葡萄糖(PGG)的方法，所述方法包括以下步骤a)将水加入含有50％或更多α-PGG和50％或更少β-PGG的PGG混合物中；b)将PGG和水混合以溶解PGG；c)滤除所有不溶颗粒；以及d)不干扰滤液直到晶体形成，其中所述晶体含有α-PGG或α-PGG类似物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中使用双蒸水。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，水和PGG的比例约为1gPGG加入20mL水。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合步骤进行约5分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合步骤在升高的温度下进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合步骤在80℃进行。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过滤步骤采用45μm的滤器。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的滤液置于低于室温的温度下。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自葡萄糖或其它己糖、戊糖或丁糖的环氧被碳、氮或硫取代的类似物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-和α-PGG类似物的纯度为95％或更高。
13.从α-PGG和β-PGG或其类似物的混合物中分离β-PGG或其类似物的方法，所述方法包括以下步骤a)将丙酮加入含有50％或更多β-PGG和50％或更少α-PGG的PGG混合物中；b)将PGG和丙酮混合以溶解PGG；c)滤除所有不溶颗粒；以及d)不干扰滤液直到晶体形成，其中所述晶体含有β-PGG或β-PGG类似物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，以约1g PGG加入约5mL丙酮的比例加入丙酮。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合步骤(b)中的混合进行约5分钟。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合步骤(b)可在升高的温度下进行。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述混合步骤(b)在80℃进行。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过滤步骤(c)采用滤纸。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(d)在低于室温的温度下进行。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自PGG的葡萄糖被己糖、戊糖或丁糖取代的类似物。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自葡萄糖或其它己糖、戊糖或丁糖的环氧被碳、氮或硫取代的类似物。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和β-PGG类似物选自PGG的没食子酸部分被其它酚类取代的类似物。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述α-和α-PGG类似物的纯度为95％或更高。
24.一种制备α-PGG或其类似物单晶的方法，所述方法包括步骤a)将水加入含有纯度大于或等于95％的α-PGG的样品中；b)将α-PGG和水混合以溶解α-PGG；c)滤除所有不溶颗粒，将滤液置于干净容器中；以及d)不干扰滤液直到α-PGG晶体出现。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，水加入到α-PGG中的比例是约1.0gα-PGG加入约100mL水。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，步骤(d)进行约15天。
27.一种制备β-PGG单晶的方法，所述方法包括步骤a)将丙酮加入含有纯度大于或等于95％的β-PGG的样品中；b)将β-PGG和丙酮混合以溶解β-PGG；c)滤除所有不溶颗粒，将滤液置于干净容器中；以及d)不干扰滤液直到晶体出现。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，丙酮加入到PGG中的比例是约每1.0gβ-PGG加入约50mL丙酮。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，步骤(d)进行约20天。
全文摘要
本发明提供一种分离和纯化α－和β－形式的五－O－没食子酰－D－葡萄糖(PGG)的简单、便宜和高效的方法，该方法不需要使用HPLC。本文提供的方法可用于从含有α－PGG和β－PGG的混合物中分离α－PGG，所述方法包括下列步骤将水加入含有50％或更多α－PGG和50％或更少β－PGG的样品中；将PGG和水混合以溶解PGG；滤除所有不溶颗粒；以及使滤液不受干扰地放置直到晶体形成。
文档编号C13B20/16GK1930178SQ200580005577
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月24日 优先权日2004年1月23日
发明者任育林, K·B·希默尔迪克, X·陈 申请人:俄亥俄州立大学