专利名称：针对her-3的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合蛋白，包括结合于HER-3的抗体及其结合片段以及编码它们的多 核苷酸序列。本发明也提供了用于生产本发明结合蛋白的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞。此外，本发明还提供了用于诊断和治疗与HER-3介导的信号转导和/或其配体调蛋白(heregulin)相关疾病的组合物和方法。
背景技术：
人类表皮生长因子受体3(HER_3，也称为ErbB3)是一种受体蛋白酪氨酸激酶，属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)亚家族，该家族还包括HER-1(也称为EGFR)、HER-2 和 HER-4 (Plowman 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87 (1990)，4905-4909 ；Kraus 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (1989) ,9193-9197 ；以及 Kraus 等人的 Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993)，2900-2904)。与典型的表皮生长因子受体一样，跨膜受体HER-3由+胞外配体结合结构域(ECD)、ECD内的二聚体结构域、跨膜结构域，胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(TKD)和C端磷酸化结构域组成。配体调蛋白(HRG)与HER-3的胞外结构域结合，并且通过促进其与其他人类表皮生长因子受体(HER)家族成员的二聚化，并且使HER-3的跨膜结构域磷酸化，从而激活受体介导的信号通路。HER家族成员间的二聚体放大了 HER-3的信号电位，它既是信号多样化的方式也是信号放大的方式。例如，在HER家族成员中，HER-2/HER-3的异源二聚体诱导了最重要的促有丝分裂信号中的一个。HER-3已被发现在一些类型的癌症如乳腺癌、胃肠癌和胰腺癌中过表达。有趣的是，已有研究表明HER-2/HER-3的表达和癌症从非侵袭阶段发展到侵袭阶段有相关性(Alimandi 等人的 Oncogene 10,1813-1821 ；deFazio 等人的 Cancer 87,487-498 ；Naidu等人的Br. J. Cancer 78，1385-1390)。因此，干扰HER-3介导的信号转导的制剂是令人期望的。已经报道了鼠源或嵌合型HER-3抗体，比如在专利US 5968511、US 5480968和WO03013602 中。最近研究表明，一种针对HER-2的人源化单克隆抗体赫赛汀 (Hercept in ),干扰了 her-2介导的信号转导，对人类癌症有治疗效果(Fendly等人的 Hybridoma 6，359-370 ；Hudziak 等人的 MoI. Cell. Biol. 9，1165-1172 ;Stebbing 等人的Cancer Treat. Rev. 26，287-290)。已表明赫赛幻~ 可以通过两种不同的机制起作用，也就是免疫系统的效应细胞的参与和直接的细胞毒及凋亡诱导作用。但是，只有那些高表达HER-2的患者对赫赛彡丁 的治疗反应显著，因此，限制了适合治疗的患者数目。而且，耐药性的发展或是肿瘤细胞中HER-2表达或其表位序列的改变可能会使那些有希望被治疗的患者不能与抗体反应从而消除了其治疗作用。因此，需要有更多的靶向治疗药物涉及HER家族的其它成员，如HER-3。附图简要说明图I表示了 HER-3在一系列人类癌细胞系中的表达程度，表明HER-3在多种人类癌症均表达。图2表示了 FACS分析HER-3抗体与稳定表达HER家族不同成员的Ratl细胞或仅含有空载体的Ratl细胞的结合情况。
图3表示的是抗体竞争bins定位于HER3结构域。图4表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行间接的FACS Scatchard抗体亲和分析的结果。分析表明本发明的抗HER-3抗体对表达于细胞表面的HER-3具有高亲和力和
高结合常数。图5表示的是本发明的抗HER-3抗体加速了 HER-3的内吞作用。图6a_e表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行的配体竞争分析的结果。这些结果表明，本发明的抗体特异地降低了 [1251] - a -HRG/ [125I] - β -HRG与表达内源HER-3的细胞的结合。图7a表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行HER-3磷酸酪氨酸酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果。本发明的抗体能够抑制β-HRG介导的HER-3活化，表现为受体酪氨酸磷酸化程度增加。图7b表示了利用滴定过的抗体进行本实验的代表性结果。图8表示的是利用本发明的抗HER-3抗体与p42/p44 MAP激酶进行酶联免疫吸附实验的结果。本发明的抗体能够降低β-HRG介导的p42/p44 MAP-激酶活化，表现为MAP-激酶磷酸化程度增加。图9表示的是利用本发明的抗HER-3抗体与磷酸AKT进行酶联免疫吸附实验的结果。本发明的抗体能够降低β -HRG介导的AKT活化，表现为AKT的磷酸化。
图10表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了 MCF7细胞增值。本发明的抗体抑制了人类癌细胞中HRG诱导的细胞增值。图11表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了 MCF7细胞的转移。图12a_i表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了非贴壁依赖性细胞的生长。图13表示的是本发明的人抗HER-3抗体对T47D人类乳腺癌细胞的异种移植生长的抑制。图14表示的是通过对小鼠施用抗Her3 (Ul_59and U1-53)或抗EGFR (爱必妥)抗体，减少了小鼠中BxPC3人类胰腺癌细胞数量。图15表示的是本发明的人类抗HER-3抗体以及与抗EGFR(爱必妥)的抗体的联合，降低了人类胰腺癌细胞BxPC3的异种移植生长。图16表明本发明的抗体延缓了黑色素瘤细胞(HT144)在nu/nu小鼠中的生长。图17表示的是本发明的人类HER-3抗体(Ul-53，Ul_59and U1-7)降低了人类结肠癌细胞HT-29的异种移植生长。图18表示的是本发明的人类抗HER-3抗体(Ul-59，Ul_53and U1-7)降低了人类肺癌细胞Calu-3的异种移植生长。图19表示的是本发明的人类抗HER-3抗体(Ul_7，Ul_59and U1-53)降低了人类胰腺癌细胞BxPC3的异种移植生长。图20表明本发明的抗体(U1-59)导致HER-3在BxPC3人类胰腺癌异种移植中受到抑制。发明概述
本发明的首要方面涉及一种结合于HER-3的分离的结合蛋白。在本发明的一个实施方案中，本发明的一种分离的结合蛋白包括重链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(⑶R)，该⑶R选自以下序列组成的群组(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230所示的⑶RH2 ;以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230所示的CDRH3 ;和/或轻链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(⑶R)，所述⑶R选自以下序列组成的群组(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRL2 ;及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRL3。在本发明的另一个实施方案中，本发明的一种分离的结合蛋白包括重链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230 ;和/或 轻链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本发明的另一个实施方案中，本发明分离的结合蛋白包括如下所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列
SEQ ID NOs :2 和 4、6 和 8、10 和 12、14 和 16、18 和 20、22 和 24、26 和 28、30 和 32、36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和
76,78和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90,92 和 94,96 和 98、100 和 102、104 和 106、108 和110、112 和 114、116 和 118、122 和 124、126 和 128、130 和 132、134 和 136，138 和 140、142 和144、146 和 148、150 和 152、154 和 156、158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188、190 和 192、194 和 196、198 和 200,202 和 204、206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ;或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重链氨基酸序列；或者SEQ ID NOs :58或64所示的轻链氨基酸序列。根据本发明，能与HER-3结合的分离的结合蛋白与HER-3胞外部分的至少一个表位相互作用。这些表位优选定位于LI结构域(第19-184位氨基酸)、S1 (第185-327位氨基酸)和S2结构域(第500-632位氨基酸)或L2结构域(第328-499位氨基酸)，其中LI结构域是氨基端结构域，SI和S2结构域是两个富含半胱氨酸的结构域，L2位于两个富含半胱氨酸的结构域的两侧。这些表位也可定位于这些结构域的组合区域，但并不限于LI和SI部分组成的表位。更加优选的是这样一种分离的结合蛋白，它能够结合于成熟的HER-3、特别成熟的人类HER-3蛋白的1-160，161-358，359-575，1-358和/或359-604位氨基酸残基形成的三维结构。优选的，本发明的一种分离结合蛋白是一种支架蛋白，具有抗体样的结合活性或是一种抗体，如抗HER-3的抗体。尤其是，抗HER-3的抗体选自下列抗体组成的群组Ul-I抗体、U1-2抗体、U1-3抗体、U1-4抗体、U1-5抗体、U1-6抗体、U1-7抗体、U1-8 抗体、U1-9 抗体、U1-10 抗体、Ul-Il 抗体、U1-12 抗体、U1-13 抗体、U1-14 抗体、U1-15抗体、U1-16抗体、U1-17抗体、U1-18抗体、U1-19抗体、U1-20抗体、U1-21抗体、U1-22抗体、U1-23抗体、U1-24抗体、U1-25抗体、U1-26抗体、U1-27抗体、U1-28抗体、U1-29抗体、U1-30 抗体、U1-31 抗体、U1-32 抗体、U1-33 抗体、U1-34 抗体、U1-35 抗体、U1-36 抗体、U1-37抗体、U1-38抗体、U1-39抗体、UI-40抗体、U1-41抗体、U1-42抗体、U1-43抗体、UI-44抗体、U1-45抗体、U1-46抗体、U1-47抗体、U1-48抗体、U1-49抗体、U1-50抗体、U1-51抗体、U1-52 抗体、U1-53 抗体、U1-55. I 抗体、U1-55 抗体、U1-57. I 抗体、U1-57 抗体、U1-58 抗体、U1-59抗体、U1-61. I抗体、U1-61抗体、U1-62抗体或者具有其中一种所述抗体的至少一条重链或轻链的抗体。特别优选的是U1-49抗体(SEQ ID NO :42/44)、U1-53抗体(SEQID NO 54/56)和U1-59抗体(SEQ ID NO 70/72)抗体或是具有其中一种所述抗体的至少一条重链或轻链的抗体。此外，本发明的另外实施方案提供了偶联上一个标记基团或是效应基团的分离的结合蛋白。优选的，这种结合蛋白对治疗过增殖性疾病有用，特别是肿瘤疾病，例如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、睾丸癌、软组织肉瘤、头颈部癌、其他表达或过表达HER-3的癌症以及肿瘤转移的形成。本发明的其他方面涉及编码本发明结合蛋白的分离的核酸分子、含有编码本发明结合蛋白的分离的核酸分子的载体和一种宿主细胞，例如用所述的核酸分子或载体转化CHO细胞和NS/0骨髓瘤细胞。本发明的另一方面涉及一种生产本发明结合蛋白的方法，该方法从分泌结合蛋白的宿主细胞来制备所述的结合蛋白。优选的，本发明的结合蛋白制备自分泌该结合蛋白的杂交瘤细胞株或是用编码本发明结合蛋白的核酸分子转化的CHO细胞或其他细胞类型。本发明的另一方面涉及一种生产本发明结合蛋白的方法，该方法从针对编码本发明结合蛋白的一种或多种核酸分子的转基因动物、转基因植物或真菌的组织、产物或分泌物来制备所述的结合蛋白。优选的，本发明的结合蛋白制备自转基因动物如奶牛、绵羊、兔、鸡或者其他哺乳动物或禽类的组织、产物或分泌物，转基因植物如玉米、烟草或其他植物，或者转基因真菌如曲霉、毕赤酵母或其他真菌种类。本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包括作为活性剂的本发明的至少一种结合蛋白与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合成的一种活性剂。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的药物组合物另外包括至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂。本发明的其他方面还涉及本发明的至少一种结合蛋白，任选的至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合在制备药物组合物的种的用途。这种药物组合物适用于诊断、预防或治疗一种过增殖性疾病，特别是肿瘤疾病，如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、或其他表达或过表达HER-3的癌症以及肿瘤转移形成。此外，本发明另一方面涉及诊断与HER-3表达相关的疾病或状况的一种方法，其中包括将含有至少一种本发明的结合蛋白与样品接触，并检测HER-3的存在。优选的疾病或状况包括上面提及的过增殖性疾病。本发明的另一方面是在有需要的患者身上预防或治疗与HER-3表达相关的疾病或状态的一种方法，其中包括对患者施用有效量的本发明的至少一种结合蛋白，和任选的至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂。优选的患者是哺乳动物患者，更优选的是人类患者。优选的HER-3表达相关的疾病或状况是上面提及的过增殖性疾病。本发明的另一个方面涉及诊断、预防或治疗与HER-3表达相关的疾病或状况的一种试剂盒，其中包括至少一个本发明的结合蛋白和/或核酸分子和/或载体。任选的是，本发明的试剂盒可进一步包含至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂。优选的，与HER-3表达相关的疾病或状况是上面提及的过增殖性疾病。详细说明本发明的首要方面涉及一种结合至HER-3的分离的结合蛋白。在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包括 重链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(⑶R)，该⑶R选自以下序列组成的群组(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230所示的CDRH2 ;以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230所示的CDRH3 ;和/或轻链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(⑶R)，该⑶R选自以下序列组成的群组(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRL2 ;及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的CDRL3。在本发明的另一个实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包括重链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和230 ;和/或一条轻链氨基酸序列，选自以下序列组成的群组SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本发明的另一个实施方案中，本发明分离的结合蛋白包括如下所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列
SEQ ID NOs :2 和 4、6 和 8、10 和 12、14 和 16、18 和 20、22 和 24、26 和 28、30 和 32、36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和
76,78和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90,92 和 94,96 和 98、100 和 102、104 和 106、108 和110、112 和 114、116 和 118、122 和 124,126 和 128、130 和 132、134 和 136，138 和 140、142 和144、146 和 148、150 和 152、154 和 156、158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188、190 和 192、194 和 196、198 和 200,202 和 204、206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ;或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重链氨基酸序列；或者SEQ ID NOs :58或64所示的轻链氨基酸序列。
根据本发明，应当理解的是本发明的结合蛋白的氨基酸并不仅限于20种常见氨基酸(见 Immunology-A Synthesis (第二版，E. S. Golub 和 D. R. Gren, Eds.，SinauerAssociates, Sunderland,Mass. (1991)),其通过引用被纳入本文)。例如，氨基酸分子可能包括20种常规氨基酸的立体异构体(如D-型氨基酸)、非天然氨基酸如a -，α -双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常见氨基酸。非常见氨基酸也可作为本发明结合蛋白的合适组分，其实例包括4_羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε -N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5_羟基赖氨酸、σ -N-甲基精氨酸和其他类似氨基酸基亚氨基酸，如4-羟基脯氨酸。此外，根据本发明，如果变异维持在SEQ ID NOs :1_232所示的氨基酸序列中的至少75%，较优选为至少80%、90%、95%，最优选为99%，那么SEQ ID NOs : 1-232所示的氨基酸序列中的少量变异预期也包含在本发明中。这些变异可能发生在框架区(也就是在互补决定区外)、互补决定区内、或者同时在框架区和互补决定区内。SEQ ID N0s:l-232所示的氨基酸序列中的优选变异，也就是删除、插入和/或替代至少一个氨基酸，发生在靠近功能结构域的边界。结构和功能结构域可以通过核酸和/或氨基酸数据与公共或专有序列数据库比对来鉴定。计算机比对方法可以用来判别序列基序或预测出现在其他已知结构和/或功能的结合蛋白的蛋白构象结构域。判别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参考 Bowie 等人的 Science 253,164 (1991) >Proteins, Structures and MolecularPrinciples (Creighton, Ed. , W. H. Freeman 和 Company, New York(1984))、Introductionto Protein StruGture(C. Branden 和 J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York,N. Y. (1991))、和Thornton等人的Nature 354，105 (1991)，其通过引用被纳入本文。因此，根据本发明，本领域技术人员能够识别序列基序和结构构象，它们可能用于定义结构和功能结构域。SEQ ID NOs :1_174和1-232所示的氨基酸序列中特别优选的变异是那些能够导致结合蛋白降低对蛋白水解或氧化敏感性、改变糖基化形式或者改变结合亲和力或者赋予或修饰其他物化或功能特性。尤其是，保守氨基酸的替代也是预期的。保守的替代是发生在与侧链相关的氨基酸的家族内。优选的氨基酸家族如下酸性家族=天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及无电荷极性氨基酸家族=甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。较优选的氨基酸家族是脂肪羟基家族=丝氨酸和苏氨酸；含酰胺家族=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及芳香族氨基酸=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理的预测，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸、冬氨酸用谷氨酸、苏氨酸用丝氨酸的单独的替代；或者一种氨基酸用一种结构相关的氨基酸的相似的替代不会对结合蛋白的结合或特性产生主要影响，特别是当替代不包括框架区位点的氨基酸。但是，所有其他所有可能的氨基酸替代也预期属于本发明。一种氨基酸的改变是否产生一种有功能的结合蛋白，也就是说，产生的结合蛋白能够与HER-3结合并降低HER家族成员的信号转导，可以很容易用酶联免疫吸附实验(ELISA)或FACS分析产生的蛋白结合HER-3的特异活性或者体内或体外功能分析来确定。根据本发明，本发明的结合蛋白至少与HER-3胞外部分的至少一个表位相互作用。这些表位优选定位于LI结构域(第19-184位氨基酸)，SI (第185-327位氨基酸)和S2结构域(第500-632位氨基酸)或L2结构域(第328-499位氨基酸)，或位于HER-3结构域的组合，其中LI结构域是氨基端结构域，SI和S2结构域是两个富含半胱氨酸的结构 域，它们位于L2结构域的两侧。这些表位也可定位于这些结构域的组合区域，但并不限于LI和SI部分组成的表位。此外，本发明的结合蛋白的进一步特征是其能结合于HER-3并降低了 HER-3介导的信号转导。根据本发明，HER-3介导的信号转导的降低可能，例如会由于HER-3的下调所致，从而导致至少HER-3分子从细胞表面的部分消失；或者由于HER-3基本上以一种非活性形式稳定在细胞表面，也就是与非稳定形式相比表现出较低信号转导的一种形式。或者，HER-3介导的信号转导的降低可能也是由于影响(例如降低或者抑制)了配体或HER家族的另一成员与HER-3的结合以及GRB2与HER-2或SHC的结合，其通过抑制受体酪氨酸磷酸化、AKT磷酸化、PYK2酪氨酸磷酸化或ERK2磷酸化，或者通过降低肿瘤的侵袭性来实现。或者，HER-3介导的信号转导的降低可能也是由于影响(例如降低或者抑制)了 HER-3与其他HER家族成员形成二聚体。其他实施例中的一个实施例可以是降低或抑制了 HER-3-EGFR蛋白复合物的形成。优选的，本发明的结合蛋白是一种支架蛋白，具有抗体样结合活性或是一种抗体，也就是抗HER-3的抗体。本发明文本中所使用的术语“支架蛋白”是指含有暴露的表面区域的一条多肽链或蛋白，其对氨基端插入、替代或缺失高度耐受。根据本发明可以使用的支架蛋白的实例是金黄色葡萄球菌的A蛋白、大菜粉蝶的胆素结合蛋白、或者其他Iipocalins、锚蛋白重复蛋白及人纤连蛋白(见综述Binz and Pliickthun, Curr Opin Biotechnol, 16,459-69)。支架蛋白的工程化可视为移植或整合亲和功能到稳定折叠蛋白的结构框架表面或内部。根据本发明，亲和功能是指蛋白结合亲和力。支架可以结构上独立于赋予结合特性的氨基酸序列。一般说来，显现出适合发展这种人工亲和试剂的蛋白可通过合理的、或最常见的、组合蛋白工程技术如针对HER-3筛选，采用纯化的蛋白或展示在细胞表面的蛋白，作为结合试剂用于人工支架库体外展示，这些技术是本领域熟知的(Skerra,J. Mol. Recog. , 2000 ；Binzand Pliickthun, 2005)。此外,具有抗体一样结合活性的支架蛋白可以来源于含有该支架结构域的受体多肽，其可以用受体多肽的结合结构域移植并赋予包含这种支架结构域的受体多肽具有供体多肽的结合特性。所述的插入结合域可以是，例如，抗体的互补决定区(CDR)，特别是抗HER-3抗体的CDR。插入可以是通过各种本领域抑制的方法实现，例如，多肽合成、编码氨基酸的核酸合成以及通过本领域技术人员熟知的各种重组方法。此外，本文中所使用术语“抗体”或“抗HER-3抗体”指一种单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人，Nature321 (1986), 522-525 ；Riechmann等人，Nature 332 (1988)，323-329 ；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992)，593-596)、嵌合抗体(Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 (1984)，6851-6855)、由至少两个抗体组成的多特异抗体(例如双特异抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包括上述提及的抗体的任意部分，优选的是它们的抗原结合或可变区。抗体片段的范例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、双抗体(Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 90 (1993), 6444-6448)、单链抗体分子(Plii ckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS,Springer Verlag, N. Y. (1994),269-315)和其他片段，只要表现出所需的结合HER-3能力。此外，本文中所使用术语“抗体”或“抗HER-3抗体”可以包含抗体样分子包括工程化抗体亚结构域或天然发生的抗体变异体。这些抗体样分子可以是单结构域抗体如单一的VH或VL结构域,其或者是天然来源如camel ids (Muyldermans等人,Reviews in MolecularBiotechnology 74, 277-302),或者通过人类、camelids或其他物种体外展示库获得(Holt 等人，Trends Biotechnol. ,21,484-90)。根据本发明，“Fv片段”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这一区域由一条重链或轻链通过紧密的非共价结合形成的二聚体组成。正是在这种构造中每个可变区的三个互补决定区相互作用确定了 Vh-'二聚体的表面抗原结合位点。总的说来，这六个互补决定区赋予了抗体的抗原结合特性。但是，即使单独一个可变结构域(或者包含仅三个抗原特异的互补决定区的半个Fv片段)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力要比完整结合位点低。“Fab片段”也包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CHl)。“Fab片段”不同于与“Fab'片段”，其在重链CHl结构域的羧基端添加了一些残基，包括来源于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“F(ab' )2”最初产生于一对“Fab'片段”，其中间含有铰链半胱氨酸。制备这些抗体片段的方法如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，都是本领域技术人员所熟知的。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的抗HER-3抗体是IgA-、IgD-, IgE-,IgG-或IgM-类型，优选的是IgG-或IgM-类型，包括(但不限于)IgGl-, IgG2_、IgG3_、IgG4-、IgMl-和IgM2类型。在最优选实施例中，抗体是IgGl-、IgG2_、或IgG4_类型。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明抗HER-3的抗体是针对HER-3胞外结构域伍⑶)产生的抗HER-3抗体。在某些方面，例如与作为治疗候选物的抗HER-3抗体的产生有关，理想的是本发明的抗HER-3抗体能够固定补体并参与补体依赖的细胞毒作用(CDC)。许多抗体同种型能够相同，包括(但不限于)下列鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgGl、人IgG3和人IgA。应当了解，产生的抗体最初不需要具有这种同种型，相反，产生的抗体可以具有任意同种型，这种抗体可以是转变的同种型，其通过在合适的表达载体中，用本领域熟悉的传统生物学技术，将分子克隆的V区域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定区基因或cDNA分子中，然后通过本领域熟知的技术在宿主细胞中表达该抗体。这种同种型转变的抗体也可具有Fe区域，其已经通过分子工程来实现具有比自然发生的变异体更好的补体依赖的细胞毒作用(Idusogie等，J Immunol. , 166, 2571-2575),并可通过本领域熟知的技术在宿主细胞中重组表达。这些技术包括直接重组技术的使用(见美国专利No. 4，81 (5，397)、细胞融合技术(见美国专利Nos. 5，916，771和6，207，418)等等。在细胞融合技术中，制备了具有任何想要的同种型重链的骨髓瘤或其他细胞株如CH0，制备了具有的轻链的其他骨髓瘤细胞或其他细胞株例如CH0。这些细胞然后可以被融合，表达完整抗体细胞株就可以被分离到。作为一个例子，一种人抗-HER-31gG4抗体，具有想要的结合于HER-3抗原的能力，可以通过简单的同种型转变来产生人IgM、人IgGl或IgG3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和一些亲和性)。这样的分子然后可能能够固定补体和参与补体依赖的细胞毒。此外，也比较理想的是，本发明的抗HER-3抗体能够结合于效应细胞(如单核细胞和自然杀伤细胞(NK))的Fe受体，并参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。有许多抗体的同种型能够有同样的功能，包括(但不限于)下列鼠源IgG2a、鼠源IgG2b、鼠源IgG3、人IgGl和人IgG3。应当了解的是，产生的抗体最初不需要具有这种同种型，相反，产生的抗体可以具有任意同种型，这种抗体可以是转变的同种型，其通过在合适的表达载体中，用本领域熟悉的传统生物学技术，将分子克隆的V区域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定区基因或cDNA分子中，然后通过本领域熟知的技术在宿主细胞中表达该抗体来实现。这种同种型转变的抗体也可具有Fe区域，其已经通过分子工程使具有比自然发生的变异体更好的抗体依赖的细胞毒作用(Shields等人，J Biol Chem.，276，6591-6604)，并可通过本领域熟知的技术在宿主细胞中重组表达。这些技术包括直接重组技术的使用(见美国专利No. 4，816，397)、细胞融合技术(见美国专利Nos. 5，916，771和6，207，418)等等。在细胞融合技术中，制备了具有任何想要的同种型重链的骨髓瘤或其他细胞株如CH0，制备了具有的轻链的其他骨髓瘤细胞或其他细胞株例如CH0。这些细胞然后可以被融合，表达完整抗体细胞株就可以被分离到。作为一个例子，一种人抗_HER-3IgG4抗体，具有想要的结合于HER-3抗原的能力，其可以通过简单的同种型转变来产生人IgGl或IgG3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和一些亲和性)。这样的分子然后可能能够与效应细胞的Fe Y R结合并能够参与抗体依赖的细胞毒作用。此外，根据本发明，应当了解的是，本发明的抗HER-3抗体是一种全人或人源化抗体。人类抗体避免了异种抗体(例如，具有鼠源或大鼠来源的可变区和/或恒定区的抗体)引起的某些问题。异种来源的蛋白如鼠源或大鼠来源的蛋白可导致患者针对抗体产生免疫应答，接着通过抗体中和以及/或严重的、甚至威胁生命的变态反应，导致抗体的快速清除、失去治疗效果。优选的，本发明的抗HER-3抗体选自以下抗体组成的群组Ul-I抗体、U1-2抗体、U1-3抗体、U1-4抗体、U1-5抗体、U1-6抗体、U1-7抗体、U1-8 抗体、U1-9 抗体、Ul-IO 抗体、Ul-Il 抗体、U1-12 抗体、U1-13 抗体、U1-14 抗体、U1-15抗体、U1-16抗体、U1-17抗体、U1-18抗体、U1-19抗体、U1-20抗体、U1-21抗体、U1-22抗体、U1-23抗体、U1-24抗体、U1-25抗体、U1-26抗体、U1-27抗体、U1-28抗体、U1-29抗体、U1-30 抗体、U1-31 抗体、U1-32 抗体、U1-33 抗体、U1-34 抗体、U1-35 抗体、U1-36 抗体、U1-37 抗体、U1-38抗体、U1-39抗体、UI-40抗体、U1-41抗体、U1-42抗体、U1-43抗体、UI-44抗体、U1-45抗体、U1-46抗体、U1-47抗体、U1-48抗体、U1-49抗体、U1-50抗体、U1-51抗体、U1-52 抗体、U1-53 抗体、U1-55. I 抗体、U1-55 抗体、U1-57. I 抗体、U1-57 抗体、U1-58 抗体、U1-59 抗体、U1-61. I 抗体、U1-61 抗体、U1-62 抗体。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白偶联上了一个标记基团。这种结合蛋白特别适合于诊断应用。本文中所使用的术语“标记基团”是指一种可检测的标记，例如放射性标记的氨基酸或生物素化部分，其可以通过标记的抗生物素蛋白来检测(例如结合上荧光标记的链霉亲和素或可使用光学或比色方法来检测的酶活性)。用来标记多肽或糖蛋白如抗体的本领域技术人员熟知的各种方法，可以用于完成本发明。适合的标记基团的实例包括(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素(如3!1、14(、151、355、9°Y、99Tc、mIn、125I、mI)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系无机发光材料)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β_半乳糖苷酶、荧光酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或者可由第二报告体识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链型配对序列、第二抗体的结合位置、金属结合结构域、表位标签)。在某些实施方案中，可能想到的是，标记基团是利用不同长度的间隔臂连接的，以降低潜在的空间位阻。可选的，在本发明的另一个优选方案中，本发明的结合蛋白可以偶联到一个效应基团上。这种结合蛋白特别适合于治疗应用。本文中所使用的术语“效应基团”系指细胞毒 基团如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗基团或本领域熟知的其他效应基团。合适的效应基团的实例是放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N，、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、mI)、加里刹霉素、海兔毒素类似物如auristatins、以及化疗试剂如geldanamycin和美登素衍生物，包括DM1。在某些实施方案中，可能想到的是，效应基团是利用不同长度的间隔臂连接的，以降低潜在的空间位阻。本发明的一个次要方面涉及制备本发明分离的结合蛋白的过程，包括从分泌本结合蛋白的宿主细胞中制备本结合蛋白的步骤。根据本发明，可使用的宿主细胞是杂交瘤细胞；真核细胞如哺乳动物细胞，例如仓鼠、兔、大鼠、猪、小鼠或其他动物细胞；植物细胞；真菌细胞，例如酿酒酵母、毕赤酵母；原核细胞如大肠杆菌；或者本领域熟知的其他细胞，用来生产结合蛋白。从宿主细胞中用于制备和分离结合蛋白(如支架蛋白或者抗体)的各种方法是本领域熟知的，可用来实施本发明。此外，用于制备结合蛋白片段(如支架蛋白片段或抗体片段)的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化、现代克隆技术、单链抗体分子的制备技术(参见 Pliickthun :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113,Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N. Y. (1994), 269-315)和双抗体(Hoilinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993)，6444-6448)，这些方法是本领域技术人员熟知的，可用来实施本发明。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白制备于分泌该结合蛋白的杂交瘤细胞。见 K0hler 等人的 Nature 256 (1975)，495.在本发明的一个较优选的实施方案中，本发明的结合蛋白通过重组制备，其中在宿主细胞中优化或/和放大表达结合蛋白、并从所述的细胞中分离该结合蛋白。为了这个目的，在合适的条件下宿主细胞用编码结合蛋白的DNA或含有编码结合蛋白DNA的载体转化或转染，以产生本发明的结合蛋白。参见如美国专利No. 4，816，567。优选的宿主细胞可以是CHO细胞、NS/0杂交瘤细胞、人胚肾293细胞、大肠杆菌和酿酒酵母。关于那些是抗体的结合蛋白，这些抗体可以从遗传工程化的动物产生全人抗体或者从噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌抗体展示库中制备。参见例如Clackson等人，Nature 352 (1991)，624-628，Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 (1991)，581-597，Feldhaus andSiegel J Immunol Methods. 290，69—80，Groves and Osbourn, Expert Opin Biol Ther.，5，125_135and Jostock and Dubel, Comb Chem High Throughput Screen. 8，127-133。人类抗体避免和具有鼠源或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的问题。存在这些鼠源或大鼠来源的蛋白会导致这些抗体被患者快速清除或导致患者针对这种抗体产生免疫反应。为了避免使用鼠源或大鼠来源的抗体，全人抗体可经由导入有功能的人类抗体座位到啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生，以使该啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生全人抗体。产生完整人类抗体的方法是通过使用XEN0M0USE 株小鼠，其已被工程化含有人类重链座位和K -轻链座位的245kb和190kb大小的种系构型片段。其他XenoMouse株小鼠含有人类重链座位和K -轻链座位的980kb和800kb大小的种系构型片段。还有 其他XenoMouse株小鼠含有人类重链座位和κ -轻链座位的980kb和800kb大小的种系构型片段加上740kb大小种系构型的完整的人类λ-轻链座位。见Mendez等人的NatureGenetics 15 146-156(1997)和 Green 和 Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483_495(1998)。XEN0M0USE 株小鼠可从 Abgenix，Inc. (Fremont, CA)获得。XEN0M0USE 小鼠的生产深入讨论和说明于下列美国专利申请序列号07/466，008，申请于 1990 年 I 月 12 日、07/610，515，申请于 1990 年 11 月 8 日、07/919，297，申请于1992年7月24日、07/922，649，申请于1992年7月30日、08/031，801，申请于1993年3月15日、08/112，848，申请于1993年8月27日、08/234，145，申请于1994年4月28日、08/376，279，申请于 1995 年 I 月 20 日,08/430, 938，申请于 1995 年 4 月 27 日,08/464, 584，申请于1995年6月5日、08/464，582，申请于1995年6月5日、08/463，191，申请于1995年6月5日、08/462，837，申请于1995年6月5日、08/486，853，申请于1995年6月5日、08/486，857，申请于 1995 年 6 月 5 日、08/486，859，申请于 1995 年 6 月 5 日、08/462，513，申请于1995年6月5日、08/724，752，申请于1996年10月2日、和08/759,620，申请于1996年12月3日；美国专利
发明者B·拉丁斯基, D·弗里曼, E·伯吉斯, M·特里德, M·罗瑟, S·哈特曼 申请人:U3制药有限公司, 安进公司