专利名称：一种纤维素和木聚糖双功能酶及其编码基因和应用的制作方法
一种纤维素和木聚糖双功能酶及其编码基因和应用本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种纤维素和木聚糖双功能酶及其编码基因和应用。纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分，纤维素大约占细胞干重的40-45%。纤维素类物质是地球上分布最广、含量最丰富的碳源物质，占植物界碳含量的50%以上。纤维素酶(cellulase)是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，分为内切-β -1，4-葡聚糖酶(endo-β -1,4-glucanase, EC3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,又称纤维二糖水解酶 cellobiohydrolase, EC3. 2. I. 91)和 β-葡 萄糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21) (Τ0ΜΜΕ P, WARRENRAJ, GIL KESN R. Cellulosehydrolysis bybacteria and fungi. Adv Microbiol Physiol, 1995, 37 :1-811)。木质素约占细胞干重的15-25%，是一种复杂酚类聚合物。半纤维素概念由Schulze (1891)首先提出，指可用碱溶液从植物材料中萃取得到的多糖类物质，约占细胞干重的30-35%。半纤维素由杂聚多糖组成，其中木聚糖是最具代表性的半纤维素，木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称。β -1,4-内切木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)作用于木聚糖主链，随机切开木聚糖内部的木糖苷键，将其分解为低聚糖。这两种酶在饲料、造纸、食品、洗漆及生物能源中应用广泛(Sipos B, BenkoZ,Dienes D, Reczey K, Viikari L, Siika-aho M(2010). Characterisation of specificactivities and hydrolytic properties of cel I-walI-degrading enzymesproduced by Trichoderma reesei Rut C30 on different carbon sources.AppI.Biochem. Biotechnol. 161(1-8) 161 :347-64. ；Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, HoondalGS.Microbial xylanases and their industrial applications a review.ApplMicrobiol Biotechnol. 2001,56 :326-338.)，这使得对纤维素酶及木聚糖酶的研究越来越受到人们的关注。纤维素酶是一种很好的饲料添加剂，将其加入到饲料中，可以促进饲料的降解，提高动物的消化利用率，进而提高畜牧业生产效益。木聚糖的抗营养性限制了许多谷物类饲料在畜牧业中的应用，作为饲料添加剂，木聚糖酶能够帮助动物降低肠道中的食糜粘度，消除木聚糖造成的抗营养作用，增加饲料的吸收利用率。反刍动物能高效利用纤维性食物，与其瘤胃中的微生物能分泌产生高效降解纤维素的纤维素酶是分不开的。山羊瘤胃是纤维素被剧烈降解的环境，研究表明，山羊瘤胃中的微生物数量大、种类多，形成一个十分复杂的微生物生态系统，其中以85%上是未培养微生物(Krause DO, Denman SE, Mackie RI, Morrison M, Rae AL, Attwood GT, McSweeneyCS.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen microbiology,ecology, ecology and genomics. FEMS Microbiology Review,2003,27(5) :663-693)。在这些未培养微生物中，含有着丰富的基因资源，这对于新型酶基因的发现提供有力的保障。目前，有许多学者已经从牛瘤胃中筛选出纤维素酶，如Bao Lei等(Lei Bao,Qiang Huang, Lei Chang, Jungang Zhou, Hong Lu. Screening and characterizationof a cellulase with endocellulase andexoceIlulase activity from yak rumenmetagenome. Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic. 73 (2011) 104-110)报道了从牦牛瘤胃微生物宏基因组文库中筛选出一个兼行外切、内切的纤维素酶基因Rucel5B ;郭鸿等(郭鸿，封毅，莫新春，段承杰，唐纪良，冯家勋。水牛瘤胃宏基因组的一个新的β -葡萄糖苷酶基因umCel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性)从水牛未培养微生物宏基因组文库筛选出8个克隆表达的β -葡萄糖苷酶。但是，双功能酶在瘤胃中的研究还是很少(除了 Chang Lei 等(Lei Chang,Mozhu Ding,Lei Bao, Yingzhi Chen, Jungang Zhou,HongLu. Characterization of a bifunctional xylanase/endoglucanase from yak rumenmicroorganisms. Appl Microbiol Biotechnol (2011)90 :1933-1942))。由于瘤胃中含有大量微生物，是纤维素等物质被降解的场所，但是这些分解纤维素类的微生物只有很少部分被培养。因此，构建山羊瘤胃微生物的宏基因组文库，能极大可能筛选到更好的新型酶。
本发明人基于对上述问题的研究提出并完成本发明。本发明的第一个目的是提供一种纤维素酶及木聚糖酶双功能基因cel28a。本发明的第二个目的是提供一种纤维素及木聚糖双功能酶CEL28A。本发明的第三个目的是提供一种重组质粒。本发明的第四个目的是提供一种转化体。本发明的第五个目的是提供上述纤维素及木聚糖双功能酶的制备方法。本发明的第六个目的是提供上述纤维素和木聚糖双功能酶在饲料工业上的应用。对于纤维素酶及木聚糖酶双功能基因，本发明采用的技术方案是，所述的纤维素木聚糖双功能酶基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，其长度为1596bp。对于纤维素木聚糖双功能酶，本发明采用的技术方案是，所述的纤维素木聚糖双功能酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，本发明的纤维素木聚糖双功能酶基因编码一个含有531个氨基酸的纤维素木聚糖酶，其中1-22个氨基酸间含有信号肽。对于一种重组质粒，其包括纤维素及木聚糖双功能酶基因cel28a。对于一种转化体，是经上述重组质粒转化寄主细胞而获得，宿主细胞为大肠杆菌。对于纤维素木聚糖双功能酶的制备方法，包括将上述的转化体，通过诱导蛋白表达、过Ni柱纯化从而获得重组纤维素、木聚糖双功能酶的步骤。对于纤维素和木聚糖双功能酶的应用，可将其作为一种饲料添加剂在饲料工业中得到应用。本发明纤维素木聚糖双功能酶基因来源于瘤胃未培养微生物；本发明纤维素木聚糖双功能酶在瘤胃环境中具有较好的稳定性。本发明提供了一个新的纤维素和木聚糖双功能酶，因其具有双功能性，耐热性，可作为一种饲料添加剂应用于饲料工业中。该酶作用于含β_1，4-葡萄糖键型的纤维素类物质(如羧甲基纤维素钠、微晶纤维素)及含β_1，4-木糖键型的非淀粉多糖(如燕麦木聚糖)可以生成还原性的糖，这样可以显著提高单胃动物对纤维素或者非淀粉多糖的消化吸收；还降低了食糜粘度，增加了有益菌的繁殖，促进了营养物质的释放，提高饲料利用率。因此该酶在饲料、食品等领域有着广阔的应用前景。本发明所发现的新型酶，通过进一步了解该酶降解纤维素和木质素的过程与机理，为以后对瘤胃微生物进行调控，对饲料进行改良以提高饲料利用率，从而开发出经济适用、安全高效的新型饲料提供理论依据，同时为其它动物饲料的开发提供有力借鉴。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I为山羊瘤胃微生物基因组文库阳性克隆的限制性内切酶Not I酶切分析图。 图2为阳性克隆的部分酶切图。图3为目的片段全DNA序列的PCR扩增结果。图4为重组质粒经Nde I和Xho I双酶切后电泳鉴定图。图5为重组质粒PCR鉴定图。图6为纤维素木聚糖双功能酶诱导与纯化图。图7为纤维素木聚糖双功能酶最适pH。图8为纤维素木聚糖双功能酶pH稳定性。图9为纤维素木聚糖双功能酶最适温度。
图10为纤维素木聚糖双功能酶温度的热稳定性。图11为不同化学试剂对纤维素木聚糖双功能酶的影响。以下实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI300和质粒 pIndigoBAC-5 (购自 Epicentre 公司);大肠杆菌(Escherichia coli)株系 DH5a和BL21 (DE3)(购自TransGen公司);克隆载体pUC19/Bam HI和限制性内切酶(购自Fermentas公司);表达载体pET28a(+)(购自Novengen公司);聚合酶(购自Takara公司)。一、纤维素酶编码基因的获得I)山羊瘤胃微生物宏基因组文库的构建采集安徽白山羊瘤胃液，分离微生物细胞，通过低熔点琼脂糖包埋裂解制备基因组DNA，获得的DNA利用Hind III进行部分酶切，回收50kb以上的DNA片段，并与BAC载体连接，构建山羊瘤胃微生物宏基因组文库(安娜，李吕木，许发芝，程建波.山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析.激光生物学报，19 =659-662,694)。2)从山羊瘤胃微生物宏基因组文库中筛选出表达纤维素酶活性的阳性克隆用96孔复制器将含有氯霉素的文库中克隆(每个平板384个克隆)复制到含I %竣甲基纤维素纳(carboxymethylcellulose sodium CMC)(购自 Sigma公司，目录号01888)的LA平板和含氯霉素(12. 5ug/ml)的LA平板上，将平板倒置于37°C培养箱培养24小时后，将长满菌落的含羧甲基纤维素钠的LA平板用0. 5%刚果红溶液染色15分钟，用IM的NaCl溶液脱色15分钟，然后检测菌落周围有无水解圈。出现水解圈的为阳性克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA，再次转化至E. coli EPI 300，重新涂布功能筛选平板，菌落周围再次出现水解圈，确定为纤维素酶基因阳性克隆。其中一个克隆水解能力最强，用限制酶NotI鉴定插入片段大小，并用O. 8%琼脂糖凝胶电泳分析，如图I所示，泳道I为23kbpADNA/Hind III Marker (片段大小从大到小为 23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp,564bp);泳道2为质粒经Not I酶切后有一条插入片段条带和一条质粒BAC条带；泳道3为阴性对照，不加质粒；泳道4为Ikb的marker (片段大小从大到小为IOOOObp,8000bp,7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)。图中表明该阳性克隆插入到PBAC质粒上的片段大小为23Kbp左右。为了有效测定质粒上纤维素酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对该基因进行缩小定位，使用限制性内切酶Sau3A I进行快速部分酶切，把酶切产物进行胶回收，然后与 PUC19/BamH I (购自 Fermentas 公司)质粒连接，使用 T4 DNA Iigase (购自 Fermentas公司)连接，连接产物转化E. coli DH5 α，在含有I %羧甲基纤维素钠的LA平板上筛选菌 落周围有水解圈的转化子，提取质粒并送至华大基因测序。图2为Sau3A I快速酶切电泳图，泳道 I Trans5k DNAMarker (片段大小从大到小为5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp,1000bp，800bp，500bp，300bp);泳道2为提取的质粒；泳道3酶切质粒Imin ;泳道4为酶切质粒2min。根据图中显示,确定酶切2min质粒被切范围小,适合做胶回收实验。 得到的序列用软件DNAStar (DNASTAR公司，版本7. 0)对序列进行拼接，并用ORF Finder 软件寻找开放式阅读框。利用 NCBI (National Center forBiotechnologyInformation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的 Blast 月艮务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行相似序列搜索。得到纤维素酶的编码基因，该基因具有序列表中序列I的DNA序列，命名为cel28a，该序列由1596个核苷酸组成。纤维素酶基因cel28a编码一个含531个氨基酸的蛋白质。用DNAStar软件预测蛋白质的理论分子量57，360. 20道尔顿，等电点pi为5. 13。用简单结构研究工具(Simple Modular ArchitectureResearchTool SMART, http://smart, embl-heidelberg. de/)分析纤维素酶的结构及Signal P3. 0 (http://www. cbs. dtu. dk/services/Signal P/)找出信号妝。通过 BLAST对目的片段进行分析比较，发现其与来自Bacteroidescellulosilyticus DSM 14838的hypothetical protein具有序列相似性51%和同源性65%,信号肽位置在第22位氨基酸处。二、在大肠杆菌中的表达I)扩增cel28a基因的PCR引物设计用vector NTI软件搜索酶切位点及primer permier 5. O软件设计引物扩增序列，正向引物Fl和反向引物Rl的5’端分别加上Nde I和Xho I酶切位点(Fl和Rl中带下划线)，预计PCR反应将特异性地扩增出大约为1596bp的DNA条带。扩增基因的PCR正向引物和反向引物分别为Fl :5’ GGAATTCCATATGATGTGTGGAGGAGATGACAGTTCAAG 3’Rl :5’ CCGCTCGAGCCATTTCGGTGCTTTGTTATATATTG 3’2) ce128a 基因的 PCR 扩增用含有目的基因pBAC质粒作为模板，以Fl和Rl为正反向引物作为PCR扩增反应。反应体系为模板5-30ng，lul正向引物(IOuM)，Iul反向引物(IOuM), dNTP 0. 25mM,5XFastPfu Buffer 10ul,FastPfu DNA polymerase :2. 5units(购自 TransGen 公司)，加水至50ul。PCR反应程序为第一阶段预变性95°C，2min ;第二阶段变性95°C，20sec，退火60°C，20sec ;延伸72°C，30sec，共35个循坏。第三阶段延伸，72°C，5min。PCR反应特异性扩增出一条为1596bpDNA条带。结果附图3，其中泳道I为Trans5k DNA Marker(片段大小从大到小为5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp, IOOObp, 800bp, 500bp, 300bp);泳道 2 为原质粒；泳道3为PCR反应特异性扩增出的一条1596bp的DNA条带。将PCR产物经Nde I和Xho I双酶切后，通过胶回收双酶切的PCR产物。图中显示，片段已扩增出。3)重组质粒的构建及鉴定将双酶切的PCR产物和相同双酶切后的载体pET28a(+)，用T4 Iigase连接酶16°C过夜连接，连接产物转化至BL21 (DE3)，提取重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定。图4是重 组质粒的酶切电泳图谱，泳道I为Ikb的marker (片段大小从大到小为IOOOObp,8000bp,7000bp,6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp);泳道 2-9 为重组质粒经Nde I 和Xho I双酶切后释放出一条5. 3kb的载体带和一条与PCR产物同样大小1596bp的外源插入片段的8个克隆。说明挑取的克隆中有假阳性的存在，从双重鉴定中挑选出四个插入片段最佳的做PCR鉴定实验。图5是质粒PCR电泳图，泳道I为Trans5k DNA Marker (片段大小从大到小为5000bp,3000bp,2000bp, 1500bp, lOOObp，800bp，500bp，300bp)，泳道 2-5 可以看到酶切正确的4个克隆均扩增出一条1596bp的DNA条带。结果显示片段已连接到载体上。4) ce 128a 基因在 E. coli BL21(DE3)中的表达、纯化重组质粒转化至BL21(DE3)中得到转化体，在37°C下200rpm培养3. 5小时，在0D600 为 O. 6 时加终浓度为 ImM 的 IPTG(isopropy- β -D-thiogalactoside) 16 °C 过夜诱导表达，培养液15000Xg，5min收集菌体。将菌体用20mM Tris-HClbuffer (pH 7. 9，含有 500mM NaCl、5mM imidazole)，冰上超声破碎。30，000 X g，4°C 离心 30min。将上清加到Ni-NTA(购自Novagen公司)亲和层析柱上。图6为转化体诱导表达图，泳道I为蛋白Marker (片段从到小为80kD、60kD、40kD、30kD、20kD、12kD);泳道2为空载体培养7小时图；泳道3为重组质粒培养7小时图；泳道4重组质粒诱导前蛋白图；泳道5为重组质粒诱导后图；泳道6为蛋白纯化图。结果表明，cel28a在大肠杆菌中得到了表达，菌体破碎后，发现蛋白为可溶性的，方便了酶学性质的分析。三、纤维素酶基因cel28a的活性和酶特异性底物分析I)纤维素酶活性测定用DNS法测定纤维素酶活将羧甲基纤维素钠用0. IM pH 5. 5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，取100 μ L稀释酶液加底物I %的羧甲基纤维素钠900 μ L，在50°C反应15min，加2mL DNS终止反应。对照则先加底物，反应结束后再加2mL DNS，最后加入100 μ L稀释酶液，沸水煮5min，冷却后于540nm波长下测其OD值，计算酶活。纤维素酶活性单位定义在一定条件下，每分钟催化CMC生成Iumol还原糖所需的酶量为I个活性单位(IU)。2)酶特异性底物分析将不同的底物用乙酸-乙酸钠(pH5. 0)缓冲液溶解溶度为I %，在酶反应最适pH和温度下，测定纤维素酶对不同底物的作用。结果表明(表I)，纤维素酶对CMC、燕麦木聚糖的活力分别为20. 56±1. 75U/mg、12. 11±2. llU/mg，对滤纸、微晶纤维素有轻微的降解能力。说明该酶不仅具有纤维素酶活性还具有木聚糖酶活性。表I
权利要求
1.一种纤维素和木聚糖双功能酶基因cel28a，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNO. I所示的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的纤维素木聚糖双功能酶CEL28A，其特征在于，具有序列表中的SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求I所述的纤维素和木聚糖双功能酶基因cel28a的重组质粒。
4.通过将权利要求3所述的重组质粒转化寄主细胞而获得的转化体。
5.如权利要求4所述的转化体，其特征在于寄主细胞为大肠杆菌。
6.一种纤维素和木聚糖双功能酶的制备方法，其特征在于包括培养权利要求5所述的转化体，通过诱导蛋白表达、过Ni柱纯化从而获得重组纤维素、木聚糖双功能酶的步骤。
7.如权利要求2所述的纤维素和木聚糖双功能酶在饲料工业中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素和木聚糖双功能酶及其编码基因和应用。cel28a具有SEQID NO.1所示的核苷酸序列或者同源序列，其中同源序列具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列51％的同源性。该基因全长1596bp，编码一个含531个氨基酸的纤维素、木聚糖双功能酶，以及一个含有22个氨基酸的信号肽。本发明的纤维素木聚糖双功能酶具有一定的耐热性，可作为一种饲料添加剂应用于饲料等行业中。
文档编号C12N15/63GK102634529SQ20121008466
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者姜海琴, 张子军, 张运海, 李吕木, 王力生, 程建波, 章孝荣, 范彩云, 蔡海莹 申请人:安徽农业大学