专利名称：检测小麦抗病基因的多重pcr试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦抗病基因的PCR试剂盒及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测小麦的Yrl7-Lr37-Sr38和Pchl基因的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。
背景技术：
目前,我国小麦生产中的主要病害包括小麦条锈病、白粉病、赤霉病、根腐病和全蚀病等。条锈病菌通常在冬季或早春侵入小麦植株，随着温度回升，条锈菌加速繁殖， 往往在小麦抽穗后造成条锈病大流行，由小麦条锈病菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的小麦条锈病可谓是全国小麦的第一大病害，大发生年份可以使感病品种大幅度减产甚至颗粒无收。小麦眼斑病又称莖裂病，是由真菌Pseudocercosporella herpotrichoides引起的，病部产生典型的眼状病斑，病斑初浅黄色，具褐色边缘，后中间变为黑色，病情严重时病斑常穿透叶鞘，扩展到茎杆上，严重时形成白穗或茎杆折断，该病在南、北美洲、欧洲、新西兰、澳大利亚以及非洲有大面积流行，使小麦大面积倒伏，造成减产， 目前，在我国也有部分流行危害。尽管通过化学药剂等措施可以有效防治条绣病及眼斑病的危害，但通过新抗源的筛选、鉴定和利用选育抗病品种仍是防治其最经济、有效、安全的手段，但必须缩短新毒性小种出现与抗病品种育成间的时差，并能将多个抗病基因聚合到同一品种中，这在以自然发病和人工诱发鉴定为基础的常规育种体系中很难实现；而分子标记辅助选择技术的日益成熟，为短时间内完成多基因聚合的实现提供了技术支撑，由于其不受小麦生长季节及发病条件的限制，可以随时在室内完成抗病基因的鉴定及选择，越来越受到育种家的重视。1967年，法国科学家Maia育成了具有偏凸山羊草(Aegilops ventricosa) 2NS 染色体片断(25 38cM)的普通小麦易位系VPMl ;该片段不仅含有抗条锈基因Yrl7、抗叶锈基因Lr37和抗杆锈基因Sr38，而且含有抗小麦根腐病的Pchl基因，这些优异基因已被世界各地的育种者广泛使用。2003年，Helguera等建立了一套在小麦育种计划中有效筛选抗性基因Yrl7-Lr37-Sr38聚积的PCR分析方法，包括以PCR为基础的标记、CAPS 和TaqMan系统，该显性标记与锈病抗性基因Yrl7、Lr37和Sr38完全连锁；Groenewald 等(Groenewald, J. Z. , A. S. Marais, and G. F. Marais, 2003 :Amplified fragmentlength polymorphism-derived micro-satellite sequence linked to the Pchl andEp—Dl loci in common wheat. Plant Breeding 122,83-85.)也开发出 Pchl 基因的相应 STS 分子标记 (XustSSR2001-7DL)，这些良好标记系统已在分子辅助育种(MAS)中发挥了重大作用；但其均为单独检测单个基因，对于同时检测Yrl7-Lr37-Sr38、Pchl基因却未曾报道。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的多重PCR引物对组、试剂盒，以及利用所述多重PCR引物对组鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的方法。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组，由特异于Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对，和特异于所述Pchl基因的一个引物对组成；所述特异于Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对为序列表中序列I和序列2所示的两条单链 DNA组成的引物对I ;所述特异于Pchl基因的一个引物对为序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。所述Yrl7-Lr37-Sr38基因簇同时含有Yrl7基因、Lr37 基因和Sr38基因。所述Pchl基因既可以以杂合形式存在，也可以以纯合形式存在。其中，序列I由20个核苷酸组成；序列2由27个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成。所述引物对组中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量(等摩尔)使用， 且所述引物对I和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为I : I。在本发明的一个实施例中，所述引物对I和所述引物对2中每条引物(共四条引物)在所述PCR反应体系中的终浓度均为O. 3mM。含有所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。所述试剂盒的制备方法属于本发明的保护范围。该制备方法包括如下步骤: 将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与2XTaq Plus PCRMasterMix溶液包装在同一试剂盒内。所述2 X Taq Plus PCR MasterMix 包含 Taq 酶、dNTPs 混合物、Tris-HCl, KCl 和 MgC12溶液。在本发明的一个实施例中，所述2XTaq Plus PCR MasterMix溶液具体为天根生化(北京)科技有限公司的产品2 X Taq Plus PCR MasterMix (含染料，蓝色)，其产品目录号为KT205-01。所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述抗病相关基因具体为Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因。鉴定或辅助鉴定待测小麦是否含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇，是否含有Pchl基因， 以及所述Pchl基因是纯合还是杂合的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括下述(I) 和⑵的步骤(I)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组进行PCR反应，获得PCR产物；在本发明的一个实施例中，所述PCR反应的退火温度具体为前8个循环为55°C ； 第9-16个循环为65°C ;第17-36个循环为55°C ;第37-56个循环为65°C。(2)检测步骤(I)得到的PCR产物的大小，根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇，是否含有或候选含有Pchl基因，以及所述Pchl基因是纯合还是杂合；其中，根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Yr 17-Lr37-Sr38 基因簇的方法如下若所述PCR产物满足如下al)的条件，则所述待测小麦含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇或候选含有Yrl7_Lr37_Sr38基因簇；若所述PCR产物不满足如下 al)的条件，则所述待测小麦不含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇或候选不含有Yrl7_Lr37_Sr38
基因族；根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Pchl基因的方法如下若所述PCR产物满足如下a2)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因；若所述PCR产物不满足如下a2)的条件，同时满足如下a3)的条件，则所述待测小麦不含有Pchl基因或候选不含有所述Pchl基因；根据PCR产物确定所述待测小麦所含所述Pchl基因是纯合还是杂合的方法如下 若所述PCR产物同时满足如下a2)和a3)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因，且所述Pchl基因为杂合或候选为杂合；若所述PCR产物满足如下a2)的条件，同时不满足如下a3)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因，且所述Pchl基因为纯合或候选为纯合； al)所述PCR产物含有259bp的DNA片段；a2)所述PCR产物含有240bp的DNA片段；a3)所述PCR产物含有222bp的DNA片段。在本发明的一个实施例中，所述PCR产物的大小具体通过6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。本发明所提供的引物对组，或本发明所提供的试剂盒在培育小麦抗病品种中的应用也属于本发明的保护范围。所述抗病为抗条锈病(Yrl7)、抗叶锈病(Lr37)、抗杆锈病 (Sr38)和抗根腐病(Pchl)中的至少一种。本发明的另一个目的是提供一种培育小麦抗病品种的方法。所述抗病为抗条锈病 (Yrl7)、抗叶锈病(Lr37)、抗杆锈病(Sr38)和抗根腐病(Pchl)中的至少一种。该方法包括采用满足如下a)和b)中至少一项的小麦作为亲本进行育种的步骤a)含有或候选含有Yrl7-Lr37_Sr38基因簇；b)含有或候选含有Pchl基因。从众多小麦品种中选择满足a)和b)至少一项的小麦的方法，即为上述鉴定或辅助鉴定待测小麦是否含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇，是否含有Pchl基因，以及所述Pchl基因是纯合还是杂合的方法。当所选择的小麦品种同时满足a)和b)两项，且Pchl基因为纯合(PCR产物含有大小为240bp的条带，同时不含有大小为222bp的条带)时，最适合作为育种亲本。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组的两个引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种的结果可靠、重复性好，成本低。本发明所提供的引物对组选用同样的退火温度，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别， 且特异性强，检测过程耗时短。同时，本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的引物对组在小麦的抗病育种中具有重要作用。
图I为检测Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因的各个对照的多重PCR扩增结果。 其中，泳道M为Pbr322DNA/MspI标准分子量；泳道I为阴性对照；泳道2为CKl ;泳道3为CK3 ;泳道4为CK2。图2为已知基因型小麦品种Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因的多重PCR检测结果。其中，泳道M为Pbr322 DNA/MspI标准分子量；泳道I为小麦品种兰考906 ;泳道2 为小麦品种VPMl ;泳道3为小麦品种Madsen ;泳道4为小麦品种济麦2462 ;泳道5为小麦品种 H-93-70。图3为未知基因型小麦品种Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因的多重PCR检测结果。其中，泳道M为Pbr322 DNA/MspI标准分子量；泳道I为小麦品种济麦2462-1-2 ;泳道2为小麦品种济麦2462-1-4 ;泳道3为小麦品种济麦2462-1-9 ;泳道4为小麦品种济麦
2463-1-5;泳道5为小麦品种济麦2463-1-6 ;泳道6为小麦品种济麦2463_2_2 ;泳道7为小麦品种济麦2464-1-1 ;泳道8为小麦品种济麦2464-1-2 ;泳道9为小麦品种济麦2464-1-6 ； 泳道10为小麦品种济麦2464-1-7 ;泳道11为小麦品种济麦2464-2-4 ;泳道12为小麦品种济麦 2464-3-7。图4为未知基因型小麦品种Pchl基因的单重PCR检测结果。其中，泳道M为Pbr322 DNA/MspI标准分子量；泳道I为空白泳道；泳道2为小麦品种济麦2462-1-2 ;泳道3为小麦品种济麦2463-1-5 ;泳道4为小麦品种济麦2462-1-4 ;泳道5为小麦品种济麦2462-1-9 ； 泳道6为小麦品种济麦2463-2-2 ;泳道7为小麦品种济麦2464-1-2 ;泳道8为小麦品种济麦2464-1-1 ;泳道9为小麦品种济麦2463-1-6 ;泳道10为小麦品种济麦2464+7 ;泳道 11为小麦品种济麦2464-1-6 ;泳道12为小麦品种济麦2464_2_4 ;泳道13为小麦品种济麦
2464-3-7。图5为未知基因型小麦品种Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的单重PCR检测结果。其中，泳道I为小麦品种济麦2462-1-2 ;泳道2为小麦品种济麦2462+4 ;泳道3为小麦品种济麦2464-1-1 ;泳道4为小麦品种济麦2462-1-9 ;泳道5为小麦品种济麦2463-1-5 ;泳道6为小麦品种济麦2463-1-6 ;泳道7为小麦品种济麦2464-1-7 ;泳道8为小麦品种济麦 2463-2-2 ;泳道9为小麦品种济麦2464-1-2 ;泳道10为小麦品种济麦2464-1-6 ;泳道11为小麦品种济麦2464-2-4 ;泳道12为小麦品种济麦2464_3_7 ；M为DL2000标准分子量。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、扩增小麦抗病相关基因的多重PCR试剂盒本发明所述的小麦抗病相关基因为Yrl7-Lr37_Sr38基因簇和Pchl基因。本发明所提供的用于扩增小麦抗病相关基因的多重PCR试剂盒由如下组分组成I) 2 X Taq Plus PCR MasterMix (Taq 酶、dNTPs 混合物、Tris-HCl、KCl 和 MgCl2 溶液)天根生化(北京)科技有限公司，2XTaq Plus PCRMasterMix (含染料，蓝色)产品目录号ΚΤ205-01ο2)Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的阳性对照品(CKl):含有所述Yrl7_Lr37_Sr38基因簇的小麦基因组DNA模板溶液；3) Pchl基因纯合体的对照品(CK2):含有所述Pchl基因的小麦基因组DNA模板溶液；
4)无PchI基因的对照品(CK3)无所述PchI基因的小麦基因组DNA模板溶液上述三个对照(CK1、CK2和CK3)均为进行抗病鉴定后的小麦单株的DNA溶液， 制备方法为取我们提供单株幼苗叶片，参照Devos等(Devos K M. The use of random amplified polymorphic DNA markers, Theoretical and Applied Genetics,1992,84 567 572)的SDS方法提取DNA，Tris-HCl溶解后，_20°C保存即可。5)多重PCR体系所用的引物混合物(各引物等摩尔混合，四条引物的浓度均为 2. 5mM)，各引物序列如下Yrl7-Lr37-Sr38F :5，-AGGGGCTACTGACCAAGGCT-3’(序列 I)；Yrl7-Lr37-Sr38R :5’ -TGCAGCTACAGCAGTATGTACACAAAA-3’(序列 2)；Pchl F :5’ -CATCGTGTGGCCAACTTGTT-3’(序列 3)；Pchl R :5’ -TTCCTCGTGTCTAGTGTCTC-3’(序列 4)；6) ddH20 ；7)Pbr322DNA/MspI标准分子量(天根生化(北京)科技有限公司，产品目录号 MD206-02)。实施例2、已知基因型小麦抗病相关基因的多重PCR扩增I、小麦基因组的制备采用SDS法对5份已知基因型的小麦品种进行基因组DNA的提取，得到对应于5份已知基因型的小麦品种的基因组DNA，作为小麦抗病相关基因多重PCR扩增的模板。其中， 5份已知基因型的小麦品种为VPM1、Madsen、兰考906、H-93-70和济麦2462。在如下三篇参考文献中，曾对上述小麦品种的Yrl7-Lr37-Sr38基因簇或Pchl基因的基因型进行了分子标记检测，结果详见表I :I) Santra. D. K. ,Watt. C, Little L. Comparison of a modified assay method for the endopeptidase marker Ep-Dlb the Sequence Tag Site marker XustSSR2001_7DL for strawbreaker foot rot resistance in wheat,Plant Breeding,2006,125 :13 18, 该文献公开了 VPMl、Madsen、H-93-70的Pchl基因的检测结果；2)Helguera M, Khan I. A, and Kolmer J. PCR assays for the Lr37-Yrl7-Sr38 cluster of rustresistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines, Crop Science, 2003,43 (5) : 1839 1847,该文献公开了 VPMl、Madsen 的Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的检测结果；3)李峰奇，韩德俊，魏国荣，曾庆东，康振生，2009，黄淮麦区小麦品种Lr37_Yr 17-Sr38基因簇的分子检测.西北农林科技大学学报(自然科学).2009. 3(37) : 151 158， 该文献公开了兰考906的Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的检测结果；表I已知基因型小麦品种抗病相关基因的基因型及PCR扩增条带大小
权利要求
1.用于鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的多重PCR引物对组，所述抗病相关基因为Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因，其特征在于所述多重PCR引物对组由特异于所述Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对，和特异于所述Pchl基因的一个引物对组成；所述特异于Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对I ;所述特异于Pchl基因的一个引物对为序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。
2.根据权利要求I所述的引物对组，其特征在于所述引物对组中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对I和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为1:1。
3.含有权利要求I或2所述引物对组的试剂盒。
4.权利要求I或2所述引物对组的制备方法，其特征在于所述制备方法包括将权利要求I或2所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
5.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤将权利要求I或2所述的引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与2XTaq Plus PCRMasterMix溶液包装在同一试剂盒内。
6.权利要求I或2所述引物对组在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦抗病相关基因的试剂盒中的应用；所述抗病相关基因为Yrl7-Lr37-Sr38基因簇和Pchl基因。
7.鉴定或辅助鉴定待测小麦是否含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇，是否含有Pchl基因，以及所述Pchl基因是纯合还是杂合的方法，其特征在于所述方法包括下述(I)和(2)的步骤(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求I或2所述引物对组进行PCR反应， 获得PCR产物；所述PCR反应的退火温度为前8个循环为55°C ;第9_16个循环为65°C ； 第17-36个循环为55°C ;第37-56个循环为65°C ；(2)检测步骤(I)得到的PCR产物的大小，根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇，是否含有或候选含有Pchl基因，以及所述Pchl基因是纯合还是杂合；其中，根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇的方法如下若所述PCR产物满足如下al)的条件，则所述待测小麦含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇或候选含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇；若所述PCR产物不满足如下al)的条件，则所述待测小麦不含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇或候选不含有Yrl7_Lr37_Sr38基因簇；根据PCR产物确定所述待测小麦是否含有或候选含有Pchl基因的方法如下若所述 PCR产物满足如下a2)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因； 若所述PCR产物不满足如下a2)的条件，同时满足如下a3)的条件，则所述待测小麦不含有 Pchl基因或候选不含有所述Pchl基因；根据PCR产物确定所述待测小麦所含所述Pchl基因是纯合还是杂合的方法如下若所述PCR产物同时满足如下a2)和a3)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因，且所述Pchl基因为杂合或候选为杂合；若所述PCR产物满足如下a2)的条件， 同时不满足如下a3)的条件，则所述待测小麦含有Pchl基因或候选含有所述Pchl基因，且所述Pchl基因为纯合或候选为纯合；al)所述PCR产物含有259bp的DNA片段； a2)所述PCR产物含有240bp的DNA片段； a3)所述PCR产物含有222bp的DNA片段。
8.权利要求I或2所述引物对组，或权利要求3所述试剂盒在培育小麦抗病品种中的应用。
9.一种培育小麦抗病品种的方法，包括采用通过权利要求7的方法鉴定得到的如下a) 或b)中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤a)含有或候选含有Yrl7-Lr37-Sr38基因簇；b)含有或候选含有Pchl基因。
10.根据权利要求6或8所述的应用，或权利要求9所述的方法，其特征在于所述抗病为抗条锈病、抗叶锈病、抗杆锈病和抗根腐病中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦抗病基因的PCR试剂盒及其应用。本发明所提供的PCR试剂盒中包含用于鉴定或辅助鉴定小麦抗病基因的多重PCR引物对组，该引物对组由特异于所述Yr17-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对，和特异于所述Pch1基因的一个引物对组成；所述特异于Yr17-Lr37-Sr38基因簇的一个引物对为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1；所述特异于Pch1基因的一个引物对为序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。本发明所提供的引物对组各引物对间不存在抑制和错配，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且结果可靠、重复性好，特异性强，成本低，耗时短，为小麦抗病品种选育提供参考依据。
文档编号C12Q1/68GK102605078SQ201210084088
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者刘建军, 刘爱峰, 宋健民, 曹新有, 李豪圣, 程敦公, 赵振东 申请人:山东省农业科学院作物研究所