用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体的制作方法

用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包含至少一种具有提高的比生产率的异戊二烯合酶的方法和组合物。具体地讲，本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
【专利说明】用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求提交于2010年10月27日的美国临时专利申请N0.61/407，415的优先权，该专利申请的全文内容据此以引用的方式并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明提供了包含异戊二烯合酶变体的方法和组合物。具体地讲，本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
【背景技术】
[0004]类异戊二烯是应用于药品、营养药品、风味剂、芳香剂和橡胶制品的异戊二烯聚合物。然而，由于生态问题，天然类异戊二烯供给是有限的。因此，为了提供具有较少杂质和更大均匀度的类异戊二烯组合物，通常通过合成产生类异戊二烯，如橡胶。
[0005]异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)为不溶于水但可溶于醇的挥发性烃。商业可行量的异戊二烯可以通过从石油C5裂化馏分直接分离或通过C5异烷烃或异烯烃的脱水获得(ffeissermel and Arpe,Industrial Organic Chemistry,4thed.,ffiley-VCH,pp.117-122,2003 (ffeissermel 和 Arpe，《工业有机化学》，第 4 版，Wiley-VCH，第 177-122 页，2003 年))。C5也可以用更小的亚单元合成骨架。然而，期望的是具有不依赖于不可再生资源的商业上可行的产生异戊二烯的方法。
[0006]异戍二烯的生物合成生产通过两种不同的代谢途径进行(Julsing et al., ApplMicrobiol Biotechnol, 75:1377_1384，2007 (Julsing 等人，《应用微生物学和生物工程》，第75卷，第1377-1384页，2007年)).。在真核生物和古细菌中，异戊二烯通过甲羟戊酸(MVA)途径形成，而一些真细菌和高等植物通过甲基赤藓醇磷酸酯(MEP)途径产生异戊二烯。植物的异戊二烯排放依赖光照和温度，其增加与叶片发育有关。已在白杨树中鉴定出一种产异戍二烯的酶，即异戍二烯合酶(Silver and Fall,Plant Physiol,97:1588-1591,1991 ；and Silver and Fall, J Biol Chem，270:13010-13016,1995(Silver 和 Fall，《植物生理学》，第97卷，第1588-1591页，1991年；以及Silver和Fall，《生物化学杂志》，第270卷，第13010-13016页，1995年))并且据信这种酶负责整个叶片的异戊二烯体内生成。异戊二烯的细菌产生也有所描述(Kuzma et al.，Curr Microbiol, 30:97-103,1995 ；and Wilkins, Chemosphere, 32:1427-1434,1996 (Kuzma 等人，《当代微生物学》，第 30 卷,第97-103页，1995年；以及Wilkins，《光化层》，第32卷，第1427-1434页，1996年))，并且产生量随细菌生长阶段和培养基的营养成分而变化(授予FalI等人的美国专利N0.5，849，970 ；和 Wagner et al., J Bacteriol, 181:4700-4703,1999 (Wagner 等人,《细菌学杂志》,第 181卷，第4700-4703页，1999年))。然而，通过现有技术的细菌系统可获得的异戊二烯含量是不足以用于商业用途的。
[0007]因此，本领域需要用高效的、大规模异戊二烯生物生产过程来提供用于制备类异戊二烯的原料。[0008]本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物据此明确地以引用的方式并入本文。

【发明内容】

[0009]本发明提供了包含至少一种异戊二烯合酶多肽变体的组合物以及制备和使用此类变体的方法。变体包含针对亲代异戊二烯合酶多肽的一个或多个氨基酸残基置换，其中亲代异戊二烯合酶可以是野生型或非野生型序列。本发明提供了多肽内特定位置处的氨基酸残基置换，其中置换可以使至少一种性能比其亲代序列有所改善。在一些特别优选的实施例中，所述至少一种改善的性能选自但不限于:比生产率、产率、细胞性能指数、比活性、表达多肽变体的宿主细胞的生长、表达、稳定性和溶解度。具体地讲，本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
[0010]在一个方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在N-端区域、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相t匕，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中，N-端区域中的置换位于选自X2，X22，X36，X43，和X58的残基处。在一些实施例中，置换位于选自E2，S22，K36，R43，和E58的残基处。在一些实施例中，其中置换选自E2V，S22K，S22R，K36D，K36E，K36H，K36W，R43E，和E58F。在一些实施例中，隐埋区中的置换位于选自X71，X89, X118, X161, X228, X268, X282, X288, X331, X391, X392, X437, X460, X461, X481, X488,和X502的残基处。在一些实施例中，置换位于选自R71，F89，A118，K161，M228，V268，S282，S288, C331, A391, W392, C437, M460, R461, T481, E488，和 T502 的残基处。在一些实施例中，置换选自 R71I, F89D, F89E, A118E, A118P, K161C, M228Y, V268I, S282H, S282W, S288A,S288T, S288Y, C331P, A391G, W392C, W392F, W392M, W392S, W392V, W392Y, C437L, C437M,M460A, R461A, R461Y, T481Y, E488L, T502F 和 T502M。在一些实施例中，表面环中的置换位于选自X120, X151，X153，X254，X380，和X409的残基处。在一些实施例中，置换位于选自S120, L151，H254 ，S380，和V409的残基处。在一些实施例中，置换选自S120M, S120Q，L151F, L151Y, G153P, H254C, S380E，和V409T。在一些实施例中，二聚体界面中的置换位于X247处。在一些实施例中，其中置换位于V247处。在一些实施例中，置换为V247M。在一些实施例中，表面上的置换位于选自X348，X376，和X389的残基处。在一些实施例中，置换位于选自K348，L376，和G389的残基处。在一些实施例中，置换选自K348Y，和G389D。在一些实施例中，底物捕集环中的置换位于选自X443，X444，X447和X448的残基处。在一些实施例中，置换位于选自S444，I447和A448的残基处。在一些实施例中，置换选自S444S，I447T 和 A448V。
[0011]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4，X9，X243，X258, X259, X262, X266, X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446,X449，X450，X514，和X518，，并且其中多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X2, X22, X36, X43, X58, X71, X89, X118, X120, X151, X153, X161, X228, X234, X247, X254,X268, X282, X288, X331，X348，X376, X380, X389, X391, X392, X409, X437, X443, X444, X447,X448，X460, X461，X481，X488，和X502，，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:E2, S22, K36, R43, E58, R71, F89, A118, S120, L151, K161，M228，Q234, V247, H254, V268, S282, S288, C331，K348，L376, S380, G389, A391,W392, V409, C437,S444, I447，A448，M460，R461，T481，E488，和 T502。在一些实施例中，置换选自:E2V, S22K,S22R, K36D, K36E, K36H, K36W, R43E, E58F, R71I, F89D, F89E, A118E, A118P, S120M, S120Q,L151F, L151Y, G153P, K161C, M228Y, Q234R, V247I, V247L, V247M, H254C, V268I, S282H,S282W, S288A, S288T, S288Y, C331P, K348Y, S380E, G389D, A391G, W392C, W392F, W392M,W392S, W392V, W392Y, V409T, C437L, C437M, S444D, S444E, I447T, I447V, A448V, M460A,R461A, T481Y, E488L, T502F 和 T502M。
[0012]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4，X9，X243，X258, X259, X262, X266, X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446,X449，X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X134, X138, X143, X156, X159, X163, X166, X167, X170, X414, X421，和 X491，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相t匕，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中，置换位于选自K134，K138，L143，I156，E159，F163，S166，H167，E170，K414，和 Q421 的残基处。在一些实施例中，置换选自 K134P, K138C, L143F, L143V, I156G, E159G, E159Q, F163C, F163E, F163Q, F163V,F163Y, S166C, S166D, S166G, S166P, S166V, H167M, E170G, E170H, E170K, E170N, E170R,E170S, E170W, K414F, K414G, K414N, K414P，和 Q421R。
[0013]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4，X9，X243，X258, X259, X262, X266, X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446,X449，X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X29, X47, X86, X94, X131, X134, X156, X162, X169, X178, X179, X231, X242, X369, X414,和X421，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50 %。在一些实施例中，置换位于选自 E29, N47, S86, K94, E131, K134, 1156，V162, K169, K178, E179, S231, R242, F369,K414，和Q421的残基处。在一些实施例中，置换选自E29N，N47V，S86C，K94A，E131F，K134E，K134P, I156G, V162P, K169C, K178E, E179T, S231D, S231K, S231R, S231T, S231V, R242N,R242I, F369C, K414C, K414F, K414G, K414N，和 Q421D。
[0014]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对`应的残基编号的不易突变的残基:X4，X9，X243，X258, X259, X262, X266, X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446,X449，X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X30, X84, X134, X140, X143, X163, X166, X169, X170 和 X172,并且其中与 SEQ ID NO:I的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高，并且在类似的生长条件下，与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。在一些实施例中，置换位于选自 V84，K134，I140，L143，F163，S166，K169，E170 和 S172 的残基处。在一些实施例中，置换选自 V30K, V84T, K134C, K134D, K134E, I140S, I140T, L143F, L143I, L143M, L143V, F163I,F163M, S166P, S166V, K169Q, E170H, E170K，和 S172V。
[0015]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在以下位置包含一个或多个置换:(i)N-端，(ii)从残基134至179的N-端螺旋区，其中残基编号对应于SEQ ID NO:1(野生型MEA异戊二烯合酶)或(iii)N-端螺旋区外部与N-端螺旋区相互作用的其他残基处，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20 %的提高。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:X30, X84, X134, X140, X143, X163, X166, X169, X170 和 X172。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:V84, K134，1140，L143，F163，S166，K169，E170和S172。在一些实施例中，置换选自:V30K, V84T, K134C, K134D, K134E, I140S, I140T, L143F,L143I, L143M, L143V, F163I, F163M, S166P, S166V, K169Q, E170H, E170K，和 S172V。
[0016]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2，X22，X36，X43, X58, X71，X89, X118, X120, X151，X153，X161，X228，X234, X247, X254, X268, X282, X288,X331，X348，X376, X380, X389, X391，X392，X409, X437, X443, X444, X447, X448, X460, X461,X481，X488，和X502，，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中，置换位于选自E2，S22，K36, R43, E58, R71, F89, A118, S120, L151, K161, M228, Q234, V247, H254, V268, S282, S288,C331, K348, L376, S380, G389, A391,W392, V409, C437, S444, 1447，A448, M460, R461, T481,E488，和T502的残基处。在 一些实施例中，置换选自E2V，S22K，S22R，K36D，K36E，K36H，K36W, R43E, E58F, R71I, F89D, F89E, A118E, A118P, S120M, S120Q, L151F, L151Y, G153P,K161C, M228Y, Q234R, V247I, V247L, V247M, H254C, V268I, S282H, S282W, S288A, S288T,S288Y, C331P, K348Y, S380E, G389D, A391G, W392C, W392F, W392M, W392S, W392V, W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和 T502M。
[0017]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在N-端区域、N-端螺旋区、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少40%的提高。在一些实施例中，N-端区域中的置换位于选自下列的残基处:X18，X36jPX82。在一些实施例中，置换位于选自Y18，K36，和R82的残基处。在一些实施例中，置换选自:Y18E，Y18D，Y18S，Κ36Ρ，和R82Q。在一些实施例中，N-端螺旋区中的置换位于选自下列的残基处:Χ137，Χ143，Χ163，和Χ170。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:I137，L143，F163，和Ε170。在一些实施例中，置换选自:1137C，L143N，F163I，F163QJPE170G。在一些实施例中，表面环中的置换位于选自下列的残基处:X87，X409，和X542。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:G87，V409，和 F542。在一些实施例中，置换选自:G87S，G87N，G87R，V409S，和 F542N。在一些实施例中，表面中的置换位于残基X251处。在一些实施例中，置换位于残基T251处。在一些实施例中，置换为T251E。在一些实施例中，二聚体界面中的置换位于残基X242处。在一些实施例中，置换位于残基R242处。在一些实施例中，置换为R242T。在一些实施例中，隐埋区中的置换位于选自下列的残基处:X437, X460,和X461。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:C437，M460，和R461。在一些实施例中，置换选自:C437M，C437K，M460Q，M460G，M460A，R461D,R461S,R461T,和R461。在一些实施例中，底物捕集环中的置换位于选自下列的残基处:X443，X444，和X447。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:S444，和 1447。在一些实施例中，置换选自:S444P, I447Q, I447T, I447M, I447E, I447S,和 I447R。
[0018]在另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X134, X138，X143，X156，X159，X163，X166，X167，X170，X414，X421，和X491，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中，置换位于选自1(134，1(138，l143，11564159，f163，5166，l11674170，K414，和Q421的残基处。在一些实施例中，置换选自K134P, K138C，L143F，L143V，I156G,E159G, E159Q, F163C, F163E, F163Q, F163V, F163Y, S166C, S166D, S166G, S166P, S166V,H167M, E170G, E170H, E170K, E170N, E170R, E170S, E170W, K414F, K414G, K414N, K414P，和Q421R。
[0019]在另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X29，X47，X86，X94，X131，X134，X156，X162，X169，X178，X179，X231，X242，X369，X414，和X421，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中，置换位于选自E29，N47, S86，K94，E131，K134，1156，V162, K169, K178, E179, S231, R242, F369, K414，和 Q421 的残基处。在一些实施例中，置换选自 E29N, N47V, S86C, K94A, E131F, K134E, K134P, I156G, V162P, K169C, K178E, E179T,S231D, S231K, S231R, S231T, S231V, R242N, R242I, F369C, K414C, K414F, K414G, K414N，和Q421D。
[0020]在另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X50, X81，X134，X137，X143，X156，X159，X166，X167，X169，X170，和X414，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少30%。在一些实施例中，置换位于选自 K50，D81，K134，1137，L143，1156，E159，S166，H167，K169，E170，和K414的残基处。在一些实施例中，置换选自K50S，D81F，K134E，K134P，I137N，L143V, I156G, E159D, E159G, E159Q, S166C, S166W, H167M, H167N, K169C, E170H, E170K,E170W, K414C, K414F, K414G, K414N，和 K414P。
[0021]在另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30, X84，X134，X140, X143，X163，X166，X169，X170和X172，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20 %的提高，并且在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。在一些实施例中，置换位于选自V84, K134, 1140, L143, F163, S166,K169，E170和S172的残基处。在一些实施例中，置换选自:V30K，V84T，K134C，K134D，K134E，I140S, I140T, L143F, L143I, L143M, L143V, F163I, F163M, S166P, S166V, K169Q, E170H,E170K，和 S172V。
[0022]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X22，X71，X87, X162，X242，X288，X409，X414，X443，X444，X460，和 X502，其中所述残基编号对应于 SEQID NO:1，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少160%的提高。在一些实施例中，置换位于选自S22，R71，G87，V162，R242，S288，V409, K414，S444，M460，和T502的残基处。在一些实施例中，置换选自S22R，R71I 或 R, G87R, V162P, R242N, S288C, V409T, KX414F, S444D, M460A，和 T502M。在一些实施例中，置换选自:a)S22R, R71I, S288C, S444D, M460A，和 T502M ;b) G87R, V162P, R242N,S288C, V409T, K414R，和 S444D ;或 c)G87R, V162P, R242N, S288C, V409T,和 K414F。
[0023]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X47，X87，X156, X162, X170, X231, X242, X288, X409, X414，和 X447，其中所述残基编号对应于 SEQ IDNO:1，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高，并且在类似的生长条件下，与SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶相比，宿主细胞中表达所述多肽时生长量多至少30%。在一些实施例中，置换位于选自 N47, G87, 1156，V1 62, E170, S231, R242, S288, V409, K414，和 1447 的残基处。在一些实施例中，置换选自 N47V, G87R, I156G, V162P, E170H, S231T, R242N, S288C, S288T, V409T,和 K414F。在一些实施例中，置换选自 N47V, I156G，E170H，S231T，S288T，和 K414F。
[0024]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2，X18，X19，X21, X24, X26, X27, X29, X37, X42, X47, X48, X49, X56, X81, X82, X84, X93, X94, X95, X120,X123, X126, X131，X132，X134, X137, X139, X143, X151，X155，X166, X167, X169, X170, X171,X175, X179, X180, X197, X229, X231, X240, X242, X245, X246, X247, X251, X271，X282，X306,X317, X319, X369, X371，X376，X379, X380, X389, X392, X393, X408, X409, X421，X422，X423,X429, X437, X443, X444, X447, X455, X458, X461, X464, X466, X470, X473, X500, X502, X506,X513，X525和X531，并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PD大于或等于0.9的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI ;以及(b)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PD大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ IDNO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI ;以及(c)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。
[0025]在一些实施例中，置换位于选自E2，Y18，L19，S21，T24，E26，S27，E29，K37，V42,N47, N48, E49, L56, D81, R82, V84, T93, K94, T95, S120, K123, N126, E131，N132，K134, 1137，A139, L143, L151, N155, S166, H167, K169, E170, L171, K175, E179, L180, Q197, 1229，S231,T240, R242, R245, R246, V247, T251, A271, S282, L306, D317, N319, F369, Q371, L376, K379,S380, G389, W392, K393, V408, V409, Q421，K422，Y423, R429, C437, S444, 1447，S455, C458,R461，G464，S466, A470, S473, V500, T502, L506, T513, E525 和 V531 的残基处。在一些实施例中，置换选自 E2A 或 K 或 P、Y18D 或 E 或 K 或 S、L19Y、S21W、T24L 或 V、E26C、S27D 或 N、E29N、K37C 或 D 或 P 或 Q 或 S、V42M、N47D 或 S、N48D 或 G 或 T、E49L 或 V、L56E 或 F 或 G 或I 或 K 或 T 或 V 或 Y、D81Q、R82N 或 T 或 V 或 Y、V84M、T93C 或 F 或 R 或 S、K94G 或 P、T%D 或F或G或I或N或W、S120C或G或M或Q、K123V、N126E、E131H或K或L或M或T或W或Y、N132I 或 P、K134A、I137T、A139C 或 Q、L143C 或 D 或 E 或 H 或 K 或 M 或 Q 或 T 或 V 或 Y、L151A 或 F、N155A 或 C 或 G 或 H 或 Q 或 R 或 S 或 W、S166N、H167F 或 I 或 N 或 Q 或 V、K169A或C或H或N或Q或V、E170L或S或W或Y、L171A或N或Q或T或V或Y、K175C或F或I或 Q 或 R、E179D、L180A 或 1、Q197C 或 D 或 N、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C 或 K 或 M 或Q 或 T 或 V、R246N、V247L 或 M、T251D 或 E 或 N 或 P 或 Q 或 S、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C 或 D 或 E 或 G 或 S、Q371F、L376I 或 M、K379G 或 Q、S380E、G389A 或 D 或 E 或K 或 N 或 Q 或 S 或 V、W392Y、K393C 或 I 或 T 或 V、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N 或 S、R429E 或 F 或 Q、C437M、S444D 或 E、I447T、S455A、C458T、R461A, G464C 或 M 或 N 或 Q 或 S、S466D、A470I 或 L、S4731、V500A 或 C、T502M, L506M, T513C 或 G 或 K 或 N、E525F 或 R、V531E或H或K或Q或R或S。
[0026]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2，X6，X18，X20, X22, X23, X24, X25 , X26, X27, X28, X29, X30, X31, X32, X36, X37, X42, X44, X47, X48,X49, X50, X53, X54, X55, X56, X58, X59, X68, X71, X74, X77, X78, X79, X81, X82, X83, X84,X86, X87, X91, X93, X94, X95, X97, X98, X99, X109, X115, X116, X117, X118, X120, X123,X125, X126, X127, X128, X130, X131, X132, X133, X134, X136, X137, X138, X139, X140, X143,X151, X153, X155, X156, X159, X160, X161，X162，X163, X164, X166, X167, X169, X170, X171,X172, X175, X176, X177, X178, X179, X180, X181, X182, X190, X194, X197, X204, X211, X215,X217, X219, X221, X228, X229, X231，X232，X235, X241, X242, X245, X246, X247, X251，X254，X271，X272，X278, X279, X282, X296, X302, X317, X319, X320, X327, X331，X348，X351，X357，X361，X364，X365, X368, X369, X370, X371，X373，X377, X380, X383, X386, X389, X392, X393,X407, X408, X409, X410, X411, X414, X422, X423, X424, X428, X429, X432, X436, X437, X440,X443, X444, X447, X448, X457, X460, X461, X462, X463, X464, X465, X466, X468, X470, X471,X472, X473, X475, X480, X490, X491, X492, X494, X496, X500, X501，X502，X503, X510, X513,X515, X519, X525, X531，X536，X537, X540, X541，X542，和 X544,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI，并且其中相对于SEQ IDNO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI ;以及(b)相对于SEQID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ IDNO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI。在一些实施例中，其中置换位于选自 E2, S6, Y18, L20, S22, D23, T24, D25, E26, S27, 128，E29, Y31, K32, K36, K37, V42,R44, N47, N48, E49, K50, F53, L54, T55, L56, E58, L59, L68, R71, S74, R77, G78, A79, D81,R82, F83, V84, S86, G87, A91, T93, K94, T95, L97, H98, G99, Q109, S115, Q116, E117, A118,S120, K123, Q125, N126, G127, N128, L130, E131, N132, L133, K134, D136, 1137，K138, A139,1140，L143, L151, N155, 1156，E159, A160, K161, V162, F163, A164, S166, H167, K169, E170,L171, S172, K175, 1176，G177, K178, E179, L180, A181，E182，L190, R194, Q197, S204, K211,N215, V217, L219, L221，M228，1229，S231, V232, R235, S241, R242, R245, R246, V247, T251,H254, A271，F272，D278, C279, S282, 1296，T302, D317, N319, A320, Y327, C331, K348, G351,Y357, A361, D364, L365, A368, F369, L370, Q371, A373, Y377, S380, T383, D386, G389, W392,K393, A407, V408, V409, Q410, N411, K414, K422, Y423, H424, S428, R429, H432, L436, C437,L440, S444, 1447，A448, S457, M460, R461, T462, K463, G464, 1465，S466, E468, A470, T471,E472, S473, M475, E480, L490, G492, L494, A496, V500, E501, T502, A503, S510, T513, H515,A519, E525, V531, T536, E537, L540, P541, F542，和 R544 的残基处。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:E2C或D或N或T或V，S6N或T，Y18A或Q或R，L20T, S22Q，D23N，T24C，D25T，E26D或H或K或M或R或S或V，S27A或C或G或H或I或L或M或P或Q，I28D 或 N，E29Q, V30A 或 D 或 E 或 M 或 R 或 T，Y31N，K32E, K36A 或 C 或 D 或 E 或 M 或 N 或P或Q，K37A或E或G或H或M或N或R或T，V42F或I，R44N或Q，N47A或G或H或M或Q或T或W，N48H或I或K，E49A或C，K50A或D或E或F或H或S或Y，F53E或H或N或P或 Q 或 V，L54M, T55C 或 D 或 E，L56C 或 N，E58N, L59H 或 T，L68I, R71K 或 M，S74D 或 E 或 N或Y，R77L, G78A或D或F或L或M，A79Q或T，D81A或F或G或M或R或S或T或V，R82A或 E 或 H 或 I 或 K 或 M 或 Q 或 S，F83W, V84A, S86A 或 D 或 M，G87D 或 P，A91K 或 W，T93A 或D或E或G或L或N或P或Y，K94A或D或E或H或I或L或M或N或R或S或T，T95A或E或P或Q或S或V或Y，L97F，H98A或D或F或G或I或L或M或N或Q，G99E或F或M，Q109E, S115A，Q116A 或 C 或 D 或 E 或 I 或 P，E117C 或 F 或 L 或 M 或 V，A118M，S120H 或 T 或V, K123L 或 T，Q125E 或 I 或 Y，N126A 或 C 或 D 或 M 或 T 或 V，G127C, N128C 或 D 或 P 或 Q，L130E, E131A 或 C 或 P 或 Q 或` S 或 V，N132C 或 D 或 F 或 H 或 L 或 R 或 W 或 Y，L133D, K134E或 M 或 Q 或 S 或 T 或 V，D13`6E，I137E 或 H 或 N，K138I 或 N, A139N, I140M 或 ff, L143S, L151C或 H 或 I，G153C，N155I 或 T 或 V 或 Y，I156D 或 N 或 T，E159M, A160I，K161A 或 C 或 N 或 Q，V162S，F163E 或 Q，A164T，S166A 或D 或G，H167A 或E 或G 或K 或M或 R或 S 或 T 或W，K169D或I或M或S或T，E170H或K或M或Q或T或V，L171H或K或R或S，S172A或C，K175S，I176M，G177A 或 C，K178A 或 F 或 R 或 S 或 T，E179A 或 C 或 L 或M 或 N，L180C 或 Q 或 T，A181H或 Q 或 S 或 V，E182S, L190I 或 M, R194L, Q197S, S204C, K211A 或 N 或 Q，N215C 或 H, V217I,L219C, L221M, M228F 或 Y, I229V, S231K 或 Q 或 T，V232I, R235K, S241A 或 M 或 T，R242A 或D或E或H或I或M或N或Q或S或T，R245I或L，R246D或K，V247T, T251A或G或K或R, H254D, A271C 或 V，F272D 或 G 或 P 或 W，D278A 或 E 或 N 或 Q 或 S 或 T 或 V 或 W，C279A,S282A 或 Q, I296V, T302H, D317E 或 Q, N319F, A320C, Y327M, C331P, K348R 或 Y, G351D 或 N,Y357M, A361T, D364E 或 V, L365C 或 Μ, A368N, F369M 或 N 或 R 或 T 或 V，L370G 或 Q, Q371C或 S，A373G, Y377W, S380A 或 C 或 D 或 Q 或 T 或 V，T383S, D386E 或 N，G389H 或 I，W392I 或S 或 T 或 V，K393Q, A407G, V408I, V409H 或 I，Q410C 或 D 或 K 或 L 或 M 或 T，N411G，K414E或 G 或 L 或 N 或 P，K422A 或 N 或 T，Y423Q, H424E 或 P 或 Q 或 V，S428E 或 Q，R429I 或 L 或T 或 W 或 Y，H432E, L436M 或 Y, C437K 或 T, L440I, S444P, I447A 或 E 或 M 或 Q 或 S，A448E或M或N或P或Q或V，S457N或T，M460Q或R或S，R461D或E或G或Q或S或T，T462Q，K463A 或 D 或 E，G464L 或 R，I465A 或 C 或 G 或 S 或 T，S466P, E468D, A470M, T471E 或 H 或Q, E472D 或 S，S473L 或 V, M475T, E480N, L490A 或 D 或 E 或 F 或 H 或 M，G492C, L494D，A496P或 T, V500L 或 M, E501D, T502A 或 C 或 R 或 V，A503I, S510C 或 V, T513V, H515N, A519S 或 T,E525A 或 C 或 P 或 Q 或 S，V531A 或 M 或 T，T536A 或 F 或 G，E537K 或 T，L540A 或 P，P541M,F542P，和 R544C。
[0027]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2，X3，X13，X17, X18, X19, X20, X23, X25, X26, X27, X28, X29, X30, X31, X32, X33, X34, X36, X37, X40,X41, X42, X43, X44, X45, X46, X47, X48, X49, X50, X51, X53, X54, X55, X56, X57, X59, X60,X62, X71, X73, X74, X75, X77, X78, X79, X81, X82, X83, X84, X85, X86, X87, X88, X89, X91,X92, X93, X94, X95, X97, X98, X99, X100, X101, X102, X103, X107, X109, XIII，X113, X114,X115, X116, X117, X118, X119, X120, X121, X123, X124, X125, X127, X128, X129, X130, X131,X133, X134, X135, X136, X137, X138, X139, X140, X143, X146, X151，X152，X153, X155, X156,X158, X160, X161, X162, X163, X166, X167, X169, X170, X171，X172，X175, X176, X177, X178,X179, X180, X181, X182, X183, X185, X187, X193, X194, X196, X197, X204, X210, X211，X212，X215, X216, X217, X218, X219, X220, X222, X223, X224, X226, X228, X229, X231, X232, X235,X240, X241, X242, X246, X251，X253，X260, X268, X270, X271, X272, X275, X276, X278, X282,X307, X314, X315, X317, X320, X321，X323，X328, X329, X331，X332，X333, X343, X345, X346,X350, X351，X352，X356, X357, X360, X361, X363, X364, X366, X367, X368, X369, X370, X371,X378, X379, X380, X383, X386, X389, X390, X392, X393, X402, X405, X408, X409, X410, X413,X414, X418, X422, X423, X424, X425, X426, X428, X429, X431, X432, X437, X444, X447, X448,X457, X460, X461, X462, X463, X464, X466, X467, X468, X469, X471，X472，X475, X484, X489,X490, X491, X492, X493, X494, X497, X500, X501, X502, X503, X504, X506, X509, X510, X511,X513, X515, X517, X519, X522, X528, X529, X531，X534，X535, X536, X537, X539, X540, X542,和X544，并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI ;或者(b)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI ;以及(c)相对于SEQ IDNO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:E2, A3，S13，D17，Y18，L19，L20, D23，D25，E26，S27, 128，E29, Y31, K32, D33, K34, K36, K37, A40, E41, V42, R43, R44, E45, 146，N47, N48,E49, K50, A51, F53, L54, T55, L56, L57, L59, 160，N62, R71, E73, S74, D75, R77, G78, A79,D81, R82, F83, V84, S85, S86, G87, G88, F89, A91, V92, T93, K94, T95, L97, H98, G99, T100,A101, L102, S103, L107, Q109, Gill, E113, V114, S115, Q116, E117, A118, F119, S120, G121,K123, D124, Q125, G127, N128, F129, L130, E131, L133, K134, E135, D136, 1137，K138, A139,1140，L143, A146, L151, E152, N155, 1156，D158, A160, K161, V162, F163, S166, H167, K169,E170, L171, S172, K175, 1176，G177, K178, E179, L180, A181，E182，Q183, N185, A187, H193,R194, T196, Q197, S204, K210, K211, E212, N215, Q216, V217, L218, L219, E220, A222, 1223，L224, Y226, M228, 1229，S231, V232, R235, T240, S241, R242, R246, T251, L253, L260, V268,V270, A271，F272，Q275, Y276, D278, S282, E307, E314, R315, D317, A320, 1321，D323，M328,K329, C331, F332, L333, A343, D345, N346, K350, G351，E352，P356, Y357, K360, A361, A363,D364, C366, N367, A368, F369, L370, Q371, N378, K379, S380, T383, D386, G389, N390, W392,K393, V402, Y405, V408, V409, Q410, K413, K414, E418, K422, Y423, H424, D425, T426, S428,R429, S431, H432, C437, S444, 1447，A448, S457, M460, R461, T462, K463, G464, S466, E467,E468, L469, T471, E472, M475, K484, K489, L490, G492, S493, L494, K497, V500, E501, T502,A503, 1504，L506, Q509, S510, H511, T513, H515, G517, A519, S522, R528, K529, V531, V534,1535，T536，E537，1539，L540,F542 和 R544。在一些实施例中，置换选自 E2H 或 I 或 S、A3E或 G 或 K 或 N 或 Q 或 R 或 T、S13Q 或 T、D17E、Y18F 或 M 或 N、L19F、L20I 或 V、D23T、D25A 或E或S、E26G或N或Q或T、S27E或F或K或V、I28E或F或M或P、E29D或P或R或T、V30N或 Q、Y31Q 或 W、K32D 或 G 或 N 或 R、D33N、K34D 或 E 或 Q 或 S、K36F 或 R、K37F 或 1、A40C 或D或E或F或M或N或P或Q或V、E41C或D或F或N或Q或S或V、V42A或S或T、R43I或Q、R44A或D或K或M或Y、E45C或M或N或Q、I46F或V、N47E或I或K或R或V、N48A或C或E或F或L或Q或R或S、E49G或H或I或R或S或W、K50C或G或M或N或P或R、A51E或G或L或Q或T、F53D、L54A或C或E或H或I或Q、T55A或H或N或Q或S或Y、L56H 或 Q 或 R 或 S、L571、L59F 或 M 或 S 或 V 或 Y、I60C 或 V、N62V、R711、E73D、S74G 或 M或P、D75E、R77A或N或T或V、G78E或I或K或N或P或Q或V或W、A79M或R或Y、D81C或E或H或L或N、R82C或F或G或L或W、F83G或H或I或L或V、V84F或H或L或N或Q或R或S或T或W或Y、S85C或L或N或R、S86C或N、G87C或E或F或K或L或N或T、G88C或D或I或V或W或Y、F89C或I，A91C或D或E或G或H或L或R或S或T或V或Y、V92A或C或E或F或G或I或L或Q或W、T93H或I或Q或V或W、K94C或V或Y、T95C或H或K或M、L97A或M或P、 H98C或S或T或V或W、G99A或C或H或P或Q或Τ、Τ100Α或 I 或 L 或 M 或 V、A101S、L102M、S103A 或 C 或 G 或 L、L107C 或 F、Q109C 或 N 或 S、G111A、E113C 或 H 或 V、V114C、Sliro 或 Y、Q116G 或 H 或 L 或 S 或 T 或 V、E117A 或 D 或 1、A118I 或V、F119L或M、S120A或D或E或F或K或N或R或W或Y、G121D或L或V或W、K123I或S或W或Y、D124C或E、Q125A或D或G或H或K或L或N或S或T或V或W、G127D或F或W、N128A、F129L 或 Y、L130A 或 C 或 D 或 Q 或 V 或 Y、E131D 或 F 或 G 或 R、L133E 或 G 或 I 或P或Q或T或V或Y、K134D或G或H或I或L或N或R或W或Y、E135H或S，D136N、I137A或C或D或G或P或Q或S或V、K138C或D或E或P或R或S或V、A139P或S或T或V、I140N或Q或S或T或V、L143A或F或G或N或R或W、A146M、L151E或G或M或N或Q或R或S或T或V或W、E152A或D或I或M或P、G153D、N155E或K或Μ、I156E或K或L或R或 Y、D158E、A160F 或 H 或 S、K161L 或 R 或 S 或 Y、V162D 或 F 或 N 或 P 或 T、F163C 或 H 或I或M或V或W或Y、S166C或E或H或K或P或Q或V或W、H167C或L或P、K169E或G或R、E170G或I或N或R、L171C或E或G或I或M或W、S172G或N或Q或R、K175A或G或H或N或P或T或V、I176A或C或N或Q或V、G177D或E或H或N或P或T、K178D或E或G或I或L或M或N或P或Q或V或Y、E179G或I或P或Q或S或T或V或W或Y、L180F或H 或 V 或 W、A181F 或 M 或 N 或 W、E182H 或 N、Q183A 或 L、N185D、A187C 或 S、H193W、R1941、T196V、Q197G、S204A 或 F 或 M 或 W 或 Y、K210M、K211D 或 E 或 F 或 G 或 H 或 I 或 M 或 R 或 S或T或V、E212A或D或M或P或Q或Τ、Ν21?或Y、Q216A或E或N、V217C或E或K或N或P 或 Q 或 T、L218V、L219I 或 M 或 V、E220D 或 N、A222S、I223C、L224A 或 C 或 T 或 V、Y226F、M228H 或 R、I229A、S231D 或 G 或 H 或 R 或 V、V232Q、R235A 或 D 或 N、T240V、S241C、R242K或 L、R246H 或 Q、T251H、L253M、L260M、V2681、V270I,A271S、F272Q、Q275E、Y276F 或 H 或 Q、D278L 或 M 或 R 或 Y、S282C、E307Q 或 R、E314H、R315G 或 K、D317S、A320N 或 T、I321L 或 M、D323I 或 T、M328L、K329G 或 Q 或 R、C331T、F332Y、L333F、A343I 或 V、D345Y、N346A、K350H 或W 或 Y、G351E 或 M、E352F 或 I 或 M 或 V、P356M 或 S、Y357E、K360Q、A361Q 或 S 或 V、A363S、D364N 或 T、C366A、N367D 或 E 或 M、A368D 或 Q、F369H 或 Q、L370A 或 D 或 E 或 F 或 H 或 N 或R或S或T或V、Q371G或H或I或N或P或R或T或W或Y、N378D、K379E或R或S、S380K或 N、T383Q、D386K 或 S、G389C 或 M 或 P 或 R 或 T、N390S、W392F 或 Μ、K393H 或 R、V402F 或I 或 L、Y405F、V408Q 或 S、V409C 或 Q 或 S、Q410E 或 G 或 H 或 I 或 R、K413P、K414C 或 H 或I 或 Q、E418N、K422G 或 H 或 Q 或 R、Y423G、H424D 或 G 或 I 或 S 或 T、D425P、T426A 或 M 或Q、S428V、R429A 或 C 或 D 或 G 或 H 或 K 或 N、S431G、H432A 或 M、C437N、S444N 或 Q 或 T、I447K 或 R、A448H 或 S 或 T、S457D、M460A 或 E 或 G、R461N、T462S、K463G 或 N、G464A 或 D或E或F或H或V或Y、S466E或G或K或N或Τ、E467N、E468A或N或P或Q、L469A或N、T471N、E472A 或 G 或 N、M4751、K484A、K489R、L490I 或 Y、G492T 或 V、S493C 或 G 或 K 或 V、L494G 或 I 或 Q 或 V、K497M 或 T、V500I 或 Y、E501N、T502H、A503L 或 M、I504L、L506I 或 V、Q509A, S510T、H511I 或 M、T513S、H515Q、G517P、A519C、S522A 或 K、R528K、K529A、V531G 或N、V534A 或 S、I535C 或 S 或 Τ、T536M、E537H 或 N 或 Q，I539V, L540E 或 Q 或 R 或 V、F542M、和R544G或N或P或Q或S。
[0028]在另一方面，本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X22，X36，X43，X58, X87, X89, X118, X151`, X234, X247, X254, X282, X288, X391, X392, X437, X443, X447,X481，X488，X502，和X542，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中，置换位于选自下列的残基处:S22, K36, R43, E58, G87, F89, A118, L151, Q234, V247, H254, S282, S288, A391,W392, C437, 1447，T481, E488, T502 和 F542。在一些实施例中，置换选自 S22K 或 R、K36H或 W、R43E, E58F, G87S 或 R、F89D, A118E, L151Y, G153P, Q234R, V247I, H254C, S282H 或 W、S288A 或 T 或 Y、A391G, W392C、C437L, I447V, T481Y, E488L, T502F 和 F542N。
[0029]在另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30，X134，X143，X156，X159，X172，X414，和X421，，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20 %。在一些实施例中，置换位于选自K134，L143，I156，E159，S172，K414，和Q421的残基处。在一些实施例中，置换位于选自 V30K, K134C 或 P，L143I, I156G, E159D, S172V, K414F，和 Q421R 或 D 的残基处。
[0030]在另一方面，本发明提供了包含上文所述和本说明书其余部分所述的多肽中的任何一种的重组宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞选自细菌、海藻、真菌、酵母、蓝细菌或梭菌细胞。在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞。在一些实施例中，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在一些实施例中，细菌细胞选自大肠杆菌(E.coli)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、朽1檬泛菌(P.citrea)、枯草茅孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amy1liquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.1autus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、白色葡萄球菌(S.albus)、变铅青链霉菌(S.1ividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、生抱梭菌(Clostridium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)细胞。在一些实施例中，宿主细胞为藻类细胞。在一些实施例中，藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻、藻细胞核(chlorarachniophytes)、眼虫、色菌界或沟鞭藻。在一些实施例中，宿主细胞为真菌细胞。在一些实施例中，真菌细胞为丝状真菌。在一些实施例中，宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中，酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或假丝酵母属(Candidasp.) ο在一些实施例中，酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
[0031]在另一方面，本发明提供了鉴定多肽的方法，当所述多肽在宿主细胞中表达时，具有改善的异戊二烯合酶活性和/或改善的生长特性，所述方法包括从位点评价库或组合库筛选多肽中的一个或多个置换，所述置换使得与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的比活性和生长量相比，表达所述多肽时宿主细胞的比活性和/或生长量有所提闻。
[0032]在另一方面，本发明提供了非天然存在的异戊二烯合酶变体，其包含选自下列的氨基酸残基置换:X003C，X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003K, X003L, X003M,X003N, X003P, X003Q, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X007C, X007D, X007E,X007F, X007G, X007H, X007I, X007K, X007L, X007M, X007N, X007P, X0070, X007R, X007S,X007T, X007V, X007W, X007Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009I,X009K, X009L, X009M, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X012A,X012C, X012D, X012E, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012P, X012Q,X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013C, X013D, X013E, X013F, X013G,X013H, X013I, X013K, X013L, X013M, X013N, X01P3, X013Q, X013R, X013T, X013V, X013W,X013Y, X016A, X016C, X016D, X016E, X016F, X016G, X016H, X016I, X016K, X016L, X016M,X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X016W, X018A, X018C, X018D, X0E18,X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S,X018T, X018V, X018W, X020A, X020C, X020D, X020E, 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X457H, X457I, X457K, X457L, X457M,X457N, X457P, X457Q, X457R, X457T, X457V, X457W, X457Y, X462A, X462C, X462D, X462E,X462F, X462G, X462H, X462I, X462K, X462L, X462M, X462N, X462P, X462Q, X462R, X462S,X462V, X462W, X462Y, X476A, X476C, X476D, X476E, X476F, X476G, X476H, X476I, X476K,X476L, X476M, X476P, X476Q, X476R, X476S, X476T, X476V, X476W, X476Y, X487A, X487C,X487D, X487E, X487F, X487G, X487H, X487I, X487L, X487M, X487N, X487P, X487Q, X487R,X487S, X487T, X487V, X487W, X487Y, X488A, X488C, X488D, X488F, X488G, X488H, X488I,X488K, X488L, X488M, X488N, X488P, X488Q, X488R, X488S, X488T, X488V, X488W, X488Y,X489A, X489C, X489D, X489E, X489F, X489G, X489H, X489I, X489L, X489M, X489N, X489P,X489Q, X489R, X489S, X489T, X489V, X489W, X489Y, X490A, X490C, X490D, X490E, X490F,X490G, X490H, X490I, X490K, X490M, X490N, X490P, X490Q, X490R, X490S, X490T, X490V,X490W, X490Y, X491A, X491C, X491D, X491E, X491F, X491H, X491I, X491K, X491L, X491M,X491N, X491P, X491Q, X491R, X491S, X491T, X491V, X491W, X491Y, X492A, X492C, X492D,X492E, X492F, X492H, X492I, X492K, X492L, X492M, X492N, X492P, X492Q, X492R, X492S,X492T, X492V, X492W, X492Y, X493A, X493C, X493D, X493E, X493F, X493G, X493H, X493I,X493K, X493L, X493M, X493N, X493P, X493Q, X493R, X493T, X493V, X493W, X493Y, X495A,X495C, X495D, X495E, X495G, X495H, X495I, X495K, X495L, X495M, X495N, X495P, X495Q,X495R, X495S, X495T, X495V, X495W, X495Y, X496C, X496D, X496E, X496F, X496G, X496H,X496I, X496K, X496L, X496M, X496N, X496P, X496Q, X496R, X496S, X496T, X496V, X496W,X496Y, X497A, X497C, X497D, X497E, X497F, X497G, X497H, X497I, X497L, X497M, X497N,X497P, X497Q, X497R, X497S, X497T, X497V, X497W, X497Y, X498A, X498C, X498D, X498E,X498F, X498G, X498H, X498I, X498K, X498L, X498M, X498N, X498Q, X498R, X498S, X498T,X498V, X498W, X498Y, X509A, X509C, X509D, X509E, X509F, X509G, X509H, X509I, X509K,X509L, X509M, X509N, X509P, X509R, X509S, X509T, X509V, X509W, X509Y, X514A, X514C,X514D, X514E, X514F, X5 14G, X514H, X514I, X514K, X514L, X514M, X514N, X514P, X514Q,X514R, X514S, X514T, X514V, X514W, X521A, X521C, X521D, X521E, X521F, X521G, X521H,X521I, X521K, X521L, X521M, X521N, X521P, X521Q, X521R, X521S, X521V, X521W, X521Y,X539A, X539C, X539D, X539E, X539F, X539G, X539H, X539K, X539L, X539M, X539N, X539P,X539Q, X539R, X539S, X539T, X539V, X539W, X539Y, X540A, X540C, X540D, X540E, X540F,X540G, X540H, X540I, X540K, X540M, X540N, X540P, X540Q, X540R, X540S, X540T, X540V,X540W, X540Y, X544A, X544C, X544D, X544E, X544F, X544G, X544H, X544I, X544K, X544L,X544M, X544N, X544P, X544Q, X544S, X544T, X544V, X544W，和 X544Y ；
[0033]其中X代表任何氨基酸；并且
[0034]其中每个氨基酸残基位置的编号与图20所示的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶序列中的氨基酸残基位置相对应。[0035]在另一个实施例中，所述变体包含氨基酸残基:N438，E451，和Y514。在另一个实施例中，所述变体包含氨基酸残基:F287，G397，N438，E451，和Y514。在任何实施例中，所述变体包含选自下列的置换:X003H，X003T, X033H, X033I，X033K, X033S, X033T, X033V, X033W,X033Y, X036L, X044F, X044H, X044T, X050I, X050L, X050W, X053I, X053L, X053T, X053V,X053W, X053Y, X059A, X059C, X059F, X059G, X059H, X059I, X059K, X059M, X059R, X069S,X074I, X074K, X074W, X078I, X078L, X078W, X078Y, X087K, X087L, X087T, X099I, X099K,X099L, X099T, X099V, X099Y, X116F, X116I, X116T, X116V, X116W, X116Y, X117F, X117I,X117L, X117W, X120I, X120L, X139T, X165H, X165Y, X173H, X173T, X173V, X173W, X174H,X174I, X177L, X177T, X177V, X179H, X179I, X179K, X179L, X179T, X179V, X179W, X202H,X254K, X376I, X377W, X389K, X421E, X421H, X421R, X448H, X448T, X448V, X462H, X462K,X462V, X476Y, X487T, X489I, X489R, X489T, X489W, X490H, X490I, X490T, X490V, X490W,X491H, X491I, X491K, X491L, X491T, X491V, X491W, X491Y, X492A, X492D, X492E, X492H,X492I, X492K, X492T, X492V, X493E, X493G, X493I, X493K, X493L, X493R, X493T, X493V,X493W, X495H, X495K, X495L, X495M, X495R, X495S, X495T, X495V, X495W, X495Y, X496H,X498H, X509I, X509T, X509V, X539L, X539T, X539V, X540H, X540I, X540K, X540T, X540V,X540Y, X544S, X544T, X544V，和 X544W。
[0036]在本文的任何实施例中，所述变体包含选自下列的置换:X003T，Χ016Ι, X033F,Χ033Η, Χ033Ι, X033V, Χ036Ι, X044F, Χ044Μ, Χ050Η, Χ050Ι, Χ050Τ, X050W, Χ053Ι, X059C,Χ059Ε, X059F, Χ059Η, Χ059Ι, Χ059Κ, X059Q, X059R, Χ059Τ, X069S, Χ069Τ, Χ074Η, Χ074Ι,Χ074Κ, Χ074Τ, X074V, X074W, X078F, Χ078Η, Χ078Ι, X078R, Χ078Τ, X078V, X078W, Χ078Υ,Χ099Ι, Χ099Κ, Χ099Τ, X099V, X116F, Χ116Ι, Χ116Ν, Χ116Ρ, Χ116Τ, X116V, X116W, X117C,X117F, Χ117Ι, X117L, Χ117Μ, X117W, X125F, X125V, X125W, Χ127Η, Χ127Τ, Χ139Τ, X165F,Χ165Η, Χ165Κ, Χ165Υ, X173F, Χ173Η, Χ173Κ, X173R, Χ173Τ, X173V, X173W, Χ174Η, Χ174Ι,Χ174Τ, X179G, Χ179Ι, X179S, Χ216Α, X421R, X448R, Χ448Τ, X448V, Χ462Η, Χ462Ι, Χ462Κ,X462V, X462W, X476R, X476V, X487F, Χ487Η, Χ487Τ, X487W, X489R, X490F, Χ490Η, Χ490Ι,X490V, X490W, X491C, Χ491Η, Χ491Ι, X491L, Χ491Τ, X491V, X491W, Χ492Α, Χ492Ε, X493G,Χ493Ι, X493L, Χ493 Τ, X493V, X493W, X495L, X498C, Χ540Ι, X540S, Χ540Τ, X540V，和 Χ544Κ。
[0037]在本文的任何实施例中，所述变体包含选自下列的置换:Χ003Τ，Χ033Η, Χ033Ι,X033V, X044F, Χ050Ι, X050W, Χ053Ι, X059C, X059F, Χ059Η, Χ059Ι, Χ059Κ, X059R, X069S,Χ074Ι, Χ074Κ, X074W, Χ078Ι, Χ099Ι, Χ099Κ, Χ099Τ, X099V, X116F, Xl161， Χ116Τ, X116V,X116W, X117F, Χ117Ι, X117L, X117W, Χ139Τ, Χ165Η, Χ165Υ, Χ173Η, Χ173Τ, X173V, X173W,Χ174Η, Χ174Ι, X078W, Χ078Υ, Χ179Ι, X421R, Χ448Τ, X448V, Χ462Η, Χ462Κ, X462V, Χ487Τ,X489R, Χ490Η, Χ490Ι, X490V, X490W, Χ491Ι, Χ491Η, X491L, Χ491Τ, X491V, X491W, Χ492Α,Χ492Ε, X493G, Χ493Ι, X493L, Χ493Τ, X493V, X493W, X495L, Χ540Ι, Χ540Τ, X540V。
[0038]在本文的任何实施例中，所述变体包含选自下列的置换:X003F，X003H, X003I,X003K, X003R, X003T, X003Y, X013L, X016I, X016L, X016M, X018C, X018G, X020M, X020S,X020T, X020V, X020Y, X023H, X025H, X025I, X025K, X025L, X025T, X025V, X033F, X033H,X033I, X033K, X033L, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033W, X033Y, X036I, X036L,X036R, X036T, X036V, X036W, X036Y, X044C, X044F, X044H, X044I, X044K, X044T, X044V,X044Y, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050W, X050Y, X053G, X053H, X053I, X053K,X053L, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, X053Y, X059A, X059C, X059D, X059E, X059F,X059G, X059H, X059I, X059K, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059T, X059V, X059W, X069A,X069H, X069I, X069K, X069L, X069M, X069N, X069Q, X069R, X069S, X069T, X069V, X074H,X074I, X074K, X074L, X074T, X074V, X074W, X074Y, X078F, X078H, X078I, X078K, X078L,X078T, X078V, X078W, X078Y, X087H, X087I, X087K, X087L, X087M, X087R, X087T, X087V,X087W, X087Y, X099F, X099I, X099K, X099L, X099R, X099S, X099T, X099V, X099W, X099Y,X116A, X116F, X116I, X116K, X116L, X116S, X116T, X116V, X116W, X116Y, X117F, X117H,X117I, X117L, X117M, X117W, X120F, X120H, X120I, X120K, X120L, X120T, X120V, X120W,X120Y, X121F, X121H, X121I, X121K, X121L, X121T, X121V, X121W, X121Y, X125H, X125I,X125M, X125T, X125W, X125Y, X127F, X127H, X127I, X127L, X127T, X127V, X127Y, X139C,X139H, X139I, X139P, X139S, X139T, X139V, X165A, X165D, X165F, X165H, X165K, X165L,X165R, X165T, X165Y, X173F, X173G, X173H, X173I, X173K, X173L, X173M, X173R, X173S,X173T, X173V, X173W, X173Y, X174F, X174H, X174I, X174K, X174L, X174R, X174T, X174V,X174W, X174Y, X177A, X177H, X177I, X177K, X177L, X177M, X177P, X177T, X177V, X177Y,X179F, X179G, X179H, X179I, X179K, X179L, X179M, X179S, X179T, X179V, X179W, X179Y,X194H, X197H, X197I, X197M, X197T, X197V, X202F, X202H, X202I, X202K, X202R, X202T,X202Y, X246H, X246K, X246T, X251H, X251K, X251N, X251Y, X254F, X254I, X254K, X254R,X254T, X254V, X254W, X308H, X308I, X308W, X376I, X376Y, X377H, X377I, X377L, X377V,X377W, X379H, X379R, X379T, X379V, X389H, X389I, X389K, X389L, X389M, X389R, X389S,X389T, X389V, X389Y, X403T, X403V, X421E, X421G, X421H, X421I, X421K, X421L, X421R,X421T, X421V, X421W, X426I, X426V, X430S, X430T, X430V, X445H, X448H, X448I, X448R,X448S, X448T, X448V, X457H, X457Q, X457R, X457T, X462F, X462G, X462H, X462I, X462K,X462L, X462S, X462V, X462W, X462Y, X476R, X476T, X476V, X476W, X476Y, X487A, X487C,X487F, X487G, X487H, X487L, X487M, X487R, X487S, X487T, X487V, X487W, X489H, X489I,X489L, X489R, X489T, X489V, X489W, X490F, X490H, X490I, X490M, X490T, X490V, X490W,X491A, X491C, X491F, X491H, X491I, X491K, X491L, X491M, X491N, X491R, X491S, X491T,X491V, X491W, X491Y, X492A, X492C, X492D, X492E, X492H, X492I, X492K, X492L, X492R,X492T, X492V, X492W, X492Y, X493A, X493C, X493E, X493G, X493I, X493K, X493L, X493M,X493R, X493T, X493V, X493W, X493Y, X495A, X495G, X495H, X495I, X495K, X495L, X495M,X495Q, X495R, X495S, X495T, X495V, X495W, X495Y, X496H, X496I, X496K, X496L, X496R,X496T, X496V, X496Y, X497H, X497I, X497L, X497T, X497V, X498F, X498G, X498H, X498I,X498K, X498L, X498R, X498S, X498T, X498V, X498Y, X509I, X509M, X509S, X509T, X509V,X539K, X539L, X539T, X539V, X540E, X540F, X540G, X540H, X540I, X540K, X540M, X540Q,X540R, X540S, X540T, X540V, X540W, X540Y, X544C, X544H, X544I, X544K, X544L, X544S,X544T, X544V，和 X544W。
[0039] 在本文的任何实施例中，所述变体包含选自下列的置换:X003T，X013L, Χ117Ι，Χ165Υ，X421R，X495L，Χ509Τ，和X540V。在本文的任何实施例中，所述变体包含Χ003Τ。在本文的任何实施例中，所述变体包含X495L。在本文的任何实施例中，所述变体包含Χ509Τ。[0040]在本文的任何实施例中，表面疏水性氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，对称接触氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，保守氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，N-端环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，表面亲水性氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，表面环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，活性位点氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，柔性环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，疏水袋氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中，C-端氨基酸残基被置换。
[0041]在本文的任何实施例中，氨基酸残基509具有β -支链碳。在本文的任何实施例中，所述变体具有N-端截短。
[0042]在本文的任何实施例中，N-端截短包含与图21Α-21Β所示的那些相对应的氨基酸残基。
[0043]在本文的任何实施例中，所述变体为植物异戊二烯合酶的变体。在本文的任何实施例中，所述变体为白杨变体。在本文的任何实施例中，所述变体为银白杨(P.alba)变体。在本文的任何实施例中，所述变体为美洲山杨(P.tremuloides)变体。在本文的任何实施例中，所述变体为毛果杨(P.trichocharpa)变体。在本文的任何实施例中，所述变体为欧洲黑杨(P.nigra)变体。在本文的任何实施例中，所述变体为银白杨变种美洲山杨(P.albaV.tremuloides)变体。在本文的任何实施例中，所述变体为葛变体。在本文的任何实施例中，所述变体为白杨变体。在本文的任何实施例中，所述变体为英国橡树变体。在本文的任何实施例中，所述变体为柳树变体。
[0044]在本文的任何实施例中，所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少40%序列同一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中，所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中，所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少80%序列同 一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中，所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0045]在本文的任何实施例中，与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有至少约0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.4的生长指数。
[0046]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有至少约0.8,0.9、1.0或1.1的性能指数。
[0047]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
[0048]至少约105%的比生产率，
[0049]至少约105%的产率，以及
[0050]至少约105%的细胞性能指数。
[0051]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
[0052]至少约110%的比生产率，[0053]至少约110%的产率，以及
[0054]至少约110%的细胞性能指数。
[0055]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
[0056]至少约120%的比生产率，
[0057]至少约120%的产率，以及
[0058]至少约120%的细胞性能指数。
[0059]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
[0060]至少约150%的比生产率，
[0061]至少约150%的产率，以及
[0062]至少约150%的细胞性能指数。
[0063]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比，包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者`或多者:
[0064]至少约200%的比生产率，
[0065]至少约200%的产率，以及
[0066]至少约200%的细胞性能指数。
[0067]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中置换包括X491S。
[0068]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中所述变体不包含选自表D中所列的那些的置换。
[0069]在另一方面，本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体，其中所述变体未在表E或表F中列出。
[0070]在另一方面，本发明提供了包含本文所述的任何异戊二烯合酶变体和载体的组合物。
[0071]在另一方面，本发明提供了在容器中包含本文所述的任何异戊二烯合酶变体的试剂盒。
[0072]在另一方面，本发明提供了编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸。
[0073]在另一方面，本发明提供了包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸和载体的组合物。
[0074]在另一方面，本发明提供了在容器中包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸的试剂盒。
[0075]在另一方面，本发明提供了包含与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞。在一个实施例中，多核苷酸序列包含在质粒内。在另一个实施例中，多核苷酸序列被整合到宿主细胞的染色体中。在另一个实施例中，宿主细胞选自革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、丝状真菌细胞或酵母细胞。在另一个实施例中，宿主细胞为革兰氏阴性细菌细胞。在另一个实施例中，宿主细胞选自埃希杆菌属(Escherichia sp.)(大肠杆菌(E.coli))、泛菌属(Panteoa sp.)(朽1檬泛菌(P.citrea))、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、耶氏酵母属(Yarrowia sp.)(解脂耶氏酵母(Y.1ipolytica))和木霉属(Trichoderma)(瑞氏木霉(T.reesei))。在另一个实施例中，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
[0076]在本文的任何实施例中，宿主细胞培养于包含选自葡萄糖、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、酵母提取物、生物质、糖蜜、蔗糖和油的碳源的培养基中。在本文的任何实施例中，宿主细胞培养于包含葡萄糖的培养基中。
[0077]在本文的任何实施例中，宿主细胞还包含编码IDI多肽的异源或天然核酸和/或编码DXS多肽的异源或天然核酸，任选地与天然DXP途径结合。
[0078]在本文的任何实施例中，宿主细胞包含一个编码异戊二烯合酶变体、IDI多肽和DXS多肽的载体。
[0079]在本文的任何实施例中，宿主细胞还包含编码MVA途径多肽的异源核酸，其中MVA途径多妝选自来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和幾肠球菌(Enterococcusfaecalis)的MVA途径多妝。
[0080]在本文的任何实施例中，宿主细胞还包含一个或多个编码MVA途径多肽和DXS多肽的核酸，并且其中一个载体编码异戊二烯合酶变体、MVA途径多肽和DXS多肽。
[0081]在本文的任何实施例中，宿主细胞还包含一个或多个编码DXS多肽、IDI多肽、其余DXP途径多肽中的一者或多者和/或MVA途径多肽的核酸。
[0082]在另一方面，本发明提供了制备能够产生异戊二烯的宿主细胞的方法，所述方法包括将编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列引入宿主细胞中。
[0083]在另一方面，本发明提供了产生异戊二烯的方法，所述方法包括:(a)在适合产生异戊二烯的培养条件下，培养包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞；以及(b)产生异戊二烯。在一个实施例中，所述方法还包括(C)回收异戊二烯。
[0084]在另一方面，本发明提供了产生异戊二烯的方法，所述方法包括:(a)提供:(i)宿主细胞；和(ii)与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸；(b)将核酸引入宿主细胞中，以产生转化的宿主细胞；以及(C)在适合产生异戊二烯的培养条件下培养转化的宿主细胞。在一个实施例中，所述方法还包括(d)回收异戊二烯。
[0085]在另一方面，本发明提供了产生异戊二烯合酶变体的方法，所述方法包括:(a)提供:(i)宿主细胞；和(ii)与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸；(b)将核酸引入宿主细胞中，以产生转化的宿主细胞；以及(C)在适合产生异戊二烯合酶变体的培养条件下培养转化的宿主细胞。在一个实施例中，所述方法还包括分离异戊二烯合酶变体。
[0086]在另一方面，本发明提供了筛选异戊二烯合酶变体的方法，所述方法包括:(a)让宿主细胞与包含约?ο μ M至约70 μ M IPTG和约5mM至约20mM甲羟戊酸(MVA)的培养基接触，其中宿主细胞包含与启动子有效结合的编码异戊二烯合酶变体的核酸；以及(b)测量宿主细胞的生长速率；其中生长速率提高表明异戊二烯合酶变体在宿主细胞内将DMAPP转化成异戊二烯的能力有所提高。在一个实施例中，IPTG以约10 μ M至约60 μ M的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，IPTG以约20 μ M至约60 μ M的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，IPTG以约40 μ M至约60 μ M的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，IPTG以约50 μ M的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，MVA以约5mM至约20mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，MVA以约7mM至约15mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，MVA以约8mM至约12mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中，MVA以约IOmM的浓度存在于培养基中。在一个实施例中，宿主细胞为MD09-170。
[0087]还提供了包含与启动子有效结合的编码异戊二烯合酶变体的多核苷酸序列的表达载体。
[0088]还提供了宿主细胞的溶胞产物，其中所述溶胞产物还包含溶菌酶。在一些实施例中，溶胞产物具有中性pH (6.5至7.5)，而在其他实施例中，溶胞产物具有碱性pH (高于7.5并低于9.5)。本发明还提供了检测异戊二烯合酶活性的方法，所述方法包括:(a)在适于产生异戊二烯合酶变体的条件下培养包含表达载体的宿主细胞；(b)用包含溶菌酶的裂解缓冲液裂解宿主细胞，以生成细胞溶胞产物；以及(c)通过测量由二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)产生的异戊二烯，检测细胞溶胞产物中的异戊二烯合酶活性。
【专利附图】

【附图说明】
[0089]图1示出了检定菌株中生长量与DMAPP浓度的关系。DW425在存在多种浓度的甲羟戊酸(实验I中为0、10、20、30、40、50mM甲羟戊酸，实验2中为0、2.5、5、10、20mM甲羟戊酸)和IPTG (O μ M IPTG和50 μ M IPTG)的情况下生长。生长实验结束后，收获并收集细胞进行代谢物分析。
[0090]图2示出了在存在不同浓度的IPTG(0、10、20、30、40、50、60和70μΜ)和甲羟戊酸(0、5、7.5、10、15、 20mM)的情况下 DW425 的生长量。
[0091]图3示出了随[IPTG]和[甲羟戊酸]变化的生长量。
[0092]图4示出了 pCL201的图谱。
[0093]图5示出了野生型IspS的视图，图中示出了 Phe495相对于Gly491和Leu494的定位，它们均用棍状表示。
[0094]图6示出了野生型IspS的视图，图中示出了用棍状表示的Gln509相对于活性位点的定位。根据与TOB1N24的结构比对，对活性位点中的镁离子和(+)_ 二磷酸冰片酯进行建模。
[0095]图7示出了野生型IspS的视图，图中示出了用棍状表示的残基Phe287。根据与PDB1N24的结构比对，布置(+)_ 二磷酸冰片酯(BP)。
[0096]图8示出了野生型IspS的视图，图中示出了用棍状表示的残基Gly397。
[0097]图9示出了野生型IspS的活性位点视图，图中示出了用棍状表示的残基Asn438。根据与TOB1N24的结构比对，布置(+)_ 二磷酸冰片酯(BP)和Mg2+(球状)。
[0098]图10示出了野生型IspS的视图，图中示出了用棍状表示的残基Glu451。
[0099]图11示出了野生型IspS的活性位点视图，图中示出了用棍状表示的残基Tyr514。根据与TOB1N24的结构比对，布置(+)_ 二磷酸冰片酯(BP)和Mg2+(球状)。
[0100]图12示出了 PCHL243的图谱，其包含具有G491S突变的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶。[0101]图13示出了排气中异戊二烯浓度(％)与C02(%)的比率，显示当与整个发酵的重要部分中的呼吸率相比时，表达异戊二烯合酶G491S突变体的菌株DW415具有提高的异戊二烯产生水平。
[0102]图14示出了异戊二烯合酶变体G491S的表达，使得在发酵过程中生存能力提高。用DiBAC4(3)染色，根据是否存在膜电位确定发酵液中活细胞和死细胞的比率。
[0103]图15为具有G491S的质粒MD09-163的图谱。
[0104]图16示出了 SDS-PAGE凝胶，图中示出了不同纯化阶段的IspS_G491S。泳道1-分子量标准；泳道2-用TurboTEV消化的IspS_G491S ;泳道3_5_第二次过Ni柱后流通液中的IspS-G491S ;泳道6-7-第二次过Ni柱所得的IspS_G491S级分。
[0105]图17示出了形成二聚体的IspS_G491S。单体A为浅灰色，单体B为深灰色。
[0106]图18为在1-σ等值线的残基491处的2FQ_2FC电子密度图。A示出了 491G，B示出了 491S。
[0107]图19为包含残基491的环的比对。野生型IspS为浅灰色，IspS_G491S为深灰色。G491S突变产生替代的环结构。
[0108]图20A-B示出了序列MEA银白杨(P.alba)。
[0109]图21A-B示出了 N-端裂解的银白杨(P.alba) IspS序列的比对。
[0110]图22示出了异戍二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier et al.,Progressin Lipid Res.44:357-429, 2005 (F.Bouvier 等人，《脂类研究进展》，第 44 卷，第 357-429页，2005年))。以下说明包括途径中每种多肽的替代名称以及公开用于测量指定多肽的活性的测定法的参考文献(这些参考文献中的每一个各自据此全文以引用方式并入本文中，特别是关于用于分析MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的参考文献)。甲羟戊酸途径=AACT ;乙酰辅酶A乙酰转移酶，MvaE，EC2.3.1.9。测定法J.Bacteriol.，184:2116-2122，2002(《细菌学杂志》，第184卷，第2116-2122页，2002年)；HMGS ;羟甲基戊二酰辅酶 A 合酶，MvaS, EC2.3.3.10。测定法 J.Bacteriol.，184:4065-4070,2002(《细菌学杂志》，第184卷，第4065-4070页，2002年)；HMGR ;3_羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，MvaE, ECl.1.1.34。测定法:J.Bacteriol.，184:2116-2122,2002(《细菌学杂志》，第184 卷，第 2116-2122 页，2002 年)；MVK ;甲羟戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36。测定法=CurrGenetl9:9-14,1991(《当代遗传学》，第19卷，第9-14页，1991年)；PMK;磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8, EC2.7.4.2，测定法:Mol Cell Biol.,11:620-631,1991(《分子细胞生物学杂志》，第11卷，第620-631页，1991年)；DPMDC ;二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVDl，EC4.1.1.33。测定法 biochemistry, 33:13355-13362,1994(《生物化学》，第 33 卷，第 13355-13362 页，1994 年)；IDI ;异戊烯二磷酸 δ 异构酶，IDI1，EC5.3.3.2。测定法:J.Biol.Chem.264:19169-19175,1989 (《生物化学杂志》，第264卷，第19169-19175页，1989年)；DXP途径:DXS ;1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC2.2.1.7。测定法=PNAS, 94:12857_62，1997 (《美国国家科学院院刊》，第94卷，第12857-12862页，1997) ；DXR ；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，dxr, EC2.2.1.7。测定法:Eur.J.Biochem.269:4446-4457,2002(《欧洲生物化学杂志》，第269卷，第4446-4457页，2002年)；MCT ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，IspD, EC2.7.7.60。测定法:PNAS，97:6451_6456，2000 (《美国国家科学院院刊》，第97卷，第6451-6456页，2000年);CMK ；4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE,EC2.7.1.148。测定法:PNAS，97:1062-1067,2000(《美国国家科学院院刊》，第97卷，第1062-1067 页，2000 年)；MCS ；2C-甲基-D-赤藓醇 2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC4.6.1.12。测定法=PNAS,96:11758-11763,1999(《美国国家科学院院刊》，第96卷，第11758-11763页，1999 年);HDS ;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶，IspG, ECl.17.4.30 测定法:J.0rg.Chem.,70:9168_9174，2005 (《有机化学杂志》，第 70 卷，第 9168-9174 页，2005年)；HDR ;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IspH，ECl.17.1.2。测定法:JACS, 126: 12847-12855, 2004 (《美国化学会志》，第 126 卷，第 12847-12855 页，2004 年)。
[0111]图23示出了野生型IspS的单体视图，图中示出了不容许置换的位点的定位。
[0112]图24示出了不容许置换的IspS的活性位点中的残基定位。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
[0113]图25示出了不容许置换的IspS中的隐埋位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
[0114]图26示出了不容许置换的位于IspS的二聚体界面处的残基。链A为浅灰色，链B为深灰色。
[0115]图27示出了不容许置换的位于N-端或与N-端相互作用的IspS位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对，对Mg2+ (球状)和残基1_50进行建模。
[0116]图28示出了不容许置换的位于N-端或与N-端相互作用的IspS位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对，布置Mg2+ (球状)。
[0117]图29示出了所提出的不容许置换的IspS底物捕集环位置。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
`[0118]图30示出了野生型IspS的单体视图，图中示出了变体表现改善的比活性的位点的定位。
[0119]图31示出了在IspS的N-端中或与N-端相互作用的隐埋位点的定位，在该定位处变体表现提高的比活性。
[0120]图32示出了在I spS的C-端中或与C-端相互作用的隐埋位点的定位，在该定位处变体表现提高的比活性。根据与Η)Β1Ν24的结构比对，布置Mg2+ (球状)。
[0121]图33示出了 IspS的二聚体界面，其中链A为浅灰色，链B为深灰色。位置247处的变体表现改善的比活性。
[0122]图34示出了 IspS的N-端位点的定位,在该定位处变体表现改善的比活性。
[0123]图35示出了 IspS的表面环位置，在该位置变体表现改善的比活性。根据与PDB1N24的结构比对，布置Mg2+ (球状)。
[0124]图36示出了 IspS的表面位置，在该位置变体表现改善的比活性。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
[0125]图37示出了提出的IspS的底物捕集环位置，在该位置变体表现改善的比活性。根据与PDB1N24的结构比对，布置Mg2+ (球状)。
[0126]图38示出了表现改善的活性的IspS位置。根据与Η)Β1Ν24的结构比对，布置皿？+(球状)。
[0127]图39示出了表现改善的活性的IspS位置。根据与Η)Β1Ν24的结构比对，布置皿？+(球状)。[0128]图40示出了 IspS的单体视图，图中示出了表现改善的生长量的N-端和表面环位置。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
[0129]图41示出了 IspS的单体视图，图中示出了表现改善的生长量的N-端螺旋位置。
[0130]图42示出了野生型IspS的单体视图，图中示出了表23㈧中所列位点的定位。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。B) A中位点的近距离视图。
[0131]图43示出了 IspS的单体视图，其中具有变体表现改善的生长量的位点的定位，这些定位处为深灰色。根据与TOB1N24的结构比对，布置Mg2+(球状)。
[0132]图44示出了 IspS的视图，其中具有变体表现改善的生长量的位点的定位，其用棍状表示。A和B相隔180°。
[0133]图45示出了 N-端截短的银白杨(P.alba) IspS分子的比对。
[0134]图46示出了包含银白杨(P.alba) IspS MAR变体的pDW207的质粒图谱。
[0135]图47示出了包含银白杨(P.alba) IspS MRR变体的pDW208的质粒图谱。
[0136]发明概述
[0137]本发明提供了包含至少一种异戊二烯合酶变体酶的方法和组合物。变体包含针对亲代异戊二烯合酶多肽的一个或多个氨基酸残基置换，其中亲代异戊二烯合酶可以是野生型或非野生型序列。本发明提供了在多肽内特定位置处的氨基酸残基置换，其中与亲代序列或参考序列相比，置换可以使至少一种性能有所改善。在一些特别优选的实施例中，至少一种改善的性能选自但不限于:比生产率、产率和细胞性能指数。具体地讲，本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。本发明的通过生物合成制备的异戊二烯可用于橡胶、聚 合物和弹性体的制造。
[0138]除非另外指明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规的蛋白质化学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和酶学技术。这些技术在以下文献中有完整解释，例如:Molecular Cloning:A Laboratory Manual, secondedition (Sambrook et al., 1989)(《分子克隆:实验室手册(第二版)》(Sambrook等人，1989 年))和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, third edition(Sambrook andRussel, 2001)(《分子克隆:实验室手册(第三版)))(Sambrook和Russel, 2001年))，(在本文中共同和单独称为“Sambrook”)。Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed., 1984)(《寡核苷酸合成》(M.J.Gait 编辑，1984 年))；Animal Cell Culture (R.1.Freshney,ed.，1987)(《动物细胞培养》(R.1.Freshney 编辑，1987 年))；Handbook of ExperimentalImmunology (D.M.ffeir&C.C.Blackwell, eds.)(《实验免疫学手册》，D.M.Weir 和C.C.Blackwell 编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Ce 11 s (J.M.Mi 11 er&M.P.Calos，eds.，1987)(《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.M.Miller和Μ.P.Calos编辑，1987年))；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,including supplements through2001)(《现代分子生物学实验技术》(F.Μ.Ausubel等人编辑，1987 年,包括 2001 年的增刊))；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis etal., eds., 1994)(《PCR:聚合酶链反应》(Mullis 等人编辑，1994 年))；Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry John ffiley&Sons, Inc., New York, 2000)(《现代核酸化学实验技术》(约翰.威利父子出版公司，纽约，2000年));以及Agrawal, ed.，Protocols forOligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press Inc., NewJersey, 1993)(《寡核苷酸和类似物实验技术,合成和性质》，Agrawal编辑,胡马纳出版社，新泽西州，1993年)。相应地，接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。
[0139]此外，本文提供的标题并不是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例都可以通过整体参考本说明书而获得。因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，将多个术语定义如下。
[0140]
[0141]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实践本发明，但在本文中对优选的方法和材料进行了描述。相应地，接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。
[0142]“X”是指任何氨基酸残基。然而，当在氨基酸置换(如“X003C”)的语境中时，应当理解，“X”是指除由置换产生的氨基酸残基之外的氨基酸残基(如，X为除C之外的氨基酸残基)。在一些实施例中，不包括在残基位置前面的附加的零，因此例如“X003”也可以称为“X3”，表示残基位置3。
[0143]“异戊二烯”是指2-甲基-1，3-丁二烯(CAS号78-79-5)。它可以指由3，3_ 二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)除去焦磷酸所得的直接和最终挥发性C5烃产物。它可不涉及一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。异戊二烯不受其制造方法的限制。
[0144]如本文所用，术语“异戊二烯合酶”、“异戊二烯合酶变体”和“IspS”是指催化从二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)中除去焦磷酸以形成异戊二烯的酶。“异戊二烯合酶”可以是野生型序列或异戊二烯合酶变体。
[0145]“异戊二烯合酶变体”表示具有异戊二烯合酶活性的非野生型多肽。本领域的技术人员可以用已知的方法测量异戊二烯合酶活性。参见，例如，GC-MS(参见，如，W02009/132220，实例 3)或 Silver et al.，J.Biol.Chem.270:13010-13016,1995 (Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第13010-13016页，1995年)。变体可以具有针对野生型异戊二烯合酶序列的置换、添加、缺失和/或截短。变体可以具有针对非野生型异戊二烯合酶序列的置换、添加、缺失和/或截短。本文所述的变体包含至少一个针对亲代异戊二烯合酶多肽的氨基酸残基置换。在一些实施例中，亲代异戊二烯合酶多肽为野生型序列。在一些实施例中，亲代异戊二烯合酶多肽为非野生型序列。在多个实施例中，变体将具有至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约110%、至少约120%、至少约130%、至少约140%、至少约150 %、至少约160%、至少约170 %、至少约180%、至少约190 %、至少约200%的野生型异戊二烯合酶活性。在多个实施例中，变体将与野生型异戊二烯合酶具有至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约91%,至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。在多个实施例中，变体与野生型之间的不同氨基酸残基的数量可以为一个或多个，如，1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。野生型异戊二烯合酶可以包括任何来自植物的异戊二烯合酶，例如，葛异戊二烯合酶、白杨异戊二烯合酶、英国橡树异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。[0146]如本文所用，术语“天然存在的”指自然界中存在的(如还未借助重组或化学方法进行过操纵的)任何物质(如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。如本文所用，术语“非天然存在的”是指不存在于自然界中的任何物质(如，在实验室制备的重组产生或化学合成的蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
[0147]如本文所用，所关注的氨基酸序列的与参考氨基酸序列的氨基酸残基“相对应”的氨基酸残基表示该所关注的序列的该氨基酸残基位于与该参考氨基酸序列中的列举残基同源或等价的定位处。本领域技术人员可确定多肽中特定氨基酸残基位置是否与同源参考序列的位置相对应。例如，可以用已知的技术(如，基本局部比对搜索工具(BLAST)、ClustalW2、基于结构的序列比对程序(STRAP)等)将异戊二烯合酶多肽序列与参考序列(如，SEQ ID N0:1(图20)进行比对。另外，参考序列的晶体结构坐标可以用于帮助确定同源多肽残基的三维结构(参见，例如PCT/US2010/032134 (W02010/124146))。在另一方面，可以通过确定三级结构水平的同源性识别等同的残基。使用此类方法，可以根据参考序列的对应的氨基酸残基位置编号对异戊二烯合酶多肽或异戊二烯合酶变体的氨基酸残基进行编号。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列(图20)可用于确定所关注的异戊二烯合酶变体的每个氨基酸残基的·氨基酸残基位置编号。
[0148]在两条核酸或多肽序列的语境中，术语“相同”是指当比对以达到最大匹配程度时两条序列中相同的残基，如使用如下序列比较或分析算法中的一种所测定的。
[0149]如本文所用，“同源性”指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。同源性可以使用本领域已知的标准技术测定(参见例如Smith and Waterman, Adv.App1.Math.2:482 [1981] (Smith 和 Waterman,《应用数学进展》，第 2 卷，第 482 页，1981 年)；Needlemanand ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 [1970] (Needleman 和 ffunsch,《分子生物学杂志》，第 48卷，第 443 页，1970 年);Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 [1988](Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊》，第85卷,第2444页，1988年);软件程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux et al., Nucl.Acid Res.12:387-395 [1984] (Devereux 等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列对比。其还能够绘制显示聚类关系(用于产生比对)的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(参见 Feng and Doolittle, J.Mol.Evol.35:351-360 [1987] (Feng 和 Doolittle,《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页，1987年)的简化方法。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见 Higgins and Sharp, CAB I OS 5:151-153 [1989] (Higgins 和 Sharp,《生物科学中的计算机应用》，第5卷，第151-153页，1989年))类似。可用的PILEUP参数包括:默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10，以及加权末端空位。可用的算法的另一个例子是Altschul 等人描述的 BLAST 算法(参见 Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410 [1990](Altschul等人，《分子生物学杂志》,第215卷,第403-410页，1990年);以及Karlin andAltschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 [1993] (Karlin 和 Altschul，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页，1993年))。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见 Altschul et al.，Meth.Enzymol.266:460-480 [1996] (Altschul 等人，《酶学方法》，第266卷，第460-480页，1996年)。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值:重叠跨度(overlap span) = I,重叠分数(overlapfraction) = 0.125，字串阈值(word threshold) (T) = IloHSP S和HSP S2参数是动态值，由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
[0150]参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定，所述比较通过序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul，et al.，J.Mol.Biol.,215:403-410[1990] (Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年))。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequence pair, HSP),该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止:累积比对分数从最大获得值下降达数量X ;累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为 11、BL0SUM62 打分矩阵(参见 Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915[1992] (Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页，1992年))比对⑶为50，期望值(E)为10，M’ 5，N’ -4，以及对两条链的比较。
[0151]BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability, P (N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在试验核酸与异戊二烯合酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于0.001， 则该核酸可视为与本发明的异戊二烯合酶核酸相似。在测试核酸编码异戊二烯合酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5，更优选低于约0.2的最小合计概率，则其视为与指定的异戊二烯合酶核酸相似。
[0152]在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中，“相同”或“同一性”百分数是指，当比较和比对以达到最大相似性时，两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过目测所确定的。主题氨基酸序列与参考氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％ ”或“序列同一性％ ”或“氨基酸序列同一性％ ”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题氨基酸序列与参考氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此。就两条氨基酸序列而言，80%氨基酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的氣基酸序列中80%氣基酸残基是相同的。
[0153]主题核酸序列与参照核酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％ ”或“序列同一性意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题核酸序列与参考序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此，就两条核酸序列而言，80%核苷酸序列同一'I"生或80 %同一'丨生意指两条最佳比对的核酸序列中80 %核苷酸残基是相同的。
[0154]主题序列与参考序列的“序列同一性百分数”或“序列同一性％ ”或“同一性％ ”可通过将两条序列进行最佳比对，并且在比较长度上比较两条最佳比对的序列来计算。确定在最佳比对中相同的残基出现在两条序列中的位置数目，从而提供匹配位置的数目，然后将匹配位置的数目除以比较长度(除非另外指明，否则其为参考序列的长度)的位置总数。所得的数目乘以100而得到主题序列与参考序列的序列同一性百分数。
[0155]“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条多肽序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
[0156]当用限定的参数，如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(gap existencepenalty)(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分(gap extension penalty)来比对两条序列(如多肽序列)，以实现该对序列所可能的最高相似性分数时，这两个序列可认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BL0SUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位，并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是:BL0SUM62打分矩阵，空位存在罚分=11，空位延伸罚分=I。比对分数由每条序列的该比对开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定，以实现可能的最高相似性分数。
[0157]两条或更多条序列之间的最`佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(参见例如 Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25 (17):3389-3402 (1997) (Altschul 等人，《核酸研究》，第25卷，第17期，第3389-3402页，1997年);还可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站或CLUSTALW程序。
[0158]如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注的多肽与参考多肽“基本上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是基本上相同的。
[0159]如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注的核酸与参考核酸“基本上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列基本上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
[0160]“核酸”是指单股或双股形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。应当理解，包括单核苷酸突变在内的突变可以在如本文所定义的核酸内发生。
[0161]“重组核酸”是指这样的所关注核酸，其缺少在该所关注核酸旁侧的、所关注核酸所源自的生物体的天然存在的基因组中的一种或多种核酸(例如基因)。因此，该术语包括(例如)整合到载体中、整合到自主复制型质粒或病毒中或整合到厌氧微生物的基因组DNA中，或者独立于其他序列作为单独的分子(如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化制备的cDNA片段)存在的重组DNA。可以用本领域已知的分子生物学技术获得重组核酸，或者可以用化学方法合成重组核酸的一部分或全部。
[0162]“异源核酸”可以是这样的核酸，其核酸序列来自与宿主细胞不同的另一物种，或相同宿主细胞物种的另一菌株。在一些实施例中，该序列不同于天然存在于相同宿主细胞中的另一核酸的序列。在一些实施例中，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。
[0163]“内源性核酸”是核酸序列天然存在于宿主细胞中的核酸。在一些实施例中，内源性核酸与天然存在于宿主细胞中的野生型核酸相同。在一些实施例中，将内源性核酸的一个或多个拷贝引入到宿主细胞中。
[0164]本发明的核酸或蛋白质可以是分离的或纯化的形式。如本文所用，“分离的”相对于核酸或蛋白质而言是指 与其他组分(例如但不限于细胞或细胞培养物)分离。优选地处于同质状态，但可以在无水溶液或水溶液中。纯度和同质性通常用分析化学技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)来确定。作为制备物中存在的主要物质的蛋白质或核酸是实质上纯化的。术语“纯化的”意思是核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。具体地讲，“纯化的”意指当分离时，以分离物的重量计，分离物含有至少90%、至少95%、至少98%或更优选地至少99%的核酸或蛋白质。
[0165]纯化的多肽可以用多种方法获得，包括，例如，实验室合成、色谱法、制备性电泳、凝胶电泳、离心、沉淀、亲和纯化等(通常参见RScopes, Protein Purification,Springer-Verlag, N.Y.(1982) (R Scopes,《蛋白质纯化》,斯普林格出版公司，纽约，1982年)，Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification,Academic Press, Inc.N.Y.(1990) (Deutscher,《酶学方法》，第182卷:蛋白质纯化指南，学术出版公司，纽约，1990年))。
[0166]“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。还应理解，由于遗传密码的简并性,多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
[0167]“异源多肽”是异源核酸编码的多肽。在一些实施例中，该序列不同于由天然存在于相同宿主细胞中的核酸编码的另一种多肽的序列。异源蛋白质的例子包括酶，如异戊二烯合酶。在一些实施例中，编码蛋白质的基因是天然存在的基因，而在其他实施例中，使用突变和/或合成基因。[0168]“内源性多肽”为其氨基酸序列天然存在于宿主细胞中的多肽。在一些实施例中，内源性多肽与天然存在于宿主细胞中的野生型多肽相同。
[0169]如本文所用，术语“萜类化合物”或“类异戊二烯”是指与萜烯类似的大量且多样类别的天然存在的有机化学物质。萜类化合物衍生自以多种方式组合和改性的五碳异戊二烯单元，并且根据组成员中使用的异戊二烯单元的数量将其归类到不同的组中。半萜类具有一个异戊二烯单元。单萜类具有两个异戊二烯单元。倍半萜类具有三个异戊二烯单元。二萜类具有四个异戊二烯单元。二倍半萜类具有五个异戊二烯单元。三萜类具有六个异戊二烯单元。四萜类具有八个异戊二烯单元。多萜类具有八个以上的异戊二烯单元。
[0170]如本文所用，术语“顶空”是指密封容器中的固体或液体样品上聚集的蒸气/空气混合物。
[0171]如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
[0172]除非另外指明，否则核酸从左至右以5 ’至3 ’取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。
[0173]在本说明书通篇中给出的每一个上限值旨在包括每一个下限值，就如同此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每一个上限值，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0174]对本文中的“约”值或参数的参考还包括(并描述)涉及该值或参数自身的实施例。
[0175]应当理解，本文所述的本发明的所有方面和实施例还包括“包含”、“由其组成”和“基本上由其组成”的方面和实施`例。应当理解，“基本上由”列举要素“组成”的方法或组合物只包括指定步骤或材料以及不会严重影响那些方法和组合物的基本和新型特性的步骤或材料。
[0176]应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
【具体实施方式】
[0177]异戊二烯单体用于聚异戊二烯和多种共聚物(具有异丁烯、丁二烯、苯乙烯或其他单体)的制造。要构建能够产生商业上可行水平的异戊二烯的菌株(原核或真核)，需要对DXP或MVA途径的一部分或全部或者MVA和DXP两者途径进行优化。途径中的关键酶是异戊二烯合酶(IspS)，其将前体DMAPP转化成异戊二烯。已鉴定的异戊二烯合酶(IspS)包括来自植物例如白杨、英国橡树和葛藤的那些。鉴定的植物IspS酶中的一些已部分地通过在大肠杆菌(E.coli)中表达进行部分地表征，这些酶的动力参数中的一些已经用纯化蛋白质在体外确定。然而，天然IspS酶的动力参数(Km、速率等)不足以在生物宿主中进行异戊二烯的商业生产。因此，要解决的一个问题是提供异戊二烯合酶变体(如，在特定残基处具有置换的变体)，其具有改善的性质，使得可以用生物方法制备更多量的异戊二烯。
[0178]要解决本文所述的这个问题，异戊二烯合酶可以在宿主(如，细菌宿主)中表达。另外，通过改造异戊二烯合酶变体使所关注的性质发生改变。通过任何合适的方法或测试并优选地根据所关注性质的评价完成IspS变体的表征。这些变体可用于生物宿主中异戊二烯的商业生产。
[0179]所关注的性质包括但不限于:提高的细胞内活性、表达IspS的细胞的比生产率(g/L/OD/hr)(将在下文中更详细描述)、产率(g/g葡萄糖)(如，以下公式2)和细胞性能指数(异戊二烯的克数/细胞干重的克数)。不受理论的约束，可以用IspS的下列任何性质之一或组合获得这些性质:提高细胞活力(如，由于对宿主细胞的底物(如，DMAPP)毒性减轻或异戊二烯合酶酶毒性降低而使宿主细胞更好地生长)、增大kMt、减小Km、提高比活性、提高溶解度、降低不溶性、改善核糖体结合、提高翻译起始速率、提高翻译延伸速率、提高转录起始速率、提高转录延伸速率、减少DNA 二级结构、减少RNA 二级结构、增加DNA 二级结构、增加RNA二级结构、提闻折置速率、提闻对细胞内分子伴侣的未和力、提闻稳定性、降低蛋白质周转、减少对细胞内蛋白酶的暴露、降低对细胞内蛋白酶的亲和力、降低对周质的定位、改善对细胞质的定位、减少包涵体形成、减少膜定位、由于更有利的密码子而增加表达、提高DNA稳定性、提高RNA稳定性和降低RNA降解。简而言之，对编码或表达IspS变体的核酸序列(DNA和RNA)的性质或IspS酶本身的生物化学性质具有正面影响的任何突变都可使细胞内具有更大的活性。其他所关注的性质包括最适pH、温度稳定性(如， 值)以及对潜在抑制剂(包括底物或产物抑制)的敏感性。氧化和蛋白水解稳定性也是所关注的。此外，由于金属离子效应和离子强度而导致的活化或抑制也是所关注的。
[0180]可以通过使用纯化或部分纯化的异戊二烯合酶体外使DMAPP转化为异戊二烯或在表达DXP途径、MVA途径或两者的宿主生物体，例如大肠杆菌(E.coli)的环境下体内使DMAPP转化为异戊二烯，从而评价这些性质和参数。可以设想，在一种或多种测试条件下，具有多种程度的稳定性、溶解度、活性和/或表达水平的酶将可用于在本发明中在多种宿主中产生异戊二烯。
[0181]本发明的特征在于用于产生增加量的异戊二烯的组合物和方法。具体地讲，这些组合物和方法可以提高异戊二烯的产生速率并增加产生的异戊二烯总量。本文所述的产生异戊二烯的生物合成方法是使用天然橡胶的理想的替代形式。如下文进一步讨论的，可通过将编码异戊二烯合酶(IspS)变体的异源核酸引入到细胞中，来大大提高细胞产生的异
戍二烯量。
[0182]另外，可通过提高由包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞表达的一种或多种DXP途径多肽(如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽)和/或异戊烯二磷酸异构酶(IDI)多肽的量，来提高所述细胞的异戊二烯产量。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸引入所述细胞中。DXS核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。相似地，IDI核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。在一些实施例中，通过用导致DXS和/或IDI核酸更高转录水平的其他启动子和/或调控区替代内源性DXS和/或IDI启动子或调控区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施例中，细胞既包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(如，植物异戊二烯合酶核酸)，也包含编码异戊二烯合酶多肽的内源性核酸的副本。
[0183]编码的DXS和IDI多肽是用于生物合成异戊二烯的DXP途径的一部分(图22)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。无意受任何具体理论的约束，据信增加DXS多肽的量能增加流向DXP途径的碳流量，从而导致更高的异戊二烯产量。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)之间的相互转化。无意受任何具体理论的约束，据信增加细胞中IDI多肽的量能增加被转化为DMAPP的IPP的量，DMAPP进而被转化为异戊二烯。
[0184]如下文所详述，在一些实施例中，可通过增加一种或多种MVA多肽在包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞中的表达来提高所述细胞的异戊二烯产量(图22)。示例性的MVA途径多肽包括下列多肽中的任何一种:乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、IDI多肽，以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。例如，可将一种或多种MVA途径核酸引入细胞中。在一些实施例中，细胞包含MVA上游途径，所述MVA上游途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA还原酶核酸。在一些实施例中，细胞包含MVA下游途径，所述MVA下游途径包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施例中，细胞包含整个MVA途径，所述整个MVA途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。MVA途径核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。在一些实施例中，通过用导致MVA途径核酸更高转录水平的其他启动子和/或调控区替代MVA途径核酸的内源性启动子或调控区来增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施例中，细胞既包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(如，植物异戊二烯合酶核酸)，也包含编码异戊二烯合酶多肽的内源性核酸的副本。
[0185]在一些实施例中，细胞的至少一部分使异源异戊二烯合酶、DXS、ID1、其他DXP途径和/或MVA途径核酸在连续培养物(如未稀释的连续培养物)中保持至少约5次、10次、20次、50次、75次、100次、200次、300次或更多次的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施例中，包括异源异 戊二烯合酶或内源性异戊二烯合酶的副本、DXS、ID1、其他DXP途径和/或MVA途径核酸的核酸还包含选择标记，例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。
[0186]异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力，来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文献所描述进行测量=Silver et al.，J.Biol.Chem.270:13010-13016，1995 (Silver 等人，《生物化学杂志》，第 270 卷，第 13010-13016 页，1995 年)以及其中的参考文献。
[0187]在一个实施例中，在氮气流下将DMAPP(西格玛公司(Sigma))蒸发至干燥并在pH8.2的IOOmM磷酸钾缓冲液中将其再水化至IOOmM的浓度，并保存于_20°C下。为进行该测定，可将5 μ I 的 IM MgCl2UmM(250 μ g/ml)DMAPP,65 μ I 的植物提取物缓冲液(PEB) (50mMTris-HCl, pH8.0,20mM MgCl2, 5%甘油和2mM DTT)的溶液加入20mL顶空小瓶中的25 μ I细胞提取物中，并在振动下和37°C下培养15分钟，该小瓶具有金属旋盖和涂特氟龙的硅隔膜(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))。通过添加200 μ I的250mM EDTA或通过热灭活淬灭反应，并通过GC/MS对异戊二烯进行定量。
[0188]异戊二烯合酶亲代序列[0189]可以用亲代异戊二烯合酶生成异戊二烯合酶变体，其中亲代异戊二烯合酶可以是如本文所述的异戊二烯合酶，包括野生型和非野生型异戊二烯合酶。示例性的亲代异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的亲代异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物的天然多肽和核酸以及衍自本文所述的任何来源生物的变异多肽和核酸。
[0190]在一些实施例中，亲代异戊二烯合酶来自蝶形花科、杨柳科或山毛榉科。在一些实施例中，亲代异戍二烯合酶多肽或核酸为来自葛麻姆(Pueraria montana)(葛)(Sharkeyet al.，Plant Physiologyl37:700-712, 2005 (Sharkey 等人，《植物生理学》,第 137 卷，第700-712 页，2005 年)、白杨(例如银白杨 x 欧洲山杨(Populus alba x tremula CAC35696,Miller et al.，Planta213:483_487，2001 (Miller 等人，《植物学》，第 213 卷，第 483-487页,2001 年))或银白杨(P.alba)、山杨(例如美洲山杨(Populus tremuloides)) Silveret al.，JBC270 (22): 13010-1316，1995 (Silver 等人，《生物化学杂志》，第 270 卷，第 22期，第 13010-1316 页，1995 年))或英国橡树(夏栎(Quercus robur)) (Zimmer 等人，W098/02550)的天·然多肽或核酸。合适的亲代异戊二烯合酶包括但不限于由GenBank登录号 AY341431、AY316691、AB198180、AJ294819.K EU693027.K EF638224.K AM410988.1、EF147555.1、AY279379、AJ457070和AY182241标识的那些。另外的亲代序列在PCT/US2009/041581 (W02009/132220)和 PCT/US2010/032134 (W02010/124146)中有所描述。
[0191]在多个实施例中，亲代异戊二烯合酶与MEA银白杨(P.alba)具有至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %、至少约92 %、至少约94 %、至少约96 %、至少约98%、至少约99%的序列同一性。在其他实施例中，亲代异戊二烯合酶与全长银白杨(P.alba)或完整的银白杨(P.alba)具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约92%、至少约94%、至少约96%、至少约98%、至少约99%的序列同一性(参见，如，图21和21B)。
[0192]适于产生本发明酶的变体的若干方法是本领域已知的，包括但不限于点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。
_3] 异戊二烯合酶变体
[0194]多肽，如异戊二烯合酶，具有由主要氨基酸序列和围绕多肽的环境确定的三维结构。该三维结构确立了多肽的活性、稳定性、结合亲和力、结合特异性和其他生化属性。因此，了解蛋白质的三维结构可以在改进其生物活性；例如，更大的催化活性和/或溶解度方面提供更多的指导。多种异戊二烯合酶的晶体结构坐标在W02009/132220和PCT/US2010/032134(W02010/124146)中有所描述。
[0195]发明人已鉴定出残基定位，其在亲代异戊二烯合酶中的突变(如，置换)可以使变体具有一种或多种改善的性质。在本发明的一个方面，突变是在与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(SEQ ID NO:1)中的位置相对应的定位处的置换，如下所示。
[0196]
【权利要求】
1.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在N-端区域、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区域中的一个或多个残基处包含一个或多个置换，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述N-端区域中的所述置换位于选自X2，X22，X36，X43，和X58的残基处。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述置换位于选自E2，S22，K36，R43，和E58的残基处。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述置换选自E2V，S22K，S22R，K36D，K36E，K36H，K36W, R43E，和 E58F。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述隐埋区域中的所述置换位于选自X71，X89，X118，X161，X228，X268，X282，X288，X331，X391，X392，X437，X460，X461，X481，X488，和 X502的残基处。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述置换位于选自R71，F89，A118，K161，M228，V268, S282, S288, C331, A391, W392, C437, M460, R461, T481, E488，和 T502 的残基处。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述置换选自R71I，F89D，F89E，A118E，A118P，K161C, M228Y, V268I, S282H, S282W, S288A, S288T, S288Y, C331P, A391G, W392C, W392F,W392M, W392S, W392V, W392Y, C437L, C437M, M460A, R461A, R461Y, T481Y, E488L, T502F 和T502M。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表面环中的所述置换位于选自X120，X151，X153, X254, X380，和 X409 的残基处。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述置换位于选自5120，l151，l1254，s380，和￥409的残基处。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述置换选自S120M，S120Q,L151F，L151Y，G153P, H254C, S380E，和 V409T。
11.根据权利要求1所述的多肽，其中所述二聚体界面中的所述置换位于X247处。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述置换位于V247处。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述置换为V247M。
14.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表面上的所述置换位于选自X348，X376，和X389的残基处。
15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述置换位于选自K348，L376，和G389的残基处。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述置换选自K348Y，和G389D。
17.根据权利要求1所述的多肽，其中所述底物捕集环中的所述置换位于选自X443，X444, X447和X448的残基处。
18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述置换位于选自S444，1447和A448的残基处。
19.根据权利要求18所述的多肽，其中所述置换选自S444S，I447T和A448V。
20.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4, X9，X243，X258，X259，X262，X266，X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446, X449, X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X2，X22，X36，X43，X58, X71, X89, X118, X120, X151, X153, X161, X228, X234, X247, X254, X268, X282, X288,X331,X348, X376, X380, X389, X391, X392, X409, X437, X443, X444, X447, X448, X460, X461,X481，X488，和X502，，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:E2，S22，K36，R43, E58, R71,F89, A118, S120, L151, K161, M228, Q234, V247, H254, V268, S282, S288, C331,K348, L376, S380, G389, A391,W392, V409, C437, S444, 1447，A448, M460, R461, T481, E488,和 T502。
22.根据权利要求21所述的多肽，其中所述置换选自:E2V,S22K，S22R，K36D，K36E，K36H,K36W,R43E，E58F，R71I，F89D,F89E，Al18E，Al18P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C, M228Y, Q234R, V247I, V247L, V247M, H254C, V268I, S282H, S282W, S288A, S288T,S288Y, C331P, K348Y, S380E, G389D, A391G, W392C, W392F, W392M, W392S, W392V, W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和 T502M。
23.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4, X9，X243，X258，X259，X262，X266，X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446, X449, X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X134，X138，X143，X156，X159，X163，X166，X167，X170, X414，X421，和 X491，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。.
24.根据权利要求2.3所述的多肽，其中所述置换位于选自K134，K138，L143，1156，E159, F163, S166, H167, E170, K414，和 Q421 的残基处。
25.根据权利要求24所述的多肽，其中所述置换选自K134P，K138C，L143F，L143V,I156G, E159G, E159Q, F163C, F163E, F163Q, F163V, F163Y, S166C, S166D, S166G, S166P,S166V, H167M, E170G, E170H, E170K, E170N, E170R, E170S, E170W, K414F, K414G, K414N,K414P，和 Q421R。
26.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4, X9，X243，X258，X259，X262，X266，X280, X294, X295, X29S, X305, X3S7, X396, X397, X435, X439, X446, X449, X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X29，X47，X86，X94，X131, X134, X156, X162, X169, X178, X179, X231, X242, X369, X414，和 X421，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述置换位于选自E29，N47,S86，K94，E131，K134, 1156，V162, K169, K178, E179, S231, R242, F369, K414，和 Q421 的残基处。
28.根据权利要求27所述的多肽，其中所述置换选自E29N，N47V,S86C，K94A，E131F，K134E, K134P, I156G, V162P, K169C, K178E, E179T, S231D, S231K, S231R, S231T, S231V,R242N, R242I, F369C, K414C, K414F, K414G, K414N，和 Q421D。
29.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4, X9，X243，X258，X259，X262，X266，X280, X294, X295, X298, X305, X387, X396, X397, X435, X439, X446, X449, X450, X514，和X518，，并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X30，X84，X134，X140，X143，X163，X166，X169，X170和X172，并且其中与SEQ ID NO:1 的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高，并且在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
30.根据权利要求29所述的多肽，其中所述置换位于选自V84，K134，I140，L143，F163，S166, K169, E170 和 S172 的残基处。
31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述置换选自V30K，V84T，K134C，K134D，K134E，I140S, I140T, L143F, L143I, L143M, L143V, F163I, F163M, S166P, S166V, K169Q, E170H,E170K，和 S172V。
32.—种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在以下位置处包含一个或多个置换:⑴N-端，(ii)从残基134至179的N-端螺旋区，其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1(野生型MEA异戊二烯合酶)或(iii)所述N-端螺旋区外部与所述N-端螺旋区相互作用的其他残基处，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:X30，X84，X134, X140, X143, X163, X166, X169, X170 和 X172。
34.根据权利要求33所 述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:V84，K134，1140，L143, F163, S166, K169, E170 和 S172。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述置换选自:V30K，V84T，K134C，K134D，K134E, I140S, I140T, L143F, L143I, L143M, L143V, F163I, F163M, S166P, S166V, K169Q,E170H, E170K，和 S172V。
36.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2，X22，X36，X43，X58，X71，X89，X118，X120, X151, X153, X161, X228, X234, X247, X254, X268, X282, X288, X331，X348，X376, X380,X389, X391，X392，X409, X437, X443, X444, X447, X448, X460, X461, X481, X488,和 X502,，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提闻。
37.根据权利要求36所述的多肽，其中所述置换位于选自E2，S22，K36，R43，E58，R71，F89, A118, S120, L151, K161, M228, Q234, V247, H254, V268, S282, S288, C331, K348, L376,S380, G389, A391, W392, V409, C437, S444, 1447，A448, M460, R461, T481, E488，和 T502 的残基处。
38.根据权利要求37所述的多肽，其中所述置换选自E2V，S22K，S22R，K36D，K36E，K36H, K36W,R43E,E58F,R71I，F89D,F89E，Al18E，Al18P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C, M228Y, Q234R, V247I, V247L, V247M, H254C, V268I, S282H, S282W, S288A, S288T,S288Y, C331P, K348Y, S380E, G389D, A391G, W392C, W392F, W392M, W392S, W392V, W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和 T502M。
39.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在N-端区域、N-端螺旋区、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少40%的提高。
40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述N-端区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X18, X36，和 X82。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述置换位于选自Y18，K36JPR82的残基处。
42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述置换选自:Y18E，Y18D，Y18S，K36P，和R82Q。
43.根据权利要求39所述的多肽，其中所述N-端螺旋区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X137, X143, X163，和 X170。
44.根据权利要求43所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:1137，L143，F163，和 E170。
45.根据权利要求44所述的多肽，其中所述置换选自:I137C，L143N，F163I，F163Q，和E170G。·
46.根据权利要求39所述的多肽，其中所述表面环中的所述置换位于选自下列的残基处:X87, X409，和 X542。
47.根据权利要求46所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:G87，V409，和F542。
48.根据权利要求47所述的多肽，其中所述置换选自:G87S，G87N,G87R，V409S，和F542N。
49.根据权利要求39所述的多肽，其中所述表面中的所述置换位于残基X251处。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中所述置换位于残基T251处。
51.根据权利要求49所述的多肽，其中所述置换为T251E。
52.根据权利要求39所述的多肽，其中所述二聚体界面中的所述置换位于残基X242处。
53.根据权利要求52所述的多肽，其中所述置换位于残基R242处。
54.根据权利要求53所述的多肽，其中所述置换为R242T。
55.根据权利要求39所述的多肽，其中所述隐埋区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X437, X460，和 X461。
56.根据权利要求55所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:C437,M460,和 R461。
57.根据权利要求56所述的多肽，其中所述置换选自:C437M，C437K，M460Q,M460G，M460A, R461D, R461S, R461T，和 R461。
58.根据权利要求39所述的多肽，其中所述底物捕集环中的所述置换位于选自下列的残基处:X443，X444，和 X447。
59.根据权利要求58所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:S444，和1447。
60.根据权利要求56所述的多肽，其中所述置换选自:S444P,I447Q，I447T，I447M，I447E, I447S，和 I447R。
61.一种分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X134, X138, X143, X156, X159, X163, X166, X167, X170, X414, X421,和X491，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
62.根据权利要求61所述的多肽，其中所述置换位于选自K134，K138，L143，1156，E159, F163, S166, H167, E170, K414，和 Q421 的残基处。
63.根据权利要求62所述的多肽，其中所述置换选自K134P，K138C，L143F，L143V,I156G, E159G, E159Q, F163C, F163E, F163Q, F163V, F163Y, S166C, S166D, S166G, S166P,S166V, H167M, E170G, E170H, E170K, E170N, E170R, E170S, E170W, K414F, K414G, K414N,K414P，和 Q421R。
64.一种分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善 的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X29, X47, X86, X94, X131, X134, X156, X162, X169, X178, X179, X231,X242，X369，X414，和X421，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID ΝΟ:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
65.根据权利要求64所述的多肽，其中所述置换位于选自E29，N47,S86，K94，E131，K134, 1156，V162, K169, K178, E179, S231, R242, F369, K414，和 Q421 的残基处。
66.根据权利要求65所述的多肽，其中所述置换选自:E29N，N47V,S86C，K94A，E131F，K134E, K134P, I156G, V162P, K169C, K178E, E179T, S231D, S231K, S231R, S231T, S231V,R242N, R242I, F369C, K414C, K414F, K414G, K414N，和 Q421D。
67.一种分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X50, X81, X134, X137, X143, X156, X159, X166, X167, X169, X170，和X414，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少30%。
68.根据权利要求67所述的多肽，其中所述置换位于选自K50，D81，K134，I137，L143，1156，E159, S166, H167, K169, E170，和 K414 的残基处。
69.根据权利要求68所述的多肽，其中所述置换选自:K50S，D81F，K134E，K134P，I137N, L143V, I156G, E159D, E159G, E159Q, S166C, S166W, H167M, H167N, K169C, E170H,E170K, E170W, K414C, K414F, K414G, K414N，和 K414P。
70.一种分离的多肽，所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30, X84, X134, X140, X143, X163, X166, X169, X170 和 X172,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高，并且在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
71.根据权利要求70所述的多肽，其中所述置换位于选自V84，K134，1140，L143，F163，S166, K169, E170 和 S172 的残基处。
72.根据权利要求71所述的多肽，其中所述置换选自:V30K，V84T，K134C，K134D，K134E, I140S, I140T, L143F, L143I, L143M, L143V, F163I, F163M, S166P, S166V, K169Q,E170H, E170K，和 S172V。
73.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X22，X71，X87，X162，X242，X288，X409，X414，X443，X444，X460，和X502，其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少160%的提高。
74.根据权利要求73所述的多肽，其中所述置换位于选自S22，R71，G87，V162，R242，S288, V409, K414, S444, M460，和 T502 的残基处。
75.根据权利要求74所述的多肽，其中所述置换选自:S22R，R71I或R，G87R，V162P，R242N, S288C, V409T, KX414F, S444D, M460A，和 T502M。
76.根据权利要求73所述的多肽，其中所述置换选自:
a)S22R,R71I, S288C, S444D, M460A，和 T502M ；
b)G87R,V162P, R242N, S288C, V409T, K414R，和 S444D ;或者`
c)G87R,V162P, R242N, S288C, V409T,和 K414F。
77.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X47, X87，X156，X162，X170, X231，X242，X288，X409，X414，和X447，其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1，并且其中与SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高，并且在类似的生长条件下，与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，宿主细胞中表达所述多肽时生长量多至少30%。
78.根据权利要求77所述的多肽，其中所述置换位于选自N47，G87，I156，V162，E170，S231, R242, S288, V409, K414，和 1447 的残基处。
79.根据权利要求78所述的多肽，其中所述置换选自N47V，G87R，I156G，V162P，E170H，S231T, R242N, S288C, S288T, V409T,和 K414F。
80.根据权利要求77所述的多肽，其中所述置换选自N47V，I156G，E170H,S231T，S288T，和 K414F。
81.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2, X18，X19，X21，X24，X26，X27，X29，X37, X42, X47, X48, X49, X56, X81, X82, X84, X93, X94, X95, X120, X123, X126, X131, X132,X134, X137, X139, X143, X151，X155，X166, X167, X169, X170, X171，X175，X179, X180, X197,X229, X231, X240, X242, X245, X246, X247, X251, X271，X282，X306, X317, X319, X369, X371,X376, X379, X380, X389, X392, X393, X408, X409, X421，X422，X423, X429, X437, X443, X444,X447, X455, X458, X461, X464, X466, X470, X473, X500, X502, X506, X513, X525 和 X531，并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于`0.9的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI ;以及(b)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI ;以及(c)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PD大于或等于0.5的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。
82.根据权利要求81所述的多肽，其中所述置换位于选自E2，Y18，L19，S21，T24，E26，S27, E29, K37, V42, N47, N48, E49, L56, D81, R82, V84, T93, K94, T95, S120, K123, N126, E131,N132, K134, 1137，A139, L143, L151，N155，S166, H167, K169, E170, L171, K175, E179, L180,Q197, 1229，S231, T240, R242, R245, R246, V247, T251, A271, S282, L306, D317, N319, F369,Q371, L376, K379, S380, G389, W392, K393, V408, V409, Q421, K422, Y423, R429, C437, S444,`1447，S455, C458, R461，G464，S466, A470, S473, V500, T502, L506, T513, E525 和 V531 的残基处。
83.根据权利要求82所述的多肽，其中置换选自E2A或K或P、Y18D或E或K或S、L19Y、S21W、T24L 或 V、E26C、S27D 或 N、E29N、K37C 或 D 或 P 或 Q 或 S、`V42M、N47D 或 S、N48D 或 G或 T、E49L 或 V、L56E 或 F 或 G 或 I 或 K 或 T 或 V 或 Y、D81Q、R82N 或 T 或 V 或 Y、V84M、T93C或 F 或 R 或 S、K94G 或 P、T95D 或 F 或 G 或 I 或 N 或 W、S120C 或 G 或 M 或 Q、K123V、N126E、E131H 或 K 或 L 或 M 或 T 或 W 或 Y、N132I 或 P、K134A、I137T、A139C 或 Q、L143C 或 D 或 E 或H或K或M或Q或T或V或Y、L151A或F、N155A或C或G或H或Q或R或S或W、S166N、H167F或I或N或Q或V、K169A或C或H或N或Q或V、E170L或S或W或Y、L171A或N或Q 或 T 或 V 或 Y、K175C 或 F 或 I 或 Q 或 R、E179D、L180A 或 1、Q197C 或 D 或 N、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C 或 K 或 M 或 Q 或 T 或 V、R246N、V247L 或 M、T251D 或 E 或 N 或 P 或 Q 或S、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C 或 D 或 E 或 G 或 S、Q371F、L376I 或 M、K379G或 Q、S380E、G389A 或 D 或 E 或 K 或 N 或 Q 或 S 或 V、W392Y、K393C 或 I 或 T 或 V、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N 或 S、R429E 或 F 或 Q、C437M、S444D 或 E、I447T、S455A、C458T、R461A, G464C 或 M 或 N 或 Q 或 S、S466D、A470I 或 L、S4731、V500A 或 C、T502M, L506M, T513C或G或K或N、E525F或R、V531E或H或K或Q或R或S。
84.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2, X6，X18，X20, X22，X23，X24，X25，X26, X27, X28, X29, X30, X31, X32, X36, X37, X42, X44, X47, X48, X49, X50, X53, X54, X55,X56, X58, X59, X68, X71, X74, X77, X78, X79, X81, X82, X83, X84, X86, X87, X91, X93, X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131, X132, X133, X134, X136, X137, X138, X139, X140, X143, X151，X153，X155, X156, X159,X160, X161，X162，X163, X164, X166, X167, X169, X170, X171，X172，X175, X176, X177, X178,X179, X180, X181，X182，X190, X194, X197, X204, X211，X215，X217, X219, X221，X228，X229,X231, X232, X235, X241，X242，X245, X246, X247, X251，X254，X271，X272，X278, X279, X282,X296, X302, X317, X319, X320, X327, X331, X348, X351, X357, X361, X364, X365, X368, X369,X370, X371, X373, X377, X380, X383, X386, X389, X392, X393, X407, X408, X409, X410, X411,X414, X422, X423, X424, X428, X429, X432, X436, X437, X440, X443, X444, X447, X448, X457,X460, X461, X462, X463, X464, X465, X466, X468, X470, X471, X472, X473, X475, X480, X490,X491, X492, X494, X496, X500, X501，X502，X503, X510, X513, X515, X519, X525, X531，X536，X537，X540, X541，X542，和X544，并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI ;以及(b)相对于SEQ ID NO:1，比活性和表达的最小性能指数(PD大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ ID N0:1，比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI。
85.根据权利要求84所述的多肽，其中所述置换位于选自E2，S6，Y18，L20,S22，D23，T24, D25, E26, S27, 128，E29, Y31, K32, K36, K37, V42, R44, N47, N48, E49, K50, F53, L54,T55, L56, E58, L59, L68, R71, S74, R77, G78, A79, D81, R82, F83, V84, S86, G87, A91, T93,K94, T95, L97, H98, G99, Q109, S115, Q116, E117, A118, S120, K123, Q125, N126, G127, N128,L130, E131, N132, L133, K134, D136, 1137，K138, A139, 1140，L143, L151，N155，1156，E159,A160, K161, V162, F163, A164, S166, H167, K169, E170, L171, S172, K175, 1176，G177, K178,E179, L180, A181，E182，L190, R194, Q197, S204, K211，N215，V217, L219, L221，M228，1229，S231, V232, R235, S241, R242, R245, R246, V247, T251, H254, A271, F272, D278, C279, S282,1296，T302, D317, N319, A320, Y327, C331，K348，G351, Y357, A361, D364, L365, A368, F369,L370, Q371, A373, Y377, S380, T383, D386, G389, W392, K393, A407, V408, V409, Q410, N411,K414, K422, Y423, H424, S428, R429, H432, L436, C437, L440, S444, 1447，A448, S457, M460,R461, T462, K463, G464, 1465，S466, E468, A470, T471，E472，S473, M475, E480, L490, G492,L494, A496, V500, E501, T502, A503, S510, T513, H515, A519, E525, V531, T536, E537, L540,P541, F542，和R544的残基处。
86.根据权利要求85所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:E2C或D或N或 T 或 V，S6N 或 T，Y18A 或 Q 或 R，L20T, S22Q, D23N, T24C, D25T, E26D 或 H 或 K 或 M 或 R或S或V，S27A或C或G或H或I或L或M或P或Q，I28D或N，E29Q，V30A或D或E或M或R或T，Y31N, K32E, K36A或C或D或E或M或N或P或Q，K37A或E或G或H或M或N或R或 T，V42F 或 I，R44 N 或 Q，N47A 或 G 或 H 或M 或 Q 或 T 或 W，N48H 或 I 或 K，E49A 或 C，K50A或D或E或F或H或S或Y，F53E或H或N或P或Q或V，L54M，T55C或D或E，L56C或N，E58N, L59H 或 T，L68I, R71K 或 M，S74D 或 E 或 N 或 Y，R77L, G78A 或 D 或 F 或 L 或 M，A79Q或T，D81A或F或G或M或R或S或T或V，R82A或E或H或I或K或M或Q或S，F83W,V84A, S86A 或 D 或 M，G87D 或 P，A91K 或 W，T93A 或 D 或 E 或 G 或 L 或 N 或 P 或 Y，K94A 或 D或E或H或I或L或M或N或R或S或T，T95A或E或P或Q或S或V或Y，L97F，H98A或D或F或G或I或L或M或N或Q，G99E或F或M，Q109E, S115A, Q116A或C或D或E或I或 P，E117C 或 F 或 L 或 M 或 V，A118M, S120H 或 T 或 V，K123L 或 T, Q125E 或 I 或 Y，N126A或C或D或M或T或V，G127C，N128C或D或P或Q，L130E, E131A或C或P或Q或S或V，N132C 或 D 或 F 或 H 或 L 或 R 或 W 或 Y，L133D, K134E 或 M 或 Q 或 S 或 T 或 V，D136E, I137E或 H 或 N，K138I 或 N, A139N, I140M 或 ff, L143S, L151C 或 H 或 I，G153C, N155I 或 T 或 V 或Y, I156D 或 N 或 T，E159M, A160I, K161A 或 C 或 N 或 Q，V162S, F163E 或 Q，A164T, S166A 或D或G，H167A或E或G或K或M或R或S或T或W，K169D或I或M或S或T，E170H或K或M 或 Q 或 T 或 V，L171H 或 K 或 R 或 S，S172A 或 C，K175S, I176M, G177A 或 C，K178A 或 F 或R 或 S 或 T，E179A 或 C 或 L 或 M 或 N，L180C 或 Q 或 T，A181H 或 Q 或 S 或 V，E182S, L190I或 M, R194L, Q197S, S204C, K211A 或 N 或 Q，N215C 或 H, V217I, L219C, L221M, M228F 或 Y,I229V, S231K 或 Q 或 T，V232I，R235K, S241A 或 M 或 T，R242A 或 D 或 E 或 H 或 I 或 M 或 N 或Q 或 S 或 T，R245I 或 L，R246D 或 K，V247T, T251A 或 G 或 K 或 R，H254D, A271C 或 V，F272D或 G 或 P 或 W，D278A 或 E 或 N 或 Q 或 S 或 T 或 V 或 W，C279A, S282A 或 Q，I296V, T302H,D317E 或 Q, N319F, A320C, Y327M, C331P, K348R 或 Y, G351D 或 N, Y357M, A361T, D364E 或 V,L365C 或 Μ, A368N, F369M 或 N 或 R 或 T 或 V，L370G 或 Q, Q371C 或 S，A373G, Y377W, S380A或 C 或 D 或 Q 或 T 或 V，T383S, D386E 或 N，G389H 或 I，W392I 或 S 或 T 或 V，K393Q, A407G,V408I, V409H 或 I，Q410C 或 D 或 K 或 L 或 M 或 T，N411G，K414E 或 G 或 L 或 N 或 P，K422A或 N 或 T，Y423Q, H424E 或 P 或 Q 或 V，S428E 或 Q，R429I 或 L 或 T 或 W 或 Y，H432E, L436M或 Y，C437K 或 T，L440I, S444P, I447A 或 E 或 M 或 Q 或 S，A448E 或 M 或 N 或 P 或 Q 或 V，S457N 或 T，M460Q 或 R 或 S，R461D 或 E 或 G 或 Q 或 S 或 T，T462Q, K463A 或 D 或 E，G464L 或R, I465A 或 C 或 G 或 S 或 T，S466P, E468D, A470M, T471E 或 H 或 Q，E472D 或 S，S473L 或 V，M475T, E480N, L490A 或 D 或 E 或 F 或 H 或 M，G492C, L494D, A496P 或 T, V500L 或 M, E501D,T502A 或 C 或 R 或 V，A503I, S510C 或 V，T513V, H515N, A519S 或 T，E525A 或 C 或 P 或 Q 或S，V531A 或 M 或 T，T536A 或 F 或 G，E537K 或 T, L540A 或 P P541M, F542P,和 R544C。
87.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2, X3，X13，X17，X18，X19，X20, X23，X25, X26, X27, X28, X29, X30, X31, X32, X33, X34, X36, X37, X40, X41, X42, X43, X44, X45,X46, X47, X48, X49, X50, X51, X53, X54, X55, X56, X57, X59, X60, X62, X71, X73, X74, X75,X77, X78, X79, X81, X82, X83, X84, X85, X86, X87, X88, X89, X91, X92, X93, X94, X95, X97,X98, X99, X100, X101, X102, X103, X107, X109, XIII，X113, X114, X115, X116, X117, X118,X119, X120, X121，X123，X124, X125, X127, X128, X129, X130, X131, X133, X134, X135, X136,X137, X138, X139, X140, X143, X146, X151，X152，X153, X155, X156, X158, X160, X161, X162,X163, X166, X167, X·169, X170, X171，X172，X175, X176, X177, X178, X179, X180, X181, X182,X183, X185, X187, X193, X194, X196, X197, X204, X210, X211, X212, X215, X216, X217, X218,X219, X220, X222, X223, X224, X226, X228, X229, X231，X232，X235, X240, X241，X242，X246,X251, X253, X260, X268, X270, X271，X272，X275, X276, X278, X282, X307, X314, X315, X317,X320, X321, X323, X328, X329, X331, X332, X333, X343, X345, X346, X350, X351, X352, X356,X357, X360, X361，X363，X364, X366, X367, X368, X369, X370, X371，X378，X379, X380, X383,X386, X389, X390, X392, X393, X402, X405, X408, X409, X410, X413, X414, X418, X422, X423,X424, X425, X426, X428, X429, X431, X432, X437, X444, X447, X448, X457, X460, X461, X462,X463, X464, X466, X467, X468, X469, X471, X472, X475, X484, X489, X490, X491, X492, X493,X494, X497, X500, X501, X502, X503, X504, X506, X509, X510, X511, X513, X515, X517, X519,X522, X528, X529, X531, X534, X535, X536, X537, X539, X540, X542，和 X544，并且其中所述多肽具有(a)相对于SEQ ID NO:1，对于比活性和表达而言，最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，对于比活性或生长而言，至少一个PI大于或等于1.0的PI ;或者(b)相对于SEQ ID NO:1，对于比活性和表达而言，最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，对于比活性或生长而言，至少一个PI大于或等于1.2的PI ;以及(c)相对于SEQ ID NO:1，对于比活性和表达而言，最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI，并且其中相对于SEQ ID NO:1，对于比活性或生长而言，至少一个PI大于或等于1.5的PI。
88.根据权利要求87所述的多肽，其中所述置换位于选自下列的残基处:E2，A3，S13，D17, Y18, L19, L20, D23, D25, E26, S27, 128，E29, Y31, K32, D33, K34, K36, K37, A40, E41,V42, R43, R44, E45, 146，N47, N48, E49, K50, A51, F53, L54, T55, L56, L57, L59, 160，N62,R71, E73, S74, D75, R77, G78, A79, D81, R82, F83, V84, S85, S86, G87, G88, F89, A91, V92,T93, K94, T95, L97, H98, G99, T100, A101, L102, S103, L107, Q109, Gill, E113, V114, S115,Q116, E117, A118, F119, S120, G121, K123, D124, Q125, G127, N128, F129, L130, E131, L133,K134, E135, D136, 1137，K138, A139, 1140，L143, A146, L151, E152, N155, 1156，D158, A160,K161, V162, F163, S166, H167, K169, E170, L171, S172, K175, 1176，G177, K178, E179, L180,A181，E182，Q183, N185, A187, H193, R194, T196, Q197, S204, K210, K211，E212，N215, Q216,V217, L218, L219, E220, A222, 1223，L224, Y226, M228, 1229，S231, V232, R235, T240, S241,R242, R246, T251, L253, L260, V268, V270, A271，F272，Q275, Y276, D278, S282, E307, E314,R315, D317, A320, 1321，D323，M328, K329, C331，F332，L333, A343, D345, N346, K350, G351,E352, P356, Y357, K360, A361, A363, D364, C366, N367, A368, F369, L370, Q371，N378，K379,S380, T383, D386, G389, N390, W392, K393, V402, Y405, V408, V409, Q410, K413, K414, E418,K422, Y423, H424, D425, T426, S428, R429, S431, H432, C437, S444, 1447，A448, S457, M460,R461, T462, K463, G464, S466, E467, E468, L469, T471，E472，M475, K484, K489, L490, G492,S493, L494, K497, V500, E501, T502, A503, 1504，L506, Q509, S510, H511, T513, H515, G517,A519, S522, R528, K529, V531, V534, 1535，T536, E537, 1539，L540, F542 和 R544。
89.根据权利要求88 所述的多肽，其中所述置换选自E2H或I或S、A3E或G或K或N或 Q 或 R 或 T、S13Q 或 T、D17E、Y18F 或 M 或 N、L19F、L20I 或 V、D23T、D25A 或 E 或 S、E26G或N或Q或T、S27E或F或K或V、I28E或F或M或P、E29D或P或R或T、V30N或Q、Y31Q或 W、K32D 或 G 或 N 或 R、D33N、K34D 或 E 或 Q 或 S、K36F 或 R、K37F 或 1、A40C 或 D 或 E 或F或M或N或P或Q或V、E41C或D或F或N或Q或S或V、V42A或S或T、R43I或Q、R44A或D或K或M或Y、E45C或M或N或Q、I46F或V、N47E或I或K或R或V、N48A或C或E或F或L或Q或R或S、E49G或H或I或R或S或W、K50C或G或M或N或P或R、A51E或G或L或Q或T、F53D、L54A或C或E或H或I或Q、T55A或H或N或Q或S或Y、L56H或Q或 R 或 S、L571、L59F 或 M 或 S 或 V 或 Y、I60C 或 V、N62V、R711、E73D、S74G 或 M 或 P、D75E、R77A或N或T或V、G78E或I或K或N或P或Q或V或W、A79M或R或Y、D81C或E或H或L或N、R82C或F或G或L或W、F83G或H或I或L或V、V84F或H或L或N或Q或R或S或T或W或Y、S85C或L或N或R、S86C或N、G87C或E或F或K或L或N或T、G88C或D或I或V或W或Y、F89C或I，A91C或D或E或G或H或L或R或S或T或V或Y、V92A或C或E或F或G或I或L或Q或W、T93H或I或Q或V或W、K94C或V或Y、T95C或H或K或M、L97A或M或P、H98C或S或T或V或W、G99A或C或H或P或Q或T、T100A或I或L或M或 V、A101S、L102M、S103A 或 C 或 G 或 L、L107C 或 F、Q109C 或 N 或 S、G111A、E113C 或 H 或V、V114C、Sliro 或Y、Q116G或H或L或 S或T或 V、E117A或D 或 1、A118I 或 V、F119L 或M、S120A或D或E或F或K或N或R或W或Y、G121D或L或V或W、K123I或S或W或Y、D124C或E、Q125A或D或G或H或K或L或N或S或T或V或W、G127D或F或W、N128A、F129L或Y、L130A或C或D或Q或V或Y、E131D或F或G或R、L133E或G或I或P或Q或T或V或Y、K134D或G或H或I或L或N或R或W或Y、E135H或S，D136N、I137A或C或D或G或P或Q或S或V、K138C或D或E或P或R或S或V、A139P或S或T或V、I140N或Q或S或T或V、L143A或F或G或N或R或W、A146M、L151E或G或M或N或Q或R或S或T或V或W、E152A或D或I或M或P、G153D、N155E或K或Μ、I156E或K或L或R或Y、D158E、A160F 或 H 或 S、K161L 或 R 或 S 或 Y、V162D 或 F 或 N 或 P 或 T、F163C 或 H 或 I 或M或V或W或Y、S166C或E或H或K或P或Q或V或W、H167C或L或P、K169E或G或R、E170G或I或N或R、L171C或E或G或I或M或W、S172G或N或Q或R、K175A或G或H或N或P或T或V、I176A或C或N或Q或V、G177D或E或H或N或P或T、K178D或E或G或I或L或M或N或P或Q或V或Y、E179G或I或P或Q或S或T或V或W或Y、L180F或H或 V 或 W、A181F 或 M 或 N 或 W、E182H 或 N、Q183A 或 L、N185D、A187C 或 S、H193W、R1941、T196V、Q197G、S204A 或 F 或 M 或 W 或 Y、K210M、K211D 或 E 或 F 或 G 或 H 或 I 或 M 或 R 或 S或T或V、E212A或D或M或P或Q或Τ、Ν21?或Y、Q216A或E或N、V217C或E或K或N或P 或 Q 或 T、L218V、L219I 或 M 或 V、E220D 或 N、A222S、I223C、L224A 或 C 或 T 或 V、Y226F、M228H 或 R、I229A、S231D 或 G 或 H 或 R 或 V、V232Q、R235A 或 D 或 N、T240V、S241C、R242K或 L、R246H 或 Q、T251H、L253M、L260M、V268I,V270I,A271S、F272Q、Q275E、Y276F 或 H 或 Q、D278L 或 M 或 R 或 Y、S282C、E307Q 或 R、E314H、R315G 或 K、D317S、A320N 或 T、I321L 或 M、D323I 或 T、M328L、K329G 或 Q 或 R、C331T、F332Y、L333F、A343I 或 V、D345Y、N346A、K350H 或W 或 Y、G351E 或 M、E352F 或 I 或 M 或 V、P356M 或 S、Y357E、K360Q、A361Q 或 S 或 V、A363S、D364N 或 T、C366A、N367D 或 E 或 M、A368D 或 Q、F369H 或 Q、L370A 或 D 或 E 或 F 或 H 或 N 或R或S或T或V、Q371G或H或I或N或P或R或T或W或Y、N378D、K379E或R或S、S380K或 N、T383Q、D386K 或 S、G389C 或 M 或 P 或 R 或 T、N390S、W392F 或 Μ、K393H 或 R、V402F 或I 或 L、Y405F、V408Q 或 S、V409C 或 Q 或 S、Q410E 或 G 或 H 或 I 或 R、K413P、K414C 或 H 或I 或 Q、E418N、K422G 或 H 或 Q 或 R、Y423G、H424D 或 G 或 I 或 S 或 T、D425P、T426A 或 M 或Q、S428V、R429A 或 C 或 D 或 G 或 H 或 K 或 N、S431G、H432A 或 M、C437N、S444N 或 Q 或 T、I447K 或 R、A448H 或 S 或 T、S457D、M460A 或 E 或 G、R461N、T462S、K463G 或 N、G464A 或 D或E或F或H或V或Y、S466E或G或K或N或T、E467N、E468A或N或P或Q、L469A或N、T471N、E472A 或 G 或 N、M4751、K484A、K489R、L490I 或 Y、G492T 或 V、S493C 或 G 或 K 或 V、L494G 或 I 或 Q 或 V、K497M 或 T、V500I 或 Y、E501N、T502H、A503L 或 M、I504L、L506I 或 V、Q509A, S510T、H511I 或 M、T513S、H515Q、G517P、A519C、S522A 或 K、R528K、K529A、V531G 或N、V534A 或 S、I535C 或 S 或 Τ、Τ536Μ、Ε537Η 或 N 或 Q，I539V, L540E 或 Q 或 R 或 V、F542M,和R544G或N或P或Q或S。
90.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:Χ22, Χ36，Χ43，Χ58，Χ87，Χ89，Χ118，Χ151, Χ234, Χ247, Χ254, Χ282, Χ288, Χ391, Χ392, Χ437, Χ443, Χ447, Χ481, Χ488, Χ502，和Χ542，并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比，所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
91.根据权利要求90所述的多肽，其中所述置换位于选自S22，K36，R43，E58，G87，F89，A118，L151，Q234，V247，H254，S282, S288, A391,W392,C437,1447，T481，E488，T502 和 F542的残基处。
92.根据权利要求91所述的多肽，其中所述置换选自:S22K或R、K36H或W、R43E，E58F，G87S 或 R、F89D, A118E, L151Y, G153P, Q234R, V247I, H254C, S282H 或 W、S288A 或 T 或 Y、A391G, W392C、C437L, I447V, T481Y, E488L, T502F 和 F542N。
93.一种分离的多肽，所述多肽具有异戊二烯合酶活性，并且当所述多肽在宿主细胞中表达时，提供改善的生长活性，其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30, X134，X143，X156，X159，X172，X414，和X421，，并且其中在类似的生长条件下，与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比，表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
94.根据权利要求93所述的多肽，其中所述置换位于选自K134，L143，1156，E159，S172，K414，和Q421的残基处。
95.根据权利要求94所述的多肽，其中所述置换位于选自V30K，K134C或P，L143I，I156G, E159D, S172V, K414F，和 Q421R 或 D 的残基处。
96.一种包含根据权利要求4所述的多肽的重组宿主细胞。
97.一种包含根据权利要求7所述的多肽的重组宿主细胞。
98.一种包含根据权利要求10所述的多肽的重组宿主细胞。
99.一种包含根据权利要求15所`述的多肽的重组宿主细胞。
100.一种包含根据权利要求19所述的多肽的重组宿主细胞。
101.一种包含根据权利要求22所述的多肽的重组宿主细胞。
102.一种包含根据权利要求31所述的多肽的重组宿主细胞。
103.—种包含根据权利要求35所述的多肽的重组宿主细胞。
104.一种包含根据权利要求63所述的多肽的重组宿主细胞。
105.—种包含根据权利要求66所述的多肽的重组宿主细胞。
106.—种包含根据权利要求69所述的多肽的重组宿主细胞。
107.一种包含根据权利要求72所述的多肽的重组宿主细胞。
108.一种包含根据权利要求79所述的多肽的重组宿主细胞。
109.—种包含根据权利要求83所述的多肽的重组宿主细胞。
110.一种包含根据权利要求86所述的多肽的重组宿主细胞。
111.一种包含根据权利要求92所述的多肽的重组宿主细胞。
112.—种包含根据权利要求95所述的多肽的重组宿主细胞。
113.根据权利要求96-112中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、藻类、真菌、酵母、蓝细菌或梭菌细胞。
114.根据权利要求113所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞。
115.根据权利要求114所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
116.根据权利要求115所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞选自大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色葡萄球菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、产碱假单胞菌、生孢梭菌、棒状杆菌属和谷氨酸棒杆菌细胞。
117.根据权利要求113所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为藻类细胞。
118.根据权利要求117所述的宿主细胞，其中所述藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻、藻细胞核、眼虫、色菌界或沟鞭藻。
119.根据权利要求118所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞。
120.根据权利要求119所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞为丝状真菌。
121.根据权利要求113所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞。
122.根据权利要求121所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞选自酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属。
123.根据权利要求122所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
124.—种鉴定多肽的方法，当所述多肽在宿主细胞中表达时，所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性和/或改善的生长特性，所述方法包括从位点评价库或组合库筛选多肽中的一个或多个置换，所述置换使得与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的比活性和生长量相比 ，表达所述多肽时所述宿主细胞的比活性和/或生长量有所提高。
【文档编号】C12N15/52GK103443271SQ201180062899
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2011年10月27日 优先权日:2010年10月27日
【发明者】Z·Q·贝克, D·A·埃斯特尔, C·L·莱福, D·H·韦尔斯, J·V·米勒 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司