专利名称：小麦抗赤霉病扩展基因Fhb1的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于作物育种学领域，涉及小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记及其应用。
背景技术：
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，提供人类大约20%的能量。在小麦生产中许多生物与非生物逆境直接影响小麦的产量与品质。赤霉病就是其中最重要的ー种生物逆境，严重影响小麦的品质和产量。抗病品种的选育和应用是控制赤霉病最经济有效的方法，抗病基因的发掘是抗病育种的前提和基础，而开发与抗病基因紧密连锁的分子标记更是应 用抗病基因的关键。小麦对赤霉病的抗性主要有五种类型(Mesterhazy 1995),其中抗扩展(Type I)和抗扩展(Type II) (Schroeder and Christensen 1963)是最主要的两种类型。Type I 抗性主要反映小麦抵抗病原菌的初扩展，是小麦抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反应中起着至关重要的作用。许多研究表明小麦对赤霉病的抗性是典型的数量性状，受多基因控制。迄今为止已经定位了大约200多个抗赤霉病QTL，其中位于3B染色体上的抗赤霉病扩展QTL存在于多个抗性种质中，表达稳定且效应最强，且具有很好的抗病育种潜カ(Liu and Anderson2003)。Liu et al. (2006)将该 QTL 精细定位到相距 I. 2cM 的 XSTS3B-189-XSTS3B-206 区间，并将其命名为Fhbl。Lin et al (2006)利用望水白X南大2419重组自交系群体在望水白的3B染色体上也检测到该QTL，定位于Xbarc 147-Xgwm493区间，解释30%左右的表型变异。由于小麦赤霉病抗性具有典型的数量性状特征，易受环境影响，早期世代很难对其进行选择。此外，许多抗赤霉病种质的农艺性状较差，且地区适应性较强，利用传统育种方法培育抗性品种费时费カ可能也得不到预期的結果。分子标记辅助选择育种与传统育种相比，可以在早期世代确定目标基因型，且选择不受基因表达及环境条件的影响，能够提高选择的准确性，从而加快育种进程(Collard and Mackill 2008)。因此与其更紧密连锁分子标记的开发有利于提高对Fhbl的应用效率。此外，Fhbl目前所在区间对应的物理区间在望水白中还不知有多大，有必要开发更紧密连锁的分子标记加快该基因的克隆研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供与小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl更加紧密连锁的分子标记。本发明的另ー个目的是提供该小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记，用标记引物MAG6067-F :SEQ ID NO. I,MAG6067-R SEQ ID NO. 2扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为280bp，即为小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl连锁的分子标记MAG6067，该标记为显性分子标记，与Fhbl紧密连锁，利用Mapmaker Macintosh V 3. 0测得该标记与Fhbl基因的遗传距离为0. 05cM ；或用标记引物MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 扩增小麦品种DNA,获得的扩增片段为510bp，即为小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl连锁的分子标记MAG6660，该标记为共显性分子标记，与Fhbl紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V 3.0测得该标记与Fhbl基因共分离。所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉病扩展基因Fhbl的鉴定中的应用。小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记方法，用上述的任意ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能够扩增出280bp的扩增片段，或者用分子标记MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能够扩增出510bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病扩展基因Fhbl。
本发明所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。利用上述的分子标记筛选抗赤霉病小麦的方法为用上述的任意ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能够扩增出280bp的扩增片段，或者用分子标记MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能够扩增出510bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病扩展基因Fhbl的抗赤霉病小麦。所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病扩展基因Fhbl中的应用。上述小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记是通过以下方法获得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016与其轮回亲本绵阳99-323F2:3群体的创建与Fhbl区段重组体的筛选(1)NMAS016(早)与小麦品种绵阳99-323 (3)进行杂交得到杂种F15F1自交产生F2群体；(2)利用Fhbl的边界标记筛选F2群体中在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选在该区段发生重组的纯合单株。(ニ)重组体抗病表型的鉴定(3)重组体开花时采用单花滴注法接种。接种15天后分单株调查病小穗数和病轴长评价其抗扩展性；(三)分子标记分析(4)用SDS法提取抗病亲本NMAS016、感病亲本绵阳99_323及F2群体各单株的DNA ;用中国春3B序列开发的69个SSR标记对NMASO16，绵阳99-323，中国春以及中国春缺失系3BS8-0. 78-0. 87 (Endo and Gill 1996)进行多态性分析和特异性分析。(5)选择在亲本间扩增出多态、且能缺失定位到3BS8-0. 78-0. 87bin的分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的基因型资料，并且利用这些标记检测杂合重组体后代F3家系各单株的基因型；PCR 反应体系为 12. 5 ii I，其中 10 X buffer I. 25 u I, 25mM MgCl2O. 75 u I,
2.5mMdNTPs I yl，左右引物各 0. 2 y M，Taq 酶(5u/yl) 0. I yl，模板 DNA 10ng，加水至12. 5u I ；PCR扩增程序为94°C预变性3min后，94°C变性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，循环35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。(四)分子标记获得(6)根据连锁交换规律，结合F2代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型，利用软件Mapmaker Macintosh V3. 0构建望水白Fhbl的遗传连锁图，获得了与Fhbl最为紧密连锁的分子标记MAG6067和MAG6660。有益效果 本发明在国际上首次获得了与Fhbl紧密连锁的分子标记MAG6067和MAG6660。可以加速抗病基因Fhbl在小麦抗病育种中的应用，并且还可以用于Fhbl基因的克隆。I、获得了与Fhbl紧密连锁的分子标记MAG6067和MAG6660。在已知的分子标记中与Fhbl连锁最为紧密的是MAG6660，与Fhbl基因共分离，能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其它抗病基因的聚合。2、鉴定方便。这两个分子标记都为共显性标记，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG6660检测Fhbl基因，可以确定Fhbl的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhbl的植株并用于抗病品种的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对品种的影响。3、提高抗病品种的选择鉴定效率，节约成本。在传统的抗赤霉病育种过程中，需要将携带有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，对后代群体单株进行抗病性鉴定，并且需要多年多点的表型鉴定；并且抗病表型鉴定易受环境的影响，表型鉴定结果有一定的误差。因此抗病品种的选育不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测与抗赤霉病扩展基因Fhbl紧密连锁的分子标记，可以将表型鉴定的工作大大減少，并且在苗期就可鉴定出携有抗病基因Fhbl的单株，从而淘汰非目标植株。因此，通过检测与抗赤霉病扩展基因Fhbl共分离的分子标记MAG6660进行选择，不仅节约育种成本同时大大提高抗病品种的选择效率。4、可用于克隆抗赤霉病扩展基因Fhbl研究。图位克隆抗赤霉病扩展基因Fhbl的前提在于获得与Fhbl紧密连锁的分子标记。MAG6067和MAG6660在所有已知分子标记中与Fhbl连锁最为紧密。
图1MAG6067和MAG6660与小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的遗传连锁图，右边为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离。图2MAG6067 扩增带型。I 为 NMAS016，2 为绵阳 99-323，3、4、5、6、12、18、19，20、21为抗病基因型单株，其余为感病或杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条帯。图3MAG6660扩增带型。M为PUM，左侧是分子量标记条带大小(bp)。I为NMAS016，2为绵阳99-323，3、8、15、16、17为抗病基因型单株，2、5、9、13、19、20为感病基因型单株，4、6、7、10、11、12、14、18、21为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条帯。
具体实施例方式实施例I
上述小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记是通过以下方法获得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016与其轮回亲本绵阳99-323F2:3群体的创建与Fhbl区段重组体的筛选(1)NMAS016(早)与小麦品种绵阳99-323 (3)进行杂交得到杂种F15F1自交产生包含有2875个单株的F2群体；(2)利用 Fhbl 的边界标记 Xbarc 147 和 Xgwm493 (http://wheat, pw. usda. gov/GG2/)在F2群体中筛到71个在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选得到99个在该区段发生重组的纯合单株。(ニ)重组体抗病表型的鉴定 重组体开花时采用单花滴注法接种。接种15天后分单株调查病小穗数和病轴长度评价其抗扩展性。鉴定结果表明这些重组体抗性分离明显，携帯有Fhbl基因的株系与感病亲本相比，抗性有显著提高(表I)。(三)多态性分子标记的筛选及重组体基因型分析(I)首先利用中国春3B序列开发的69个SSR标记Fhbl近等基因系NMAS016和绵阳99-323进行多态性筛选，最终得到2个在亲本间有多态的SSR标记MAG6067和MAG6660。(3)利用在亲本间有多态的分子标记BARC147、GWM493、MAG6067和MAG6660分析所有纯合重组体，这些重组体仅可分成6种重组类型(表I)。(四)分子标记的获得根据连锁交换规律，结合F2代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型(表I)，利用软件Mapmaker Macintosh V3. 0构建了望水白Fhbl的遗传连锁图，获得了与Fhbl紧密连锁的分子标记MAG6067和MAG6660，它们分别距Fhbl基因0. 05cM、OcM。MAG6067和MAG6660分子标记引物扩增带型见图2和图3。表1NMAS016-绵阳99_323F2:3群体中纯合重组体的基因型和表型
权利要求
1.小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记，其特征在于 用标记引物 MAG6067-F :SEQ ID NO. I, MAG6067-R SEQ ID NO. 2 扩增小麦品种 DNA，获得的扩增片段为280bp，即为小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl连锁的分子标记MAG6067，该标记为显性分子标记，与Fhbl紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0测得该标记与Fhbl基因的遗传距离为0. 05cM； 或用标记引物 MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 扩增小麦品种 DNA，获得的扩增片段为510bp，即为小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl连锁的分子标记MAG6660，该标记为共显性分子标记，与Fhbl紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0测得该标记与Fhbl基因共分离。
2.权利要求I所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉病扩展基因Fhbl的鉴定中的应用。
3.小麦抗赤霉病扩展基因Fhbl的分子标记方法，其特征在于用权利要求I所述的任意ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能够扩增出280bp的扩增片段，或者用分子标记MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能够扩增出510bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病扩展基因FhbI。
4.权利要求I所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于利用权利要求I所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦的方法为用权利要求I所述的任意ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R扩增出280bp的扩增片段，或者用分子标记MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能够扩增出510bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病扩展基因Fhbl的抗赤霉病小麦。
6.权利要求I所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病扩展基因Fhbl中的应用。
全文摘要
本发明属于作物育种学领域，涉及小麦抗赤霉病扩展基因Fhb1的分子标记及其应用。所述的分子标记选自MAG6067或MAG6660中的任意一种，与Fhb1基因的遗传距离分别为0.05cM和0cM。本发明在国际上首次获得了与Fhb1最为紧密连锁的分子标记。用标记MAG6660检测Fhb1基因，可以确定Fhb1的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhb1的植株并用于抗病品种的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对表型的影响。利用本发明与Fhb1紧密连锁的分子标记，可以大大节省抗病材料的筛选时间和劳力，并加强预测的准确性，还可以加快Fhb1基因的克隆。
文档编号C12N15/10GK102653759SQ20121008519
公开日2012年9月5日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者李国强, 薛树林, 郜忠霞, 马正强 申请人:南京农业大学