专利名称：一种酸性蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明是关于一种酸性蛋白酶的制备方法，属于生物酶工程领域。
背景技术：
蛋白酶是一类使肽键断裂的水解酶，用途广泛，种类繁多，是主要的工业化酶制剂 品种之一，主要用于饲料、皮革、医药和酿造工业，其产量约占整个酶制剂产量的60%。根据 蛋白酶的活性中心和作用的最适PH值，可将其分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白 酶和酸性蛋白酶。酸性蛋白酶是一类最适作用pH为2 4的蛋白酶类，主要来源于动物的 器脏(胃蛋白酶等)和微生物分泌产生。酸性蛋白酶发现于20世纪初，很多真菌都具有产 酸性蛋白酶的能力，如黑曲(Aspergillus niger)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、米 曲霉(Aspergillusoryzae)等。自1卯4年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国 内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛而深入的研究。随着对酸性蛋白酶的研究的深入，酸性蛋白酶的应用也得到了拓展。目前，酸性蛋 白酶已经在饲料生产、白酒酿造、皮革工业得到了非常广泛的应用。在饲料工业上，酸性蛋 白酶在微酸性环境下可分解动物或植物蛋白质为小肽和氨基酸，可以补充动物体内同源酶 的不足，促进动物的消化吸收和生长发育，增强抗病能力，提高饲料的利用率，降低饲料成 本。它是一种消化酶，一般不单独使用，都是以复合酶的形式做为饲料添加剂加入饲料。根 据不同动物和同一种动物不同发育阶段以及饲料中蛋白质含量多少来确定，酸性蛋白酶用 量配制复合酶制剂。在白酒生产中，白酒生产是多种微生物共酵.酸性蛋白酶加入白酒生 产的料醅中，分解料醅中的蛋白质为小肽或氨基酸，促进白酒生产菌群的生长，促进产酒和 产香味物质的能力，因此酸性蛋白酶也是白酒生产不可缺少的一种酶。要得到优质的酸性蛋白酶，产酶菌株和发酵培养基是关键，本发明以一株黑曲霉 菌株为出发株，采用纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶组成的复合酶制备原生质体，并通过UV诱 变，筛选出的高产酸性蛋白酶菌株，在最佳优化的固体发酵培养基中发酵培养得到酸性蛋 白酶。其菌株的诱变方法独特并且高效，而后采用固体发酵培养，培养基简单且来源广泛； 投资少、能耗低；底物抑制效应较弱，产物的产率较高；产酶具有较高的温度和PH值稳定 性。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸性蛋白酶的制备方法。本发明所说的酸性蛋白酶的制备方法，是用黑曲霉为出发菌株，采用复合酶制备 原生质体并经过紫外线诱变筛选高产菌株，再经发酵培养得到酸性蛋白酶。本发明的技术解决方案如下1. 一种酸性蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)诱变处理单孢子悬液制备在斜面培养基上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子，制成粗制的孢子悬液。将此悬液振荡20min，过滤悬液，制成孢子浓度约IO6个/ml的单孢 子悬液，将孢子悬液涂布于平板培养。将平板培养好的菌丝体用组合酶于室温下处理，过滤离心收集原生质体，并调 节原生质体浓度，用紫外诱变处理。(2)生产菌株的筛选将经诱变后的菌株培养，挑取菌落颜色淡化、形态异常或孢子丰满的菌株，斜面保 存。将菌落初筛获得的变异菌株接种于初始发酵培养基中，摇瓶培养，选取多产酸性蛋白酶 的突变菌株，进行下一步摇瓶复筛。选出酸性蛋白酶产量最高的菌株。(3)酸性蛋白酶的生成将摇瓶筛得到的菌株先经过种子培养，然后转入固体发酵培养基恒温发酵培养。 发酵完毕后抽提后用氯化钠和硫酸铵混合盐析，后经干燥得到酸性蛋白酶。本发明所采用纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶组成的复合酶制备原生质体，并通过UV 诱变的方法筛选出的高产酸性蛋白酶菌株，并在最佳优化的固体发酵培养基中发酵培养得 到酸性蛋白酶，发酵液用混合盐析法处理，纯化程度高，得到的产品纯度高，含量高。该方法 操作简单、又节省成本，该法将在酸性蛋白酶的工业化大生产中有良好的应用前景。
权利要求
1.一种酸性蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)诱变处理单孢子悬液制备在斜面培养基上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子，制成 粗制的孢子悬液。将此悬液振荡20min，过滤悬液，制成孢子浓度约IO6个/ml的单孢子悬 液，将孢子悬液涂布于平板培养。将平板培养好的菌丝体用组合酶于室温下处理，过滤离心收集原生质体，并调节原 生质体浓度，用紫外诱变处理。(2)生产菌株的筛选将经诱变后的菌株培养，挑取菌落颜色淡化、形态异常或孢子丰满的菌株，斜面保存。 将菌落初筛获得的变异菌株接种于初始发酵培养基中，摇瓶培养，选取多产酸性蛋白酶的 突变菌株，进行下一步摇瓶复筛。选出酸性蛋白酶产量最高的菌株。(3)酸性蛋白酶的生成将摇瓶筛得到的菌株先经过种子培养，然后转入固体发酵培养基恒温发酵培养。发酵 完毕后抽提后用氯化钠和硫酸铵混合盐析，后经干燥得到酸性蛋白酶。
2.根据权利(1)中的所述斜面培养基为=NaNO30.2%, K2HPO4 0.1%, KCl 0. 05%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 001 %，蔗糖3%，琼脂1. 5%，pH 6. 7 ；斜面平板培养时间为18h，诱 变组合酶为纤维素酶蜗牛酶溶菌酶=0.7% 0.2% 0. 1%，室温处理时间为池； 原生质浓度为106CFU/ml ；紫外诱变处理时间为45s。
3.根据权利O)中所述的初始发酵培养基为麸皮13.0g，豆饼粉4. 0g，蛋白胨1. Og, 酵母膏 1. 5g, NH4NO3 0. 5g, KH2PO4 0. 2g, FeSO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, H209. OmL, pH5. 5。
4.根据权利(3)中所述的种子培养基为麸皮5.36%,KH2PO4 0. 15%,CaCl2 0. 005%； 固体发酵培养基为麸皮17. 79g，豆饼粉4. 53g，KH2PO4 0. 205g, H2O 9. OmL, ρΗ5· 5 ；恒温发 酵温度为30°C，时间为48h ；抽提温度为40°C，氯化钠为0. 2mol/L，硫酸铵为0. 02mol/L。
全文摘要
本发明公开了一种酸性蛋白酶的制备方法。本发明采用复合酶制备原生质体，并通过UV诱变，筛选出的高产酸性蛋白酶菌株，在最佳优化的固体发酵培养基中发酵培养得到酸性蛋白酶液，并用混合盐析法处理得到高纯度的酸性蛋白酶。该方法操作简单、又节省成本，该法将在酸性蛋白酶的工业化大生产中有良好的应用前景。
文档编号C12N9/62GK102071183SQ20091015464
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者吴菁 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司