专利名称：一种复合酶制剂的制备方法及其在饲料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用木霉菌株制备复合酶制剂的方法以及该复合酶制剂在饲料中的应用。
背景技术：
近年来，随着我国人民的生活水平的不断提高，我国的饲料业、养殖业得到迅速发展，饲料资源不足已经成为阻碍我国饲料エ业发展的ー个重要原因。特别是我国是ー个发展中的农业大国、人口大国，饲料的主要原料是植物性的饼柏和其他农副产品，由于植物细胞壁中含有大量的纤维素组成的微纤维，埋在木质素、半纤维素和果胶的连续相中，形成结构稳定且复杂的细胞壁结构。加工粉碎只能打碎部分细胞壁，还有相当多的植物细胞完整无损，营养物质包含在其中，难以被动物所消化吸收，以致饲料利用率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种用木霉菌株制备复合酶制剂的方法以及该复合酶制剂在饲料中的应用。本发明选择产纤维素酶活性较高的木霉菌株进行诱变选育、培养和发酵， 提取出酶制剂，然后将该酶制剂用于动物饲料中。本发明的饲用复合酶制剂有以下作用
I、能够破解植物细胞壁，使营养物质更好地被吸收饲用复合酶中的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等的协同作用，能够破坏细胞壁，使其中的营养物质释放出来，增加动物对植物性饲料的利用率。2、补充内源酶不足，促进动物的消化吸收。加入饲用酶，可以通过外源酶的作用， 提闻词料的消化率，从而促进动物的生长。3、消除抗营养因子纤维素是ー种纤维ニ糖的高聚体，较难溶解，对单胃动物的消化有阻碍作用。半纤维素和果胶溶于水后会产生粘性，不利于内源酶的扩散。饲用复合酶制剂中的外源酶的作用可以将阻碍动物消化吸收的物质降解，促进动物的消化吸收。本发明技术方案的具体步骤如下
I、木霉91一11 (分类名为康氏木霉WJP-02,拉丁文学名为Trichoderma Koningii WJP-02，保藏日期为2012年2月22日，保藏单位全称是中国典型培养物保藏中心，简称是 CCTCC，保藏编号为CCTCC N0:M2012028)菌株的培育
(1)出发菌株的选择取保存的产纤维素酶活性较高的里氏木霉菌株在相同条件下固态培养，测定产酶能力，选取出发菌株里氏木霉A3;
(2)诱变选育将在PDA培养基上培养4-5天的里氏木霉A3菌株孢子悬液置紫外灯下处理2分钟；稀释后与含LiCl的去氧胆酸钠、经球磨12小时的2%纤维素粉琼脂基混合，倒在I毫米的双层平板的上层，双层平板的下层是3毫米厚的Mand ' s营养液琼脂层。30°C 避光培养3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直径与菌落直径比值大的单菌落；
(3)将从双层平板上挑取的40个优良菌株移入PDA斜面，30°C培养4-5天，取斜面一支，无菌水洗下，制成孢子悬液，将Iml孢子悬液接种于固体培养基中，30°C培养3-4天，加50 ml水30°C浸提I小时，过滤得发酵粗酶液，测定纤维素酶活力，得到10株高产菌株；
(4)再经固态培养复筛，进行单孢子分离和酶活测定，最終得到木霉91-11菌株。2、酶制剂的制备饲用复合酶制剂含有纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等多酶组分，以木霉91-11菌株、玉米秸杆和麸皮为主原料，经固态通风发酵、提取酒精而成。本エ艺采用硫酸铵盐析、酒精沉淀两种方法进行
(1)酶曲的制备木霉91-11菌株用PDA培养基进行斜面种子培养，将得到的斜面种子悬液接种至以秸杆和麸皮为基质的三角瓶中进行固态培养，得到酶曲；
(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常温下间歇搅拌，浸提；
(3)离心分离将浸提得到的料液，用三足式离心机分批离心，分出纤维渣，离心稀酶液入储te ；
(4)过滤净化离心稀酶液泵入高位槽中，用管式过滤器进行过滤，得浄化的酶液；
(5)超滤浓缩浄化的酶液进行超滤浓缩，得超滤液；
(6)超滤液沉淀，得到酶泥；
(7)酶泥加辅料混匀后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；
(8)粉碎、混合干燥的酶进行粗破碎后，在粉碎机中进行粉碎，过40目或60目筛，得到饲用复合酶制剂。根据上述酶制剂的制备方法，其中步骤(2)的浸提条件为酶曲与水之比为I :7 ； 控制浸提液的PH5. 0-5. 59，室温下浸提I. 5小时；
根据上述酶制剂的制备方法，其中步骤(5)中超滤浓缩的具体条件为工作温度为常温、控制PH5. 0-5. 5，进液量与超滤水体积之比为4-6:1，系统压カ控制在0. 1-0. 25MPa之间,浓缩4倍；
根据上述酶制剂的制备方法，其中步骤(6)中的沉淀方法优选硫酸铵盐析沉淀或酒精沉淀；
硫酸铵盐析的具体方法优选为超滤液泵入盐析罐，开动搅拌，缓缓加入硫酸铵至饱和，加完后，继续搅拌15分钟，使硫酸铵充分溶解并与酶液混合均匀，常温下静置沉淀12 小时，浓缩液进行压滤或离心得到酶泥；
酒精沉淀的具体方法优选为超滤液泵入酒精沉淀罐中，开动搅拌，加入预冷的重量比为95%酒精，加完后，继续搅拌10分钟，常温下静置沉淀，倾去上清液，离心分离或板框压滤，收集滤液待回收，得酶泥；
本发明的有益效果是
1.纤维素酶组分较齐全，结晶纤维素也可分解；
2.酶活性比较稳定，在pH4.8，50°C搅拌缸中，稳定达48小时以上；
3.对化学抑制剂有一定的抗性；
4.91-11菌株产纤维素酶活性(FDA)较QM9414、Rut-C_30、⑶R-29都有大幅度的提
闻;
5.91-11菌株适合于固态发酵法生产，这种发酵法投资成本相对较低。6.发酵的原料为各种饲料原料，如，豆柏、麸皮、米糠等等。通过固体发酵得到的酶制剂，正是由各种饲料原料中的抗营养因子诱导得到，来源性决定了该类酶制剂在动物肠胃道内适应性强、作用效果明确。
7.发酵产物是含有主要酶种和多种辅助酶种的复合酶，而不是简单的单酶复合物发酵所得到的酶制剂产品中，包括几种主要酶种，如木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶， 等等，同时，产品中含有多种低浓度辅酶，能增强主要酶种的作用。辅助酶种可切去主链上的分枝，也可与微生物的其他代谢因子(未知因子)，一起作用，协助酶与特定的物质结合， 这个过程是酶降解完整抗营养因子的关键一歩，协助水解饲料组分中广泛存在的非淀粉多糖及其他抗营养因子。8.微生物在固体发酵的生长条件，接近它们在自然环境中的生长，因而更有能力生产出液体深层发酵不能生产的酶和代谢产物。9.酶蛋白属于次级代谢产物，微生物的次级代谢产物通常是在微生物进行分化时形成的，液体培养抑制微生物分化，所以固体发酵单位的酶产量和种类，往往比液体发酵闻。10.固体发酵得到的自然组合的酶，才真正具有协同作用，能很好地降解各种饲料中不可消化的组分。11.固体发酵生产，复合酶的各种酶制剂之间具有“协同性”。12.添加复合酶，能够通过提前淀粉和蛋白质的消化位点，从而提高动物日量的消化率，改善动物健康水平。13.添加复合酶，有明显的能量效益。14.添加复合酶，酶解产生“生物活性寡糖”。15.添加复合酶，提高脂肪(油脂)的消化率。16.添加复合酶，能够分解热不敏感的大豆抗原蛋白、凝集素、胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子。17.除“木聚糖酶、葡聚糖酶”以外，复合酶中均含有一定量的“纤维素酶”、“甘露聚糖酶”、“半乳糖苷酶”等等。
附图I中是酶制剂提取的エ艺流程图。本申请中的木霉91 一 11的分类名为康氏木霉WJP-02，拉丁文学名为Trichoderma Koningii WJP-02，保藏日期为2012年2月22日，保藏单位全称是中国典型培养物保藏中心，简称是CCTCC，保藏编号为CCTCC N0:M2012028o
具体实施例下面结合具体实施例进ー步说明本发明。实施例I
木霉菌株91一11，全称为康氏木霉WJP-02 (Trichoderma Koningii WJP-02),保藏号为CCTC N0:M2012028，选育方法如下
首先制备培养基以PDA为培养基在30°C下培养4-5天，然后固态培养以秸杆和麸皮为基质、250ml三角瓶装料5g，加营养盐15ml，0. IMPa灭菌30min，接种产纤维素菌株的孢子悬液(105-106 个/ml) lml，30°C培养 4 天。然后取保存的产纤维素酶活性较高里氏木霉菌株的菌株同条件下固态培养，測定产酶能力，选择里氏木霉A3菌株为出发菌株。然后将在PDA培养基上培养4-5天的菌株孢子悬液以终浓度2 u g/ml的NIG溶液，pH6. 0，30°C预感处理30分钟；置紫外灯下处理2分钟；稀释后与含LiCl (0. 2%)去氧胆酸钠(0. 05%)，经球磨12小时的2%纤维素粉琼脂基混合，倒在I毫米的双层平板的上层，双层平板的下层是3毫米厚的Mand , s营养液琼脂层。 30°C避光培养3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直径与菌落直径比值大的单菌落。将从双层平板上挑取的40个优良菌株移入PDA斜面，30°C培养4-5天，取斜面一支无菌水洗下，制成孢子悬液，将Iml孢子悬液接种于固体培养基中，30°C培养3-4天，加50 ml水30°C 浸提I小时，过滤得发酵粗酶液，测定纤维素酶活力(FDA)，得到10株高产菌株。再经固态培养复筛，获得一株产纤维素酶活力高，发酵周期短的菌株，对其进行单孢子分离和酶活测定，最终得到91一 11菌株。
实施例2
酶制剂的制备
主要设备浸提糟、离心机、超滤器、盐析罐、贮罐、离心沉降机、输、液泵、真空干燥器、粉碎机、混合器。实施例I中筛选出的木霉91 一 11菌株用PDA培养基进行斜面种子培养，将得到的斜面种子悬液接种至以秸杆和麸皮为基质的三角瓶中进行固态培养，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲与水之比为I :7 ;浸提液pH5. 0-5. 59，室温下间歇搅拌，浸提I. 5小吋。浸提的料液，用三足式离心机分批离心，分出纤维渣，稀酶液入储罐。离心稀酶液泵入高位槽中，用管式过滤器进行过液，得浄化的酶液。浄化的酶液进行超滤浓縮。工作温度为常温、pH5. 0—5. 5，进液量与超滤水体积之比为4-6:1，根据超滤情况调整系统压力，控制在
0.I一0.25MPa之间，浓缩4倍。超滤浓缩液泵入盐析罐，开动搅拌，按所需硫酸铵饱和度缓缓加入粉状硫酸铵，边加边搅拌，硫胺加完后，继续搅拌15分钟，使硫酸铵充分溶解并与酶液混合均匀，达到酶液中硫酸铵饱和度为70%，常温下静置沉淀12个小时，倾去上清液，浓缩液进行压滤或离心。离心分离离心速度1450转/分以上，离心时间30— 35分钟。真空低温干燥酶泥加辅料混匀后，装盘入真空干燥器中进行低温(45°C)干燥。酶中水重量含量在8.0%以下。干燥的酶进行粗破碎后，在粉碎机中进行粉碎，分别过40目或60目筛，掺入助剂，混合后即为饲用复合酶。提取收率浸提收率87%;浓缩收率85%;硫酸铵盐析收率 95% ；尚心分尚收率95% ;干燥收率94%,提取总收率63%。
实施例3
酶制剂的制备实施例I中筛选出的木霉91 一 11菌株用PDA培养基进行斜面种子培养，将得到的斜面种子悬液接种至以秸杆和麸皮为基质的三角瓶中进行固态培养，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲与水之比为I :7 ;浸提液PH5. 0-5. 59，室温下间歇搅拌，浸提I. 5 小吋。浸提的料液，用三足式离心机分批离心，分出纤维渣，稀酶液入储罐。离心稀酶液泵入高位槽中，用管式过滤器进行过液，得浄化的酶液。浄化的酶液进行超滤浓縮。工作温度为常温、pH5. 0-5. 5，进液量与超滤水体积之比为4-6:1，根据超滤情况调整系统压力，控制在0. 1-0. 25MPa之间，浓缩4倍。超滤浓缩液泵入酒精沉淀罐中，酶液中酒精浓度为67%， 开动搅拌，按所需浓度流量加_15°C以下预冷的95%酒精，加完后，继续搅拌10分钟，常温下静置沉淀4-6小时，倾去上清液，离心分离。离心速度1450转/分以上，离心时间30-35 分钟。板框试压、试漏一切正常后，压入沉淀酶液，根据压滤情況，调节压力，控制在0. 5MPa 之内。收集滤液待回收，得酶泥。酶泥加辅料混匀后，装盘入真空干燥器中进行低温(45°C) 干燥。酶中水的重量含量在8.0%以下。干燥的酶进行粗破碎后，在粉碎机中进行粉碎，分别过40目或60目筛，掺入助剂，混合后即为饲用复合酶。提取收率浸提收率87%;浓缩收率85% ;酒精沉淀收率93% ;离心分离收率95% ;干燥收率91% ;提取总收率62%。
实施例4
两组鸡饲料，选用常规配方，其组成为以重量计玉米63%，豆饼18. 5%，麸皮5%，酵母4%，骨粉I. 5%，贝壳粉7. 5%，盐0. 3%，多维素0. 03%,蛋氨酸0. 03%。但是在第一组鸡饲料中添加了饲料总重量0. 1%的按以上步骤制作的复合酶，也就是说第二组为对照组。试验鸡为雏鸡笼三级喂养，每笼10只鸡，饲养人员手撒料，每天喂4次，并记录投喂量。经过50天后
的饲养结果如下
权利要求
1.ー种饲用复合酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)酶曲的制备木霉91-11菌株用PDA培养基进行斜面种子培养，将得到的斜面种子悬液接种至以秸杆和麸皮为基质的三角瓶中进行固态培养，得到酶曲；(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常温下间歇搅拌，浸提；(3)离心分离将浸提得到的料液，用三足式离心机分批离心，分出纤维渣，离心稀酶液入储te ；(4)过滤净化离心稀酶液泵入高位槽中，用管式过滤器进行过滤，得浄化的酶液；(5)超滤浓缩浄化的酶液进行超滤浓缩，得超滤液；(6)超滤液沉淀，得到酶泥；(7)酶泥加辅料混匀后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；(8)粉碎、混合干燥的酶进行粗破碎后，在粉碎机中进行粉碎，过40目或60目筛，得到饲用复合酶制剂。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(6)中的沉淀方式为硫酸铵盐析沉淀。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于步骤(6)的具体操作为将超滤液泵入盐析罐，开动搅拌，缓缓加入硫酸铵至饱和，加完后，继续搅拌15分钟，使硫酸铵充分溶解并与酶液混合均匀，常温下静置沉淀12小时，去掉上清液，压滤或离心得到酶泥。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(6)中的沉淀方式为酒精沉淀。
5.如权利要求I或4所述的方法，其特征在于步骤(6)的具体操作为将超滤液泵入酒精沉淀罐中，开动搅拌，加入预冷的重量比为95%酒精，加完后，继续搅拌10分钟，常温下静置沉淀，倾去上清液，离心分离或板框压滤，收集滤液待回收，得酶泥。
6.根据权利要求I所述的制备方法制备的复合酶制剂在饲料中应用，其特征在于将该复合酶制剂混合在植物制成的饲料中。
7.一种制备如权利要求I所述的木霉91-11菌株的方法，其特征在于该方法包括以下步骤出发菌株的选择取保存的产纤维素酶活性较高的里氏木霉菌株在相同条件下固态培养，测定产酶能力，选取里氏木霉A3为出发菌株；诱变选育将在PDA培养基上培养4-5天的里氏木霉A3菌株孢子悬液置紫外灯下处理 2分钟；稀释后与含LiCl的去氧胆酸钠溶液、经球磨12小时的2%纤维素粉琼脂基混合，倒在I毫米的双层平板的上层，双层平板的下层是3毫米厚的Mand , s营养液琼脂层，30°C避光培养3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直径与菌落直径比值大的单菌落；将从双层平板上挑取的40个优良菌株移入PDA斜面，30°C培养4-5天，取斜面一支，无菌水洗下，制成孢子悬液，将Iml孢子悬液接种于固体培养基中，30°C培养3-4天，加50 ml 水30°C浸提I小时，过滤得发酵粗酶液，测定纤维素酶活力，得到10株高产菌株；再经固态培养复筛，进行单孢子分离和酶活测定，最終得到木霉91-11菌株。
8.利用如权利要求7所述的木霉91-11菌株制备酶的方法，其特征在于菌株在含有碳源和氮源的营养盐溶液配成的培养基中生长产酶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述碳源为花生秸、苞米秸、谷草和稗草粉中的ー种或多种。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述氮源为麸皮。
全文摘要
本发明涉及一种用木霉菌株制备复合酶制剂的方法以及该复合酶制剂在饲料中的应用。本发明选择产纤维素酶活性较高的木霉菌株进行诱变选育、培养和发酵，提取出酶制剂，然后将该酶制剂用于动物饲料中，从而增加动物对饲料的利用率。
文档编号C12R1/885GK102604918SQ20121008582
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者王健鹏 申请人:王健鹏