专利名称：一种人mmp-14抗原、相应单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及ー种人MMP-14抗原、相应单克隆抗体及其应用。
背景技术：
细胞外基质(Extracellular matrix ECM)对维持细胞生长分化所需要的环境起着重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是ー个蛋白超家族,其依赖锌离子而发挥降解细胞外基质作用。在1962年Jerome Gross和Charles Lapiere在观察蝌抖尾巴脱变过程中发现有一种酶能降解胶原酶，所以他们就把这种酶命名为胶原酶也就是MMP-1。目前在脊椎动物共 发现24种不同的基质金属蛋白酶，其中23种在人体中存在。基质金属蛋白酶家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成前肽区，催化域，铰链区，类血红素结合蛋白区。(I)疏水信号肽序列，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活；(3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；(4)富含脯氨酸的铰链区；(5)羧基末端区，与酶的底物特异性有夫。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。其中MMP-14是与肿瘤侵袭关系最密切的酶，而且是在该蛋白酶家族中最具肿瘤特异性的蛋白。MMP-14也称膜型基质金属蛋白酶I (MT1-MMP)，不但高表达于肿瘤相关成纤维细胞上，还高表达于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞上，具有以下特点
(1)MMP-14在多种肿瘤组织中高表达如乳腺癌，小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管癌、头颈部肿瘤等，而在正常组织几乎不表达；
(2)MMP-14与肿瘤生长和转移密切相关MMP-14不仅可直接降解细胞外基质，而且可以通过切割MMP-2前体而激活MMP-2，活化的MMP-2是降解IV型胶原的主要酶，在肿瘤细胞的浸润转移灶的形成以及瘤组织内新生血管的形成中均起重要作用；
(3)MMP-14促进肿瘤血管新生MMP-14通过上调血管内皮生长因子VEGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF，以及通过与整合素aVi3 3共同发挥作用，促进肿瘤血管生成。(4)临床证实MMP-14与肿瘤的预后和转移相关如在乳腺癌患者中，MMP-14的表达水平越高，预后越差、肿瘤体积越大，淋巴结转移易常见。所以，以MMP-14作为肿瘤治疗的靶分子，也具有适用于大多数实体肿瘤的通用性。综上所述，由于MMP-14在多种肿瘤组织中高表达并与肿瘤生长和转移密切相关等原因，开展对MMP-14的体外检测对肿瘤的诊断及治疗具有重要意义，MMP-14的单克隆抗原及抗体的成功研制对实现MMP-14的快速、准确、特异性的检测具有决定性的作用。目前，尚未见相关MMP-14的单克隆抗原及抗体等的技术报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供ー种人MMP-14抗原、相应杂交瘤细胞株及其单克隆抗体和应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
ー种人MMP-14抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示(氨基酸序列简写为REVPYAYIREGHEKQA)。、一株杂交瘤细胞株92F11A，是由上述人MMP-14多肽制备得到的，于2011年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC No. 5080。上述杂交瘤细胞株92F11A的制备方法，步骤如下
(1)用人MMP-14抗原与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫小鼠；
(2)取免疫后小鼠的脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；
(3)融合细胞用ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株92F11A。ー种人MMP-14单克隆抗体，是由所述杂交瘤细胞株92F11A分泌所得的，能特异结合SEQ ID NO: I所示的抗原多肽，其抗体亚型为IgM型。上述人MMP-14单克隆抗体在制备人MMP-14特异性检测试剂中的应用，如可以用于ELISA、Western Blot、免疫组化、流式细胞术、免疫荧光检测等方法中。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明填补了人MMP-14检测技术的不足，提供ー种人MMP-14单克隆抗原和抗体，可以应用于人MMP-14特异性检测，明显降低MMP-14的检测成本，应用前景广阔。保藏信息杂交瘤细胞92F11A株，2011年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 5080。
图I.抗原表位设计分析结果图，第一组峰图是氨基酸亲水性预测，第二组有色坐标为氨基酸弾性序列预测，第三组峰图为抗原表位预测序列，第四组峰图是序列是否处于结构表面的预测结果，最下面圈住的序列为本发明设计的抗原多肽。图2. HPLC检测抗原多肽纯度结果示意图。图3.抗原多肽质谱检测结果示意图。图4.小鼠三次免疫后血清抗体浓度。图5. Western blot检测92F11A所分泌抗体的特异性。图6. 92F11A杂交瘤细胞分泌的抗体检测HT1080细胞中MMP-14的表达情况，左图为FITC荧光信号的检测情况，中图为DAPI细胞核染色，右图是前面两张图的合成。图7. 92F11A杂交瘤细胞分泌的抗体检测和MCF-7细胞中MMP-14的表达情況，左图为FITC荧光信号的检测情况，中图为DAPI细胞核染色，右图是前面两张图的合成。
图8. 92F11A所分泌抗体用流式细胞术检测HT1080细胞株MMP-14表达情況。图9. 92F11A所分泌抗体用流式细胞术检测MCF-7中MMP-14表达情況。
具体实施例方式实施例I抗原设计与合成
使用DNAStar软件里面的Protean组件对MMP-14进行抗原表位分析(GenBank:AAV40837. 1)，结果见附图1，其中第一组峰图是氨基酸亲水性预测，零坐标轴上方为亲水性序列，下方则为疏水性序列。第二组黑色坐标为氨基酸弾性序列预测。第三组峰图为抗原表位预测序列，零坐标轴上方为可能的抗原表位，下方则是非抗原表位。第四组峰图是预测序列是否处于结构表面，默认的坐标轴为1，位于坐标轴上方则是处于结构表面，坐标轴上方则不在结构表面。
附图I中黑色高亮部分是选取的氨基酸序列，如SEQ ID NO: I。从图上可以看到所选的氨基酸序列符合亲水性、具有弾性和处于结构表面等抗原设计的基本原则。SEQ ID NO: I的抗原合成使用常规化学方法或生物学方法。实施例2人MMP-14单克隆抗体的制备
(I)动物免疫
以多肽-血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin KLH)偶联作为抗原,免疫8周龄
雌性Balb/c小鼠(中山大学实验动物中心)，共免疫4次。第一次免疫，将实施例I制备的多肽抗原配制成200 Pg/mL的溶液,用等体积弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)充分将多肽抗原乳化，总量为lmL。在小鼠颈背皮下多点注射，O. 2mL/点。第二次和第三次免疫等量弗氏不完全佐剂乳化多肽抗原，第四次直接腹腔注射多肽抗原，毎次免疫间隔2周，第四次在融合前3天进行。(2)细胞融合
用未免疫的雌性Balb/c小鼠脾脏细胞作为饲养细胞。具体操作是在融合前一天，取一只实验用的5周龄的Balb/c雌性小鼠，颈椎脱臼致死，75%(V/V)酒精浸泡消毒5 min，移入超净工作台，镊子提起小鼠腹部表皮，无菌剪开腹部表皮，剪刀钝性剥离使腹膜充分暴露。用镊子取出脾脏，过细胞筛，去除红细胞。计数融合前一个星期左右复苏SP2/0细胞(骨髄瘤细胞购自中科院上海细胞库)，用添加了 2(^g/mL 8-氮鸟嘌呤的完全培养液进行扩大培养，防止HGPRT酶缺失回复突变。融合当天，用滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内。IOOOrpm离心5 IOmin,弃去上清。加入30mL不完全培养基,离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于IOmL不完全培养基，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加O. 4% (ff/W)台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液O. 5mL加入O. 5mL台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为每毫升细胞数=4个大方格细胞数 X104/4。取步骤(I)已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开右侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清培养液冲洗。将脾脏移入盛有2mL无血清培养液的平皿中，用灭菌剪刀将脾脏充分剪碎，置于200目不锈钢网上，用注射器内芯轻挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液，置于50mL离心管中，使用低渗透法去除红细胞，将单细胞悬液1500r/min离心5分钟,弃去上清液。加入2mL灭菌水,作用IOs左右，再加入2mL浓度为1.8%(W/V)生理盐水。1500r/min离心5分钟，弃去上清液。用无血清培养液离心洗涤3次，然后将细胞重悬于IOmL不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。将50%PEG(聚こニ醇)置于37°C水浴中预热，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量5:1混合，加入50mL离心管内，1500 rpm离心5min，弃上清，手掌轻击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；吸取预热的PEG溶液lmL，Imin内缓慢滴入，边滴边转动离心管，静止作用lmin，2min内滴入预热的基础培养基10mL，边滴边转动离心管，轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。1000 rpm离心5min，弃上清，用HAT选择培养液轻悬细胞沉淀，混合均匀，移液器分装到已铺有饲养细胞的细胞培养板中，每孔100 μ L，至37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。
(3)杂交瘤细胞株的筛选
将融合后的细胞第3天采用半换液方式更换HAT完全培养基，一周后融合细胞布满底部1/3左右开始用ELISA法筛选阳性克隆，以SP2/0细胞培养上清液作阴性对照，免疫小鼠阳性血清做阳性对照，两周后用HT完全培养基换出HAT完全培养基。用ELISA发筛选出阳性克隆细胞孔，具体做法是当检测孔的OD值大于阴性对照孔OD值的2. I倍时，将此空定义为阳性孔，并将此空细胞转移至新96孔板中，一周后观察细胞群，检测只有一个细胞群的孔，如为阳性孔，则再次重复上述操作2次，最后得到由单ー细胞形成的单克隆抗体细胞株，并命名为92F11A。实施例3小鼠免疫后血清抗体效价检测实验
取4只8周龄SPF级Balb/C雌性小鼠，在免疫前对所有小鼠进行断尾采血，置于室温
I 2h，待血清充分析出时离心分离血清，4°C保存备用作为阴性对照，以检测抗原免疫效果，当达到符合要求的效价后可做下一歩操作。另取4只8周龄雌性Balb/c小鼠，按实施例2中步骤(I)方法免疫，第三次免疫后第10天(d)再次采血，检测血清中抗体效价。用合成抗原(SEQ ID NO: I所示多肽)以lPg/mL包被Elisa板,4で过夜；第二天，弃去ELISA板中液体，多道移液器加入洗涤液200μ 7孔，室温下轻微摇动3min，弃洗涤液，吸水纸拍干，重复洗涤3次；加O. 1%明胶封闭液200μ 7孔，37°C封闭30min，洗涤3次，吸水纸拍干；阴、阳性血清用稀释液作 1:1000、1:2000,1:4000,1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释，加入相应孔中，IOOPL/孔，设空白对照，37°C温育60min，温育后洗涤液洗涤3次，吸水纸拍干；加入羊抗小鼠IgG-HRP (鼎国生物)(1:5000稀释￥八)，10(^17孔，37で温育60min，温育后洗涤液洗涤3次，吸水纸拍干；加底物溶液OPD (邻苯ニ胺)，ΙΟΟμΙ/孔，室温温育15min，2M H2SO4终止液终止反应，ΙΟΟμΙ/孔，Imin内在酶标仪上读取0D490nm吸光值。以阳性血清孔的OD值接近I. O, P/N>2. I的孔为阳性孔。图4显示了小鼠三次免疫后血清抗体浓度。实施例4单克隆抗体在western blot法检测MMP-14表达方面的应用实验
用三去污裂解液提取HT1080 (购于ATCC)细胞和MCF-7 (购于ATCC)细胞总蛋白，按每孔2(^g的蛋白量进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后加入92F11A的培养上清，室温孵育lh，洗涤，然后加入HRP标记抗鼠的ニ抗(购于鼎国生物)，室温孵育lh，洗涤，用化学发光法检测HT1080细胞中MMP-14的表达。具体实验检测结果见附图2和附图3所示。其中附图5是以92F11A杂交瘤细胞培养上清作为ー抗检测MMP-14的表达，第一泳道为MCF-7全细胞裂解液，第二泳道为HT1080全细胞裂解液。从附图5中可以看到所述92F11A细胞株所分泌的单克隆抗体可以检测到HT1080细胞中大小约为64kd的MMP-14特异性条带，而阴性对照MCF-7全胞没有条带。实施例5单克隆抗体在免疫荧光检测方面的应用实验
HT1080细胞和MCF-7细胞制备细胞爬片，取出玻片，PBS洗3次；4%多聚甲醛固定30min ；PBS洗3次；滴加正常山羊血清封闭I小时，甩去多余液体，滴加实施例2中92F11A细胞株所分泌的单克隆抗体，室温孵育I小时；PBS洗3次；加FITC标记羊抗小鼠ニ抗(购于英伟创津)，室温孵育I小时；PBS洗3次；滴加200 μ I DAPI，避光孵育5min，PBS洗3次各5 min;用甘油封片，在共聚焦显微镜下观察。实验结果见附图6 7所示。其中，附图6·和附图7是92F11A杂交瘤细胞培养上清分别检测HT1080和MCF-7细胞中MMP-14的表达情况，左图为FITC荧光信号的检测情况，中图为DAPI细胞核染色，右图是前面两张图的合成。实施例6流式细胞术检测抗体特异性
制备单细胞悬液使用HT1080和MCF-7细胞，于细胞对数生长期内，用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数后稀释分装于I. 5 mL EP管中每管细胞数约为106，HT1080和MCF-7细胞各分3管，分别标记为空白对照组、不加一抗对照组和加ー抗ニ抗对照组。加ー抗在加一抗ニ抗对照组中，按1:25加入92F1IA细胞株所分泌的单克隆抗体，于冰上孵育I h。然后用4000 rpm离心I min,去上清,加PBS轻轻重悬,重复3次。加荧光二抗在加ー抗ニ抗对照组和不加ー抗对照组中，按1:50加FITC羊抗小鼠IgM,于冰上避光孵育I h。然后用4000 rpm离心I min,去上清,加PBS轻轻重悬,重复3次后，姆管加O. 5 mL PBS使细胞重悬。上机检测。上机检测先检测MCF-7细胞组中空白对照，并以此确定流式细胞仪中FS和SS值，再检测MCF-7细胞组中不加ー抗对照，最后检测MCF-7细胞组中加ー抗ニ抗对照，同理，HT1080细胞组也按照相同的顺序进行检测。检测结果见图8和图9，检测结果表明HT1080细胞组中添加一抗ニ抗细胞群中FITC值明显升高，而对照组的值基本都相同，说明92F11A细胞株所分泌的单克隆抗体用于流式细胞实验，并且具备较高的特异性。
权利要求
1.ー种人MMP-14抗原，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.杂交瘤细胞株92F11A，其特征在于由权利要求I所述人MMP-14多肽制备得到，于.2011年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5080。
3.权利要求2所述杂交瘤细胞株92F11A的制备方法，其特征在于步骤如下 (1)权利要求I所述人MMP-14抗原与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫小鼠； (2)取免疫后小鼠的脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合； (3)融合细胞用ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株92F11A。
4.ー种人MMP-14单克隆抗体，其特征在于由权利要求2所述杂交瘤细胞株92F11A分泌所得。
5.权利要求4所述人MMP-14单克隆抗体在制备人MMP-14特异性检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人MMP-14抗原、相应单克隆抗体及其应用。本发明的人MMP-14抗原氨基酸序列为REVPYAYIREGHEKQA，用该抗原制备得到一株杂交瘤细胞株92F11A，保藏编号为CGMCCNo.5080，能分泌与人MMP-14抗原特异性结合的单克隆抗体，该人MMP-14单克隆抗体特异性好，灵敏度高，可用于制备人MMP-14特异性检测试剂，在Elisa、WesternBlot、免疫组化、流式细胞术和免疫荧光等检测方法中广泛使用。
文档编号C12N5/20GK102718840SQ20121008381
公开日2012年10月10日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者张革, 李翰, 杜军, 蔡绍晖 申请人:中山大学