一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]
本发明涉及一类特殊蛋白酶的分离、纯化和鉴定方法，具体涉及一类微生物产耐盐蛋白酶的分离、纯化和鉴定方法，属于发酵工程技术领域。
【背景技术】
[0002]
目前国内大豆发酵食品生产使用的菌种主要为米曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌等，在无盐条件下上述微生物所产酶谱较全、蛋白酶酶活较高(500-2000 U/g (干曲))。但大量学者(Su N.ff., Wang M.L., Kwok K.F.，et al.Effects of temperatureand sodium chloride concentrat1n on the activities of proteases and amylasesin soy sauce koji [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,53:1521-1525.刘庆，王君高，李旋.NaCl对酱油酿造的影响[J].中国调味品，2010，
(12):28-30.)和本实验室的研究结果证实了上述微生物产蛋白酶耐盐性较差(常温，10-20%NaCl溶液中15 d，酶活失活80%以上)，导致后期(0.5-6月)发酵过程中蛋白酶酶活严重偏低，无法有效将发酵醪中的蛋白质降解为大豆发酵食品的主要呈味物质一多肽、寡肽、氨基酸等。这是目前我国大豆发酵食品蛋白质原料利用率低、质量和风味较差的最重要原因。
[0003]国内外学者(牛春华，高岩，李玉秋，等.紫外诱变选育高产蛋白酶枯草芽孢杆菌[J],中国酿造，2011，(12):67-69.XuD.F.，Pan L., Zhao H.F.，et al.Breedingand identificat1n of novel koji molds with high activity of acid protease bygenome recombinat1n between Aspergillus oryzae and Aspergillus niger [J].Journal of Industrial Microb1logy and B1technology, 2011 38 (9):1255-1265.)对在无盐条件下提高大豆发酵食品菌种中蛋白酶的研究较多，也取得了一定的成果，但所获得的高产蛋白酶新菌株应用到实际生产中并取得较好效果的仍未见报道，其最重要的原因为新菌株所产蛋白酶的耐盐性差。因此，要提高我国大豆发酵食品原料蛋白质利用率、质量和风味的首要任务是提高发酵菌种产蛋白酶的耐盐性，而不是简单的提高其在无盐条件下的蛋白酶酶活。通过基因工程手段提高大豆发酵食品所用菌种同源耐盐蛋白酶的表达分泌量是解决发酵过程中耐盐蛋白酶酶活低的最佳手段。依据蛋白质(酶)结构决定其性质和功能的原理，通过鉴定上述微生物产耐盐和非耐盐蛋白酶及其活性中心结构的差异，阐明耐盐酶及其活性中心的结构特征，是对大豆发酵食品生产过程中耐盐蛋白酶进行定向调控或对上述菌种进行定向改造使其高产耐盐蛋白酶的前提和基础。但目前对上述菌种产耐盐蛋白酶结构特征进行的研究尚未见报道。主要原因为国内外相关的科研工作者对耐盐蛋白酶在提高大豆发酵食品原料利用率和产品质量中的作用认识不足；另一重要原因为上述微生物产耐盐蛋白酶的分离、纯化和鉴定过程操作繁琐、耗时、所需设备昂贵，一般实验室难以开展此项工作。我国台湾地区的Sun等(Su N.W.，Lee M.H.Purificat1nand characterizat1n of a novel salt-tolerant protease from Aspergillus sp.FC-10, a soy sauce koji mold [J].Journal of Industrial Microb1logy andB1technology, 2001, 26:253-258.)和韩国的 Lee 等(Lee S.K., Hwang J.Y., ChoiS.H., et al.Purificat1n and characterizat1n of Aspergillus oryzae LK-101salt-tolerant acid protease isolated from soybean paste [J].Food Science andB1technology, 2010, 19(2):327-334.)分别对米曲霉 FC-10 和米曲霉 LK-101 产蛋白酶通过硫酸铵沉淀、离心、透析、离子交换、凝胶色谱、酶活测定和电泳(SDS-PAGE )等技术进行了分离、纯化和初步鉴定，并通过Edman法对分离纯化得到的耐盐蛋白酶N端氨基酸序列进行了分析。上述方法存在需要不断测定分离液是否存在(耐盐)蛋白酶酶活、工作量大、步骤繁琐、耗时、设备昂贵、实验结果无法实现实时“可视化”等缺点。而快速对上述微生物产耐盐蛋白酶进行分离、纯化和鉴定是对耐盐蛋白酶进行结构特征和生物学信息进行分析、定向提尚上述菌种耐盐蛋白酶表达和分泌量的关键和肖LI提。本发明基于常规硫酸钱沉淀、离心、透析、PEG浓缩、电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F/T0F-MS)技术，建立了一套具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳设备等优势的耐盐蛋白酶分离、纯化和鉴定技术。该技术为定向调控大豆发酵食品生产过程中耐盐蛋白酶酶活或定向构建高产耐盐蛋白酶新菌株奠定了前期技术基础，而后者对提高我国发酵行业原料利用率和广品质量具有重要意义。
【发明内容】
[0004]
本发明的目的是为了解决目前现有技术中存在的上述不足，提供一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法。具体为，本发明提供一种利用电泳和质谱设备快速、“可视化”分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，该方法具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。
[0005]本发明通过如下技术方案实现。
[0006]一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，按照下述步骤进行:
(O微生物培养及耐盐蛋白酶样品制备:依据微生物的最适培养基、培养条件进行培养，至蛋白酶酶活达到最高时取样、进行高盐发酵制备耐盐蛋白酶样品，发酵条件为种曲(100 g)与20-30%盐水(w/w)按重量比1:1混合、密封，25-60 °C发酵15-180 d。
[0007](2)耐盐蛋白酶及其对照(新鲜种曲)粗酶液的提取:按照磷酸盐缓冲液(0.01-0.5M，pH5-8)与上述新鲜种曲(100 g)的重量比为1:2 (对照)，与上述盐水发酵醪重量比例为1:1，分别充分混合，40 °C浸提I h。
[0008](3)硫酸铵法分步沉淀粗蛋白酶:定性滤纸分别过滤步骤(2)所得粗酶液，添加硫酸铵至10-30%饱和浓度，4 °C下离心(5000-10000 ^/5-30 min)、去除沉淀，上清液中继续添加硫酸铵至50-100%饱和浓度，4 °C下离心(10000-20000 ^/5-30 min)、去上清，收集沉淀(粗蛋白酶)。
[0009](4)粗酶液透析除盐和小分子杂质:适量蒸馏水(5-10 mL)溶解沉淀，移入透析袋，0.01 M磷酸盐缓冲液(pH7.2)中透析(透析袋1000-20000 Da) 24 h (冰浴、换缓冲液3_4次) (5)透析液浓缩:将PEG10000研磨成粉末状，覆盖在透析袋上浓缩至透析液约I ml。
[0010](6)样品和对照蛋白酶的电泳分离:电泳条件为浓缩胶和分离胶丙烯酰胺浓度分别为5%和7.5-12.5%，两种胶中十二烷基磺酸钠(SDS)浓度为0-0.2% ;常规电泳槽加电泳缓冲液(PH8.8)置于冰盒中预冷30 min ;加上述粗酶液15 μ L进行电泳分离，分离电压50-100 V;电泳结束后胶条在2.5%Triton X-100水溶液中洗涤(30 minX 3次)以去除SDS残留。
[0011](7)分离胶(条带上的蛋白酶)与底物胶(含大豆分离蛋白)的酶解反应。将上述
(6)处理过的胶条与底物胶(丙烯酰胺浓度7.5% (不含SDS)，含1%大豆分离蛋白)“面对面”放置，表面覆盖一层0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.2)浸润的定性滤纸保湿，20-60 °C反应1_10
ho
[0012](8)耐盐和非耐盐蛋白酶的“可视化”鉴定。反应结束后考马斯亮蓝R-250染色、脱色液(甲醇:乙酸:水=10:10:80)脱色。对比样品和对照电泳图谱和相应的底物胶透明条带，找出耐盐和非耐盐蛋白酶条带。
[0013](9)耐盐蛋白酶和非耐盐蛋白酶的质谱鉴定。将目标蛋白酶条带挖点，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F/T0F-MS )鉴定，得出耐盐蛋白酶的种类、来源和氨基酸序列等生物学信息。
[0014]上述制备方法中，步骤(I)所采用的耐盐蛋白酶样品制备条件为种曲(100 g)与20-30%盐水(w/w)按重量比1:1混合、密封，30-50 °C发酵15-180 d。
[0015]上述制备方法中，步骤(2)所采用的磷酸盐缓冲液浓度和pH分别为0.01-0.2 M/pH5-80
[0016]上述制备方法中，步骤(3)去除沉淀时添加硫酸铵至10-30%饱和浓度，4 °C下离心(5000-10000 ^/10-30 min)、去除沉淀，上清液中继续添加硫酸铵至40-70%饱和浓度，4°C下离心(10000-20000貧/20-30 min)、去上清，收集沉淀(粗蛋白酶)。
[0017]上述制备方法中，步骤(4)所采用透析袋截留分子量范围为8000-15000 Da。
[0018]上述制备方法中，步骤(6)所采用电泳条件中分离胶丙烯酰胺浓度为7.5-12.5%、十二烷基磺酸钠(SDS)浓度为0.05-0.2%、电泳系统置于冰盒预冷30 min、直接添加粗酶液进行分离、分离电压80-100 V，电泳结束后胶条在2.5%Triton X-100水溶液中洗涤(30minX 3次)以去除SDS残留。
[0019]上述制备方法中，步骤(7)所采用底物胶的制备(丙烯酰胺浓度7.5% (不含SDS)，含1%大显分尚蛋白)及分尚胶与底物胶的反应条件为25-50 0C /3-10 ho
[0020]上述制备方法中，步骤(8)所采用的是电泳分离胶和底物胶通过常规SDS-PAGE电泳染色、脱色的方法，实现耐盐蛋白酶和非耐盐蛋白酶的这种“可视化”鉴定。
[0021]上述制备方法中，步骤(9)所采用是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F/T0F-MS)法获取耐盐和非耐盐蛋白酶种类、来源和氨基酸序列等生物学信息。
[0022]本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:
本发明利用磷酸盐浸提、硫酸铵分步离心沉淀、透析、PEG浓缩、低温电泳和质谱等技术相结合的方法分离、纯化和鉴定了微生物产耐盐蛋白酶，具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。
【附图说明】
[0023]图1为发酵醪浸提粗酶液和新鲜种曲浸提粗酶液电泳图，其中条带I和2分别为发酵醪和新鲜种曲浸提的粗酶液，条带区域I’和2’分别为条带I和2的对应酶解区域。
[0024]
【具体实施方式】
[0025]下