具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请系关于一种甘露聚糖酶，尤指一种具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由纤维素（cellulose)、半纤维素（hemicelIulose)及木质 素（lignin)三种物质所组成，其中以纤维素含量最多，半纤维素次之。甘露聚糖为半纤 维素中的一个重要成份，甘露聚糖主要可分成四类：直链甘露聚糖（linearmannan)、 葡萄甘露聚糖（glucomannan)、半乳甘露聚糖（galactomannan)和半乳葡萄甘露聚糖 (galactoglucomannan)。这些多糖体主要是由甘露糖（mannose)为基本单位，以0 -1，4-糖 苷键（glycosidicbond)键结成骨架。内切性甘露聚糖酶（endo-0-mannanase)为分解自 然界中大量存在的聚甘露醣的主要酵素之一，这类酵素能对(6-1, 4-糖苷键（glycosidic bond)进行随机水解作用。此甘露聚糖酶常见于许多细菌以及真菌之中。
[0003] 近年来，随着自然界半纤维素资源的开发，甘露聚糖酶的工业利用价值也渐受重 视，并且被广泛地应用于不同工业上，如：造纸工业、食品及饲料工业等。在纸浆及造纸业 中，甘露聚糖酶可用来破坏半纤维素与木质素之键结，有利于木质素的去除，大幅降低漂白 剂及氯的用量。在食品应用上，可以当作果汁饮料的澄清剂及降低咖啡豆加工时的黏度，减 少蒸发浓缩的成本。而在动物饲料工业上可当做饲料添加剂，提高动物对饲料的转换率。然 而针对不同工业的应用，甘露聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如：高耐热 性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才有其商业价值及竞争性。因此，找出符合不 同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。
[0004] 为了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分为两个方向去进行：其一是从自 然界中筛选合适的酶基因，例如目前已从嗜碱菌Bacillussp.N16-5中分离出耐碱的甘露 聚糖酶，其最适pH值为pH10. 0 ;而具耐酸性的酶，则由嗜酸菌Aspergillussulphureus分 离出来。另一个途径就是将现有已产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业 的需求。
[0005] 而现今改造酶蛋白主要有两大策略：其一是随机突变（randommutagenesis)或是 将酶基因随机排列，再在特定的作用条件之下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。举例来 说，有学者将Armillariellatabescens的MAN47基因采取随机突变的易错聚合酶连锁反 应（error-pronePCR)技术，将基因序列随意突变之后，送入Saccharomycescerevisiae系 统表现。在筛选了 100多株突变株后，得到比野生株更具耐酸碱性及耐高温的甘露聚糖酶。 此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出 更好的酶蛋白。然而，缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方法也 需要有很好的大量筛选方法来配合。
[0006] 另一种改造策略则是藉由研究酶的三维结构与作用机制，找出对于酶活性或特 性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变与测试，进而得到功能性 更强的改造酶蛋白。举例来说，Cartmell等人解出外切性甘露聚糖酶（exo-mannanase) CjMan26C蛋白立体结构后，发现其与内切性甘露聚糖酶CjMan26A在结构上有很高的相似 度。经由结构相互比对分析后，发现CjMan26C有四个氨基酸在空间上的位置与CjMan26A 有明显的不同，而此四个氨基酸皆位于靠近活性区的环状结构（loop)里。在经由突变了 CjMan26C这四个氨基酸后，成功的将CjMan26C活性反应模式由外切性甘露聚糖酶转变为 内切性甘露聚糖酶。由此可知，分析蛋白立体结构可提供许多有助于改造特性的信息，让研 发人员可以只针对这些特定氨基酸来进行改造，减少大量人力筛选的时间，来得到适合不 同工业产业应用的甘露聚糖酶。
[0007] 因此，本申请欲藉由研究甘露聚糖酶的三维结构，对一些特定的氨基酸进行基因 突变，进而有效提升甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。
【发明内容】
[0008] 本申请之目的在于改造现有甘露聚糖酶，利用结构分析及定点突变技术，有效提 升甘露聚糖酶之产量及活性，藉以增加甘露聚糖酶之工业应用价值。
[0009] 为达上述目的，本申请之一较佳实施态样为为提供一种甘露聚糖酶，其氨基酸序 列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取代修饰之序列。编码该序列编号2 之基因系筛选自黑曲菌（AspergillusnigerBK01)之甘露聚糖酶基因，该甘露聚糖酶系为 耐热性及耐酸性甘露聚糖酶，且其氨基酸序列系为序列编号4之氨基酸序列。又，该甘露聚 糖酶系应用于食品工业、饲料工业、以及造纸工业。
【附图说明】
[0010] 第1图显示甘露聚糖酶ManBK的基因及氨基酸序列。
[0011] 第2图显示甘露聚糖酶ManBK的蛋白立体结构图与瑞氏木霉菌（Trichoderma reesei)的甘露聚糖酶与甘露二醣（mannobiose)结合的复合体结构的重迭结构图。
[0012] 第3图显示定点突变所采用的引物序列。
[0013] 第4图显示甘露聚糖酶ManBK之Y25H突变型的基因及氨基酸序列。
[0014] 第5图显示甘露聚糖酶的蛋白产量及活性测试结果。
[0015] 第6图显示甘露聚糖酶的热稳定性试验结果。
[0016] 实施方式
[0017] 体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的 是本申请能够在不同的态样上具有各种的变化，然其皆不脱离本申请的范围，且其中的说 明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。
[0018] 本申请系从黑曲菌（AspergillusnigerBK01)筛选出甘露聚糖酶（ManBK)基因， 其所表现之甘露聚糖酶蛋白具高耐热性及耐酸性，也因此具有潜在的工业应用价值。为了 增加此耐热性甘露聚糖酶的工业应用价值，本申请首先利用X-ray结晶学技术，将此酶蛋 白的三维立体结构解析出来，然后将此甘露聚糖酶结构与瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶（57% 蛋白序列相似度）与甘露二醣结合的复合体结构作重迭比对，并针对其活性区或具有关键 性特性的氨基酸来做修改，以增进此酶蛋白的作用活性。以下将详述本申请改造甘露聚糖 酶蛋白之方法及其所得到之改良甘露聚糖酶蛋白。
[0019] 首先，选择黑曲菌（AspergillusnigerBK01)的甘露聚糖酶（ManBK)基因作为目 标基因，如第1图所tjk，ManBK基因之全长为1038个喊基（DNA序列以序列编号1标ttO以及345个氨基酸（氨基酸序列以序列编号2标示）。将ManBK基因利用XbaI以及NdeI 限制酶切位构筑到pPICZaA载体中。构筑步骤当中，聚合酶连锁反应（polymerasechain reaction,PCR)所用的引物为 5'-GGTAITGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTCCTTCGCTTCCACT TCCG-3'（前置引物）及 5' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAGCGGAACCGATAGCAGC-3'（反置引物）。 再将该重组质体转形入一胜任细胞（competentcell)中，形成一野生型表达载体。
[0020] 为了利用X-ray结晶学技术解出ManBK的蛋白结构，首先利用Hampton公司的 商业化筛选（screenkit)，其中配置了许多不同的养晶条件，大致包含了盐类，如：氯化 钠（NaCl)、硫酸铵（AmmoniumSulfate)等；缓冲液，如：Tris、HEPES等；以及沉淀剂，如： polyethyleneglycol(PEG)等。以lOmg/ml浓度以上的蛋白质,在各个不同的养晶条件中， 藉由蒸气扩散法（vapordiffusionmethod),在室温下以座滴式（