专利名称：一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法
技术领域：
本发明属于螺旋藻开发应用的技术，特别涉及一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法。
背景技术：
螺旋藻(Spirulina)，是一种光合放氧、呈规则螺旋的原核丝状微藻，系蓝藻门(Cyanophyta)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)的一个属[武汉植物学研究，1997，15(4) =369-374]。因富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关注，并已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，成为目前全球研究开发规模最大，应用前景最广泛的经济微藻。值得指出的是，众多的实验研究与长期的生产实践表明，螺旋藻不同品种(系)，对温度、光质、光照强度，以及培养液的盐度、PH和营养成分等环境因子的要求与适应性存在显著差异，由此产生的经济效益也相差甚远[水生生物学报，1999,23(1) 59-64] 0所以，与其它农业与生物技术产业一样，选育品性兼优的品种(系)是有效提升当前螺旋藻产业经济效益、切实解决生产实际问题，最直接而重要的途径之一。目前国内外筛选适合大规模生产螺旋藻品种(系)的一般常规方法如下1、对新分离到的品种(系)进行编号；2、在实验室条件下作多种环境因子的交叉组合培养试验，并根据所测定的生长曲线、光合放氧、生化组成等指标作初步筛选；3、对实验室初筛到有生产养殖潜力的候选品种(系)在不同季节、气候及营养条件下进行养殖小试、中试与生产性试 验，再筛选出目标品种(系)。这一方法虽然实用、有效，但程序繁琐、工作量大、周期长、成本高。因此，迫切需要建立简单、快速、有效的评价与筛选方法，以满足当前国内外螺旋藻产业不断发展的实际需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、低成本有效的一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法。为解决技术问题，本发明的解决方案是提供一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法，是将候选品系的基因组DNA经特定引物HIPS-TC扩增，并在电泳分析后采用NTSYSpc2. I软件构建藻株间的聚类图；若候选品系具有1130bp、620bp、580bp和540bp的特异DNA电泳条带，且能与已知生产性状好的品系聚到一起，则候选品系生产性状好，适用于大规模培植生产；若候选品系具有1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的特异DNA电泳条带，且与已知生产性状差的品系聚到一起，则生产性状差，不适用于大规模培植生产；所述特定引物HIPS-TC 的序列为 5’ -GCGATCGCTC-3，(SEQ ID NO 1)；所述生产性状好的品系是:ZJU0103、ZJUO104,ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108,ZJUOl 15 和 ZJU0116 ;所述生产性状差的品系是ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13 和 ZJUOl14。
该方法具体包括下述步骤(I)选用14种螺旋藻品系作为对比样本，即ZJU0101、ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和ZJUO116 ；(2)试剂和仪器TaqDNA聚合酶和琼脂糖为上海生工生物工程公司产品；dNTP、DNA限制性内切酶、RNase A均为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为分析纯；序列扩增用美国Hybaid公司的Thermal Cycler PCR 仪;
(3) PCR 扩增将候选品系及14种对比样本的基因组DNA经特定引物HIPS-TC扩增；在25 ii L PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2. 5 y L，4种dNTP各I u mol/L,特定引物 HIPS-TC :5，-GCGATCGCTC-3，0. 5 u mol/L, I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因组 DNA，PCR 反应程序为 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s，30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin ；(4)电泳分析和观察将扩增产物在5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压8. 5V/cm。电泳结束后用银染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝胶成像系统Bio-Rad观察并照相，经过观察比对被筛选的螺旋藻品系用引物HIPS-TC扩增出条带的分子量；(5)聚类图的构建对上述候选品系及14种对比样本的电泳结果采用NTSYSpc2. I软件以非加权平均法进行分析和构建藻株间的聚类图，并根据聚类情况进行判断。本发明的有益效果是 本发明所建立的鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法与常规方法相比，不仅简单、快速、有效，而且成本低，并适合大规模、高通量筛选。
图I为14株螺旋藻品系中扩增条带的电泳图；其中M :标准分子量；CK :阴性对照；I 14 :分别对应 ZJUO10U ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107,ZJUO108、ZJUO109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115 和 ZJUO116。图2为14株用于构建生产性状鉴别标准的螺旋藻品系的聚类图。图3为被鉴别藻株ZJUOl 17和ZJUOl 18的电泳图；其中M :标准分子量；CK :阴性对照；1 ZJU0117 ；2 ZJU0118o图4为被鉴别藻株ZJU0117与ZJU0118在所建鉴别标准中的归类图。
具体实施例方式发明人在长期的螺旋藻分子遗传学研究中发现，螺旋藻与鱼腥藻和项圈藻等其它蓝藻一样，在基因组中都有一段因品种(系)而不尽相同的特殊的高度回文序列(highlyiterated palindromic sequence, HIPS) [Microbiology, 1998,144 :2791-2801]。本发明建立了一种以HIPS中特定序列HIPS-TC :5’ -GCGATCGCTC-3’为引物并结合PCR(聚合酶链反应)技术鉴别螺旋藻生产性状优良及能否应用于大规模养殖生产的新方法。我们以HIPS中特定序列HIPS-TC 5 ’ -GCGATCGCTC-3 ’为引物对14株螺旋藻ZJUO10 U ZJUO102, ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115和ZJUO116进行DNA多态性扩增，并经电泳与聚类分析发现，14 株品系可分为两大类ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和ZJUO116 为第 I 类；ZJUO101, ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113 和 ZJUO114为第II类。同时，从它们的电泳图谱上也可见这两类品系间DNA带的特异性，S卩1130b p、620bp、580bp 和 540bp 的 DNA 带为上述第 I 类品系所特有，而 1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的DNA条为第II类品系所特有。长期的科学研究与生产实践表明，上述第I类中的7株品系在实际生产养殖中表现优良，而第II类中的7株品系因适应能力差而不 宜用作工厂化生产养殖。由此可见，HIPS-TC对螺旋藻基因组DNA的特异性扩增条带与螺旋藻的生产性状间所存的上述显著相关性，可作为鉴别螺旋藻品系生产性状优劣的分子标记，即候选品系经引物HIPS-TC扩增的产物中，具1130bp、620bp、580bp和540bp的特异DNA电泳条带，能与聚上述第I类品系聚到一起，则生产性状好，适用于大规模培植生产；而具1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的特异DNA电泳条带，与上述第II类品系聚在一起，则生产性状差，不适用于大规模培植生产。本发明的详细技术方案可以通过以下步骤实施I、选用材料为公知的14株螺旋藻品系ZJU0101、ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104,ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15和ZJU0116，在浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存。其中，ZJUO103, ZJUO104, ZJU0105、ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 生产性状好，被广泛应用于大规模养殖生产；而 ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13和ZJUO114因生产性状差而不适用于工厂化生产。2、试剂和仪器Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液和琼脂糖为上海生工生物工程公司产品；dNTP、DNA限制性内切酶、RNase A均为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为分析纯。序列扩增用美国Hybaid 公司的 Thermal Cycler PCR 仪。3、PCR 扩增25 u L PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2. 5 y L，4种dNTP各I y mol/L,特定引物 HIPS-TC :5’ -GCGATCGCTC-3，0. 5 y mol/L，I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因组DNA，PCR 反应程序为 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s，30 个循环；最后 72°C延伸IOmin0所述4 种 dNTP 是指 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。4、电泳分析和观察将扩增产物在5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压8. 5V/cm。电泳结束后用银染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝胶成像系统Bio-Rad (USA)观察并照相，经过观察比对被筛选的螺旋藻品系用引物HIPS-TC扩增出条带的分子量。5、聚类图的构建对上述ZJU0101、ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15 和 ZJUO116 的电泳结果采用NTSYSpc2. I软件以非加权平均法(UPGMA)进行分析，并构建藻株间的聚类图。6、结果与分析HIPS-TC扩增特异性条带电泳分析ZJUO10U ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108,ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15 和 ZJUO116 的基因组 DNA 分别经特定引物HIPS-TC扩增，结果如图I所示。1130bp、620bp、580bp和540bp的DNA带仅出现在ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJU O108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 品系中，而 1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp 和 470bp 的 DNA 带仅出现在 ZJUO101、ZJUO102、ZJUO106、ZJUO109/RH, Z JUO110, ZJUO113和ZJU0114品系中，表现出显著的特异性。进一步将电泳结果采用NTSYSpc2. I软件以非加权平均法(UPGMA)进行分析，并构建藻株间的聚类图，结果如图2所示。14株品系正好被聚为两大类ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、ZJU0107、ZJU0108、ZJUOl 15 和 ZJUO116 为第 I 类，ZJUO101, ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113和ZJU0114聚为第II类，这与上述扩增DNA特异性差异条带的结果相吻合。长期的科学研究与生产实践表明，上述第I类中的7株品系在实际生产养殖中表现优良，而第II类中的7株品系因适应能力差而不宜用作工厂化生产养殖。由此可见，HIPS-TC对螺旋藻基因组DNA的特异性扩增条带与螺旋藻的生产性状间所存的上述显著相关性，可作为鉴别螺旋藻品系生产性状优劣的分子标记，即候选品系经引物HIPS-TC扩增的产物中，具1130bp、620bp、580bp和540bp的特异DNA电泳条带，能与聚上述第I类品系聚到一起，则生产性状好，适用于大规模培植生产；而具1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的特异DNA电泳条带，与上述第II类品系聚在一起，则生产性状差，不适用于大规模培植生产。作为实例，我们选取了 ZJUO117和ZJUO118这2株品系来验证本发明的实用性，其中，ZJU0117品系的生产性状好，被广泛应用于大规模养殖生产，而ZJU0118因生产性状差而不适用于工厂化生产。ZJUOl 17和ZJUO118基因组DNA分别经特定引物HIPS-TC扩增，如图 3 所示，ZJUOl 17 品系具 1130bp、620bp、580bp 和 540bp 的特异性 DNA 带，而 ZJUO118 品系具 1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp 和 470bp 的特异性 DNA 带。同时，利用 NTSYSpc2. I软件等分析表明，ZJU0117与生产性状好的第I类ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107,ZJUO108, ZJUOl 15和ZJU0116聚在一起；而ZJU0118与生产性状差的第II类ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113 和 ZJUO114 聚在一起(图 4)。该例子进一步说明，引物HIPS-TC扩增的特异性DNA带，可作为一种分子标记来鉴别螺旋藻生产性状优良，以筛选适用于大规模生产的螺旋藻品系。
权利要求
1.一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法，其特征在于，是将候选品系的基因组DNA经特定引物HIPS-TC扩增，并在电泳分析后采用NTSYSpc2. I软件构建藻株间的聚类图；若候选品系具有1130bp、620bp、580bp和540bp的特异DNA电泳条带，且能与已知生产性状好的品系聚到一起，则候选品系生产性状好，适用于大规模培植生产；若候选品系具有1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的特异DNA电泳条带，且与已知生产性状差的品系聚到一起，则生产性状差，不适用于大 规模培植生产； 所述特定引物HIPS-TC的序列为5’ -GCGATCGCTC-3’ ； 所述生产性状好的品系是ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15和 ZJU0116 ;所述生产性状差的品系是ZJU0101、ZJU0102、ZJU0106、ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl13 和 ZJUOl14。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，具体包括下述步骤 (1)选用14种螺旋藻品系作为对比样本，即ZJUO10UZJUO102, ZJUO103, ZJUO104,ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和ZJUO116 ； (2)试剂和仪器 TaqDNA聚合酶和琼脂糖为上海生工生物工程公司产品；dNTP、DNA限制性内切酶、RNase A均为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为分析纯；序列扩增用美国Hybaid公司的Thermal Cycler PCR 仪； (3)PCR扩增 将候选品系及14种对比样本的基因组DNA经特定引物HIPS-TC扩增； 在25iiL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2. 5iiL，4种dNTP各I y mol/L，特定引物 HIPS-TC :5’ -GCGATCGCTC-3，0. 5 y mol/L，I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因组DNA，PCR 反应程序为 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s，30 个循环；最后 72°C延伸IOmin ； (4)电泳分析和观察 将扩增产物在5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压8. 5V/cm ;电泳结束后用银染方法染色，再在凝胶成像系统Bio-Rad观察并照相，经过观察比对被筛选的螺旋藻品系用引物HIPS-TC扩增出条带的分子量； (5)聚类图的构建 对上述候选品系及14种对比样本的电泳结果采用NTSYSpc2. I软件以非加权平均法进行分析和构建藻株间的聚类图，并根据聚类情况进行判断。
全文摘要
本发明涉及螺旋藻开发应用技术，旨在提供一种鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法。该方法是将候选品系的基因组DNA经特定引物HIPS-TC扩增，并在电泳分析后采用NTSYSpc2.1软件构建藻株间的聚类图；若候选品系具有1130bp、620bp、580bp和540bp的特异DNA电泳条带，且能与已知生产性状好的品系聚到一起，则候选品系生产性状好，适用于大规模培植生产；若候选品系具有1190bp、780bp、700bp、570bp、520bp和470bp的特异DNA电泳条带，且与已知生产性状差的品系聚到一起，则生产性状差，不适用于大规模培植生产。本发明所建立的鉴别螺旋藻生产性状优良品系的方法与常规方法相比，不仅简单、快速、有效，而且成本低，并适合大规模、高通量筛选。
文档编号C12Q1/68GK102634576SQ201210083209
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者于金鑫, 刘新颖, 汪志平, 王景梅, 蓝瑾瑾, 邵斌, 陈子元 申请人:浙江大学