一种研究微生物间相互关系的透析袋分离培养法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种研究不同种类微生物共同培养的方法，可更简单、方便地研究不同微生物之间的相互作用，对研究不同生境下尤其是益生菌产品中各类微生物相互作用意义重大。
【背景技术】
[0002]近年来，人体肠道益生菌的研究越来越热，益生菌产品的开发更加迅速。益生菌是一类安全、无毒副作用的健康细菌，能抵抗外来病原菌的侵入，所以对益生菌和其他致病菌之间相互关系的研究也更加重要，对益生菌产品的开发也具有重要意义。
[0003]通常研究细菌间相互作用的方法有细菌共培养法和牛津杯法等。细菌共培养是指在无菌条件下，一些特别指定的不同的微生物在厌氧或好氧条件下的混合培养。但在研究细菌之间相互关系时，细菌混合共培养法能使不同种细菌充分接触却无法准确判断培养液中不同细菌的数目，结果统计困难，不便分析实验结果。牛津杯法是通过获取一种细菌活动产生的物质，通过牛津杯扩散后研究其对另一种细菌的抑制作用，但是，细菌没有直接接触，仅仅依赖于细菌活动产生的相关物质，导致了实验结果敏感性下降。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术不足提供一种研究微生物间相互关系的透析袋分呙培养法。
[0006]为实现不同菌群间交流的不同规格透析袋的筛选，选择5 kd、10 kd、25 kd、1000kd不同孔径的透析袋，通过对酸、葡萄糖、牛血清蛋白的透过时间的检测筛选出可以实现微生物交流的孔径适宜的透析袋和细菌的最佳培养时间，并通过多种细菌共培养，验证抑菌效果，从而对该方法进行评价。
[0007 ]本发明所述培养方法包括下列步骤:
(1)ρΗ值检测
a量取去离子无菌水约50 ml，加入浓盐酸，用pH调节计配制pH=4的溶液；b取200 ml去离子无菌水放入烧杯A1，同时加入5 ml上述pH=4的溶液，用PH计检测烧杯A1内pH;依次取5ml上述pH=4的溶液分别加入到5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内并用透析袋夹将其两头密封，将透析袋分别置于200ml去离子无菌水的烧杯B1、C1、D1、E1内，用pH计检测上述四只烧杯内pH值，记录B1、Cl、D1、E1烧杯内PH值达到A1烧杯pH的时间，记为时间Τι ο
[0008](2)葡萄糖检测
a用去离子无菌水配制浓度为25%的葡萄糖溶液50ml
b取200ml去离子无菌水加入烧杯A2，同时加入5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液，用葡萄糖试剂盒检测并记录烧杯内葡萄糖浓度;依次取5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液分别加入5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml去离子无菌水的烧杯B2、C2、D2、E2内，用葡萄糖试剂盒检测烧杯B2、C2、D2、E2内葡萄糖浓度，记录B2、C2、D2、E2烧杯内葡萄糖浓度达到A2烧杯葡萄糖浓度一致的时间，记为时间!^。
[0009](3) BSA牛血清蛋白检测
a用无菌roS配制浓度为2%的牛血清蛋白溶液50ml
b取200ml PBS加入烧杯A3，同时加入5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液，检测并记录烧杯A3内牛血清蛋白溶液浓度；取5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液分别加入5kd、1 Okd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml无菌roS的烧杯B3、C3、D3、E3内，检测烧杯B3、C3、D3、E3内牛血清蛋白浓度，记录B3、C3、D3、E3烧杯内牛血清蛋白浓度达到A3烧杯牛血清蛋白浓度一致的时间，记为时间T3。
[0010](4)通过对时间的统计，确定细菌共培养最佳培养时间为Τ4，最佳透析袋孔径为lOOOkd。
[0011](5)根据步骤(4)结果，将不同种类微生物转移至lOOOkd透析袋中，置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同微生物之间的相互促进或拮抗作用。
[0012](6)根据步骤(1)、(2)、(3)中得到的结果，将不同种类微生物分别置于5kd、10kd、25kd、1000kd透析袋中，相同孔径的透析袋置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同孔径蛋白对微生物之间的相互促进或拮抗作用。
[0013]本发明的有益效果:本发明中的透析袋分离培养法实现了细菌在同一体系中培养，细菌产生的各种物质可以通过透析袋在体系内进行扩散，实现了细菌间的直接接触。同时透析袋可将各类细菌区分开来，准确计数其中特定微生物数量，结果也更加便于统计和分析。利用透析袋分离培养不同微生物，提供了一套更加便捷的培养方法，对研究微生物间相互关系具有积极意义。
【具体实施方式】
[0014]本发明所述培养方法包括下列步骤:
(1)ρΗ值检测
a量取去离子无菌水约50 ml，加入浓盐酸，用pH调节计配制pH=4的溶液b取200 ml去离子无菌水放入烧杯A1，同时加入5 ml上述pH=4的溶液，用PH计检测烧杯A1内pH;依次取5ml上述pH=4的溶液分别加入到5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内并用透析袋夹将其两头密封，将透析袋分别置于200ml去离子无菌水的烧杯B1、C1、D1、E1内，用pH计检测上述四只烧杯内pH值，记录B1、Cl、D1、E1烧杯内PH值达到A1烧杯pH的时间，记为时间Τι ο
[0015](2)葡萄糖检测
a用去离子无菌水配制浓度为25%的葡萄糖溶液50ml
b取200ml去离子无菌水加入烧杯A2，同时加入5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液，用葡萄糖试剂盒检测并记录烧杯内葡萄糖浓度;依次取5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液分别加入5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml去离子无菌水的烧杯B2、C2、D2、E2内，用葡萄糖试剂盒检测烧杯B2、C2、D2、E2内葡萄糖浓度，记录B2、C2、D2、E2烧杯内葡萄糖浓度达到A2烧杯葡萄糖浓度一致的时间，记为时间!^。
[0016](3) BSA牛血清蛋白检测
a用无菌roS配制浓度为2%的牛血清蛋白溶液50ml
b取200ml PBS加入烧杯A3，同时加入5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液，检测并记录烧杯A3内牛血清蛋白溶液浓度；取5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液分别加入5kd、1 Okd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml无菌roS的烧杯B3、C3、D3、E3内，检测烧杯B3、C3、D3、E3内牛血清蛋白浓度，记录B3、C3、D3、E3烧杯内牛血清蛋白浓度达到A3烧杯牛血清蛋白浓度一致的时间，记为时间T3。
[0017](4)通过对时间的统计，确定细菌共培养最佳培养时间为Τ4，最佳透析袋孔径为lOOOkd。
[0018](5)根据步骤(4)结果，将不同种类微生物转移至lOOOkd透析袋中，置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同微生物之间的相互促进或拮抗作用。
[0019](6)根据步骤(1)、(2)、(3)中得到的结果，将不同种类微生物分别置于5kd、10kd、25kd、1000kd透析袋中，相同孔径的透析袋置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同孔径蛋白对微生物之间的相互促进或拮抗作用。
【主权项】
1.一种研究不同种类微生物共同培养的方法，其特征是: (1)ρΗ值检测 a量取去离子无菌水约50 ml，加入浓盐酸，用pH调节计配制pH=4的溶液； b取200 ml去离子无菌水放入烧杯A1，同时加入5 ml上述pH=4的溶液，用PH计检测烧杯A1内pH;依次取5ml上述pH=4的溶液分别加入到5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内并用透析袋夹将其两头密封，将透析袋分别置于200ml去离子无菌水的烧杯B1、C1、D1、E1内，用pH计检测上述四只烧杯内pH值，记录B1、Cl、D1、E1烧杯内PH值达到A1烧杯pH的时间，记为时间Τι； (2)葡萄糖检测 a用去离子无菌水配制浓度为25%的葡萄糖溶液50ml b取200ml去离子无菌水加入烧杯A2，同时加入5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液，用葡萄糖试剂盒检测并记录烧杯内葡萄糖浓度;依次取5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液分别加入5kd、10kd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml去离子无菌水的烧杯B2、C2、D2、E2内，用葡萄糖试剂盒检测烧杯B2、C2、D2、E2内葡萄糖浓度，记录B2、C2、D2、E2烧杯内葡萄糖浓度达到A2烧杯葡萄糖浓度一致的时间，记为时间T2; (3)BSA牛血清蛋白检测 a用无菌PBS配制浓度为2%的牛血清蛋白溶液50ml b取200ml PBS加入烧杯A3，同时加入5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液，检测并记录烧杯A3内牛血清蛋白溶液浓度；取5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液分别加入5kd、1 Okd、25kd、lOOOkd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml无菌roS的烧杯B3、C3、D3、E3内，检测烧杯B3、C3、D3、E3内牛血清蛋白浓度，记录B3、C3、D3、E3烧杯内牛血清蛋白浓度达到A3烧杯牛血清蛋白浓度一致的时间，记为时间T3; (4)通过对时间T1、Τ2、Τ3的统计，确定细菌共培养最佳培养时间为Τ4，最佳透析袋孔径为lOOOkd; (5)根据步骤(4)结果，将不同种类微生物转移至lOOOkd透析袋中，置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同微生物之间的相互促进或拮抗作用； (6)根据步骤(1)、(2)、(3)中得到的结果，将不同种类微生物分别置于5kd、10kd、25kd、1000kd透析袋中，相同孔径的透析袋置于相同培养基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微生物数量，进而确定不同孔径蛋白对微生物之间的相互促进或拮抗作用。
【专利摘要】一种研究不同种类微生物共同培养的方法，其特征是在无菌环境下将少量含不同种类微生物的培养基分别密封于特定孔径的透析袋，之后将上述密封后的透析袋浸泡于液体培养基中进行培养；此方法可以同时培养多种微生物，不影响各种细菌与培养基中的营养物质和细菌代谢物质交换；培养结束后无菌环境下取出透析袋内含细菌的培养基进行活菌计数后可准确计算各细菌生长数量，进而研究不同微生物之间的拮抗或共生作用，此外，此方法可通过选择不同孔径透析袋进而控制细菌进出透析袋的蛋白，研究不同大小细菌蛋白对其他细菌的生理作用。该方法能够同时研究多种微生物之间的相互作用，简单、快捷。
【IPC分类】C12Q1/06, C12N1/20
【公开号】CN105483043
【申请号】CN201511013560
【发明人】陈廷涛, 辛洪波, 孟凡景, 王鑫
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月31日