鉴定龟甲的pcr特异引物及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及一种能够特异鉴定龟甲的PCR 特异引物及其检测方法。主要用于龟甲药材、含有龟甲的制剂以及龟甲活体材料的快速鉴 定。
【背景技术】
[0002] 中药材龟甲为龟科动物乌龟Chinemysreevesii (Gray)的背甲及腹甲，具有滋阴 潜阳，益肾强骨，养血补心，固经止崩之功效。龟科动物种类众多，近年来由于需求量迅猛 增长，市场上出现了大量的龟甲混淆品，严重影响了龟甲的用药安全。传统鉴别龟甲的方 法包括性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。但是传统的 检测方法主要依赖于药材中的化学成分，而化学成分又易受品种及产地的影响。分子标记 技术已成功用于中药鉴定，线粒体DNA的Cyt b(中药材龟甲细胞色素 b特异性鉴定研究， 中国药学杂志，2012,4(3) :182-185)和细胞色素 C氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunitl，Col)，可以作为DNA标记鉴别龟甲（崔丽娜，杜鹤，孙佳明等，基于COI条形码 序列的龟甲及其混伪品的DNA分子鉴定[J].吉林中医药，2012,2)。刘中权等利用线粒体 12SrRNA基因片段序列建立了龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定方法（刘中权，王义权，周 开亚等，中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究，药学学报，1999,12 :941-945)，但 目前市场上出现了一些新的外来种。李明成等公开了一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法 (【申请号】201310178856. 3)，其仅包括5种伪品。
[0003] 本发明主要结合常规PCR和荧光检测方法，在较短时间内快速鉴定龟甲及其常见 伪品，成本低、适用性好。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所 提及的PCR引物及方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种龟甲的PCR特异性引物及其检测方法，该方法操作简单、样品 量少、能快速准确的鉴定龟甲药材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致 DNA含量极少、形态破碎的中药真伪的鉴定。
[0005] -种鉴定龟甲的特异引物F1、F2,其序列为：
[0006] Fl=Si -TTTGGAAACTGACTTGTACCTTTAACG-3;
[0007] F2:5， -GAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTAGA-3,。
[0008] -种龟甲的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
[0009] a)从所述材料中提取得到DNA样品；
[0010] b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95°C预变性5min后， 进行30次循环，循环参数为95°C 30s，55-65°C 45s，后延伸72°C 5min，获得扩增产物；
[0011] C)电泳所述扩增产物，如果存在分子量360bp的单一 DNA条带，则确定所检材料为 龟甲；
[0012] d)直接在所述扩增产物中加入2 μ L20 X SYBR Green I染料，振荡30s充分混匀， 于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为龟 甲。
[0013] 本发明采用荧光检测方法检测PCR扩增产物，不需电泳使得检测时间大大缩短， 且仅需简易紫外灯即可完成操作，不需要使用电泳设备和凝胶成像系统。
[0014] 综上所述，本发明提供了快速准确鉴定龟甲的PCR特异性引物及检测方法，以龟 甲DNA为模板，能将其从与其亲缘关系极近的其他的龟类中，高效、准确地鉴定出来，为龟 甲鉴定提供了一种实用的技术。
【附图说明】
[0015] 图1龟甲正伪品鉴别结果。M :100bp marker ;P :阳性对照；N :阴性对照；B :空白 对照；1-12 :龟甲；13 :马来龟；14 :拟鳄龟；15 :巴西龟；16 :缅甸陆龟；17 :平胸龟
[0016] 图2龟甲PCR产物荧光鉴定结果。1 :阳性对照；2 :中华草龟；3 :马来龟；4 :拟鳄 龟；5:巴西龟；6:阴性对照
【具体实施方式】
[0017] 1.高特异性引物的设计
[0018] 从GenBank查找正品乌龟及巴西龟、黄喉拟水龟、拟鳄龟、安南龟、缅甸陆龟伪品 的CO I序列。用BioEdit软件进行序列比较，找到差异片段，设计鉴别引物5' -TTTGGAAA CTGACTTGTACCTTTAACG-3,和 5，-GAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTAGA-3,。
[0019] 2.高特异性鉴别PCR方法的建立
[0020] 2. 1模板DNA提取
[0021] 取药材（详见表1)约50mg，置2. OmL离心管中，粉碎成粉末。取粉末20mg，分别 加入到2mL离心管中；使用柱式骨骼DNA提取试剂盒提取DNA :加入1000 μ L65°C预热的 提取缓冲液，30s充分混匀；65 °C水浴30min ;加入300 μ L缓冲液及200 μ L氯仿；充分混 匀，12000rpm下离心5min ;取500 μ L上清至一新的I. 5mL离心管，加入500 μ L上柱缓冲 液，充分混匀；加入DNA纯化柱中，12000rpm下离心Imin ;弃穿透液；加入洗脱液500 μ L， 12000rpm下离心Imin ;弃穿透液，加入洗脱液500 μ L，12000rpm下再离心Imin ;弃穿透液， 离心DNA纯化柱2min ;加入50 μ L无菌双蒸水，室温放置2min后12000rpm下离心Imin,取 穿透液稀释10倍用于PCR反应。另取龟甲对照药材约50mg，同法制成对照药材模板D NA 溶液。
[0022] 表1样品表
[0025] 2. 2PCR反应体系的建立
[0026] 在200 μ L离心管中进行PCR反应。反应总体积为25 μ L，包括10XPCR缓冲液 2.5 4 1^、(1^13(2.5臟〇1*卜1)14 1^、鉴另1」引物（1(^111〇1*卜1)各0.2 4 1^、丁&9〇隱聚合酶 (5U · L-1) 0. 2 μ L和模板1 μ L，用无菌双蒸水补足反应体积。将离心管置PCR仪，PCR反应 参数：95°C预变性5min，循环反应35次（95°C 30s，58°C 45s)，72°C延伸5min，4°C保温结束 反应。取5 μ L反应液经I. 5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，接通电源按5V ?cm-l恒压进行电 泳20min，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像（图1)。
[0027] 2. 3PCR产物检测及正伪品判读
[0028] 取PCR反应产物，加入2 μ L20 X SYBR Green I染料，于365nm紫外灯下检测PCR 产物，与空白对照相比，发出强烈绿色荧光为阳性（图2)。
【主权项】
1. 一种鉴定龟甲的特异引物F1、F2,其序列为： Fl :5' -TTTGGAAACTGACTTGTACCTTTAACG-3' F2：5/ -GAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTAGA-3/ 〇2. -种龟甲的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： a) 从所述材料中提取得到DNA样品； b) 用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95°C预变性5min后，进行 30次循环，循环参数为95°C 30s，55-65°C 45s，后延伸72°C 5min，获得扩增产物； c) 电泳所述扩增产物，如果存在分子量360bp的单一 DNA条带，则确定所检材料为龟 甲； d) 直接在所述扩增产物中加入2iiL20XSYBR Green I染料，振荡30s充分混匀，于 365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为龟甲。
【专利摘要】本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定龟甲的PCR特异引物及其检测方法。使用此方法鉴别龟甲的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、荧光检测即可完成对样品真伪的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于龟甲药材、含有龟甲的制剂以及龟甲活体材料的快速鉴定。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946729
【申请号】CN201410119005
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 蒋超, 李曼
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月28日