专利名称：一种新的纳豆激酶制备方法
技术领域：
本发明提供了一种新的纳豆激酶制备方法，涉及微生物发酵法产纳豆激酶。
背景技术：
1987年，日本的Sumi等首先在日本传统食品纳豆中发现并且提取出具有溶解血 栓功能的活性物质——纳豆激酶(nattokinase，NK)。它是目前发现的近200种具有口服 溶纤作用物质中最具潜力的溶纤蛋白酶。近年来，国内外掀起了纳豆激酶的研究和开发热 潮。日本、韩国、朝鲜等多个国家已开始积极开发纳豆激酶产品。根据WHO公布的统计数字，全世界现在患有各种血栓性疾病的患者有1500万之 多，其中每年约有300万患者死亡，同时，这种状况向低龄化发展。所需的溶栓剂的潜在市 场约20亿美元。目前临床注射的抗血栓药物普遍存在着稳定性差、药效短、副作用大和成 本高等缺点，因此，国内外在治疗血栓病方面正趋向于低价高效、易吸收、体内半衰期长以 及可以口服的药物或保健食品的研究。纳豆激酶来源于传统发酵食品，生产工艺简单，无副 作用，安全性高，完全符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求，因此有着很好的应用前景 和广阔的市场。目前大多数公司所生产的纳豆激酶产品既可作为单一制剂又可与其他成分如 S0D、DHA、维生素E、卵磷脂、银杏提取物、蜂蜡等复合制成粉剂、片剂、软硬胶囊或口服液，作 为功能性食品或保健品来食用，具有调节体内免疫系统、促进和改善血液循环以及预防心 脑血管性疾病的作用。但是目前还没有关于临床注射用纳豆激酶产品的报道，因此在提高 纳豆激酶产量以及其分离纯化的生产方面还有待进一步研究。我国对于纳豆激酶的研究开 展的比较晚，相关产品的开发也比较少。因此，研究适宜于规模化的液体或固体发酵工艺条 件，提高纳豆激酶的产量和活性，改进分离纯化工艺，降低其生产成本，是目前国内迫切需 要解决的问题。本发明在传统高产菌株基础上对菌株进行了诱变筛选，得到了一株最优菌 株。对产酶条件进行了优化，确定了一组最优产酶条件，该工艺从工业化角度出发，使生产 成本大大降低，工艺可操作性强，适合规模化生产。
发明内容
1. 一种新的纳豆激酶制备方法，其特征包括以下几个步骤(1)出发菌株的选择和分离首先，从纳豆中挑取表面黏液分离纯化菌株，选择固体黄豆培养基上产生拉丝较 长的菌落，然后通过液体发酵实验培育后用传统的纤维蛋白平板法比较发酵液的产酶能 力，挑选出一株在纤维蛋白平板上产生溶菌圈最大的一株作为出发菌株。(2)菌悬液制备将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基培养24h后，转接入液体种子培养基，于 37°C,200r/min振荡培养12h，离心收集菌体，然后用高温灭菌的生理盐水洗涤3_4次后，转 入三角瓶内振荡，制成菌悬液。
斜面培养基大豆蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0. 5%，琼脂1. 5%，pH7. 2。液体种子培养基大豆蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，葡萄糖1%，NaCl 0. 75%, pH 7. 2，装液量为30mL/100mL三角瓶。(3) LiCl-紫外光照复合诱变纳豆菌对紫外线非常敏感，照射1 致死率就可以达到80%，而根据育种工作者 长期的研究和时间经验，认为较低的杀菌率更有利于正突变产生，所以将紫外线辐照时间 确定为12s。菌悬液在紫外线下辐照1 后，涂布接种于浓度为0.3%的LiCl的分离平板 上。经过初筛和复筛得到一株高产菌株。(4)液体发酵培养复合诱变得到的菌株经过扩大培养后按的接种量转接入液体发酵培养基，于 34PH 7条件下放于200r/min的恒温震荡培养箱中培养48h。发酵培养基2%麦芽糖，4%酵母膏，0.03% CaCl,0. 02% K2HPO4,0. 02% ΚΗ2Ρ04。(5)集成化分离纳豆激酶纳豆激酶发酵液中杂质很多，其中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白 等。采用传统的分离方法需要对发酵液进行预处理，需要经过很多步骤包括离心去除菌体、 有机溶剂沉淀、离心收集沉淀、溶解沉淀、离心收集上清液和离子交换层析等，工作量巨大， 设备占用多，药品消耗大。本发明采用离子交换型扩张床吸附剂对发酵液中的纳豆激酶进 行分离纯化，最后进一步用分子筛凝胶提纯获得纯品纳豆激酶。大大简化了操作步骤，将低 了生产成本，同时又大大减少了环境污染。该法生产纳豆激酶工艺操作比较简单，原材料易得，菌株产酶效率高，生产过程中 无污染，适于工业化生产。
权利要求
1.一种新的纳豆激酶制备方法，其特征包括以下几个步骤(1)出发菌株的选择和分离首先，从纳豆中挑取表面黏液分离纯化菌株，选择固体培养基上产生拉丝较长的菌落， 然后通过液体发酵实验培育后用传统的纤维蛋白平板法比较发酵液的产酶能力，挑选出一 株在纤维蛋白平板上产生溶菌圈最大的一株作为出发菌株。(2)菌悬液制备将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基培养24h后，转接入液体种子培养基，于37°C、 200r/min振荡培养12h，离心收集菌体，然后用高温灭菌的生理盐水洗涤3_4次后，转入三 角瓶内振荡，制成菌悬液。(3)LiCl-紫外光照复合诱变纳豆菌对紫外线非常敏感，照射1 致死率就可以达到80%，而根据育种工作者长期 的研究和时间经验，认为较低的杀菌率更有利于正突变产生，所以将紫外线辐照时间确定 为12s。菌悬液在紫外线下辐照1 后，涂布接种于浓度为0.3%的LiCl的分离平板上。经 过初筛和复筛得到一株高产菌株。(4)液体发酵培养复合诱变得到的菌株经过扩大培养后按的接种量转接入液体发酵培养基，于 34PH 7条件下放于200r/min的恒温震荡培养箱中培养48h。(5)集成化分离纳豆激酶纳豆激酶发酵液中杂质很多，其中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等。采 用传统的分离方法需要对发酵液进行预处理，需要经过很多步骤包括离心去除菌体、有机 溶剂沉淀、离心收集沉淀、溶解沉淀、离心收集上清液和离子交换层析等，工作量巨大，设备 占用多，药品消耗大。本发明采用离子交换型扩张床吸附剂对发酵液中的纳豆激酶进行分 离纯化，最后进一步用分子筛凝胶提纯获得纯品纳豆激酶。大大简化了操作步骤，将低了生 产成本，同时又大大减少了环境污染。
2.如权利要求(1)所诉，其特征在于所选择的固体培养基为黄豆培养基。
3.如权利要求(2)所诉，其特征在于斜面培养基为蛋白胨-牛肉膏培养基，其配比为大 豆蛋白胨 1%，牛肉膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，琼脂 1. 5%, pH7. 2。
4.如权利要求(2)所诉，其特征在于液体种子培养基为大豆蛋白胨1%，牛肉膏 0. 5%，葡萄糖 1%，NaCl 0. 75%, pH 7. 2，装液量为 30mL/100mL 三角瓶。
5.如权利要求(3)所诉，其特征在于采用LiCl-紫外光照复合诱变法处理菌悬悬液。
6.如权利要求(4)所诉，其特征在于使用麦芽糖-酵母膏培养基，其配方为2%麦芽 糖，4%酵母膏，0. 03% CaCl,0. 02% K2HPO4,0. 02% KH2PO4。
7.如权利要求(5)所诉，其特征在于采用离子交换型扩张床吸附剂分离纯化纳豆激 酶，减少了发酵液预处理过程，简化了生产工艺。
全文摘要
本发明提供了一种新的纳豆激酶的生产方法，其步骤包括选择和分离出发菌株后将出发菌株接种于斜面培养基，然后制备菌悬液。菌悬液经过LiCl-紫外光照复合诱变，初筛和复筛后选育得到一株产纳豆激酶优良菌株。该菌株经过放大培养后接入液体发酵培养基培养，培养条件接种量1％于2％麦芽糖，4％酵母膏，0.03％CaCl，0.02％K2HPO4，0.02％KH2PO4培养基，然后在34℃，pH7条件下放于200r/min的恒温震荡培养箱中培养48h。最后，通过离子交换型扩张床吸附剂对发酵液中的纳豆激酶进行分离纯化，进一步用分子筛凝胶提纯获得纯品纳豆激酶。该法生产纳豆激酶工艺操作比较简单，原材料易得，菌株产酶效率高，生产过程中无污染，适于工业化生产。
文档编号C12N9/54GK102071182SQ20091015463
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者史利斌, 吴菁 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司