用于鉴定诱使人皮肤致敏的试剂的分析方法和阵列的制作方法

用于鉴定诱使人皮肤致敏的试剂的分析方法和阵列的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于鉴定能够诱使人皮肤致敏的试剂的体外方法，以及用于该方法中的阵列和分析试剂盒。特别地，该方法包括测量暴露于测试试剂的MUTZ-3细胞中表3A和/或3B中所列生物标记的表达。
【专利说明】用于鉴定诱使人皮肤致敏的试剂的分析方法和阵列
发明领域
[0001]本发明涉及用于鉴定能够诱使人皮肤致敏的试剂的体外方法，以及用于该方法中的阵列和分析试剂盒。
[0002]背景
[0003]过敏性接触性皮炎是影响很大一部分人群的炎性皮肤病。其通常是由针对化学半抗原的免疫应答引起的，给社会造成了相当大的经济负担。目前用于致敏化学品的测试依赖于动物实验。对例如药物和化妆品工业内化学品的注册和使用的新法律已经刺激了相当大的研究努力来研发可替换的用于致敏预测的基于人细胞的试验。目的在于用呈现出更高预测力的体外测试替代动物实验。
[0004]过敏性接触性皮炎(ACD)是常见的炎性皮肤病，其特征在于湿疹和反复的瘙痒发作[I]。该疾病影响了相当大部分的人群，在欧洲有7.2%至18.6%的流行率[2，3]，并且由于重复暴露于致敏化学品，发病率日益增加。A⑶是IV型延迟型超敏性应答，主要在之前暴露的并且免疫上致敏的个体中与小的化学半抗原接触的部位由反应性T辅助I(Thl)和干扰素(IFN) Y产生CD8+T细胞引起[4]。表皮中的树突细胞(DC)通过应答结合自体-分子的半抗原和激活T细胞-介导的免疫性而启动免疫反应。
[0005]REACH (Registration, Evaluation, and Authorisation of Chemicals (化学品的注册、评估和和许可))条例要求欧盟内的所有新的和现有的化学品，涉及大约30000种化学品，应当测试其危险作用[5]。因为潜在致敏剂的鉴定目前需要动物测试，REACH立法将对测试需要的动物数量产生巨大的影响。此外，Cosmetics Directive (化妆品规范)的第7次修改(76/768/EEC)提出了对`用于人使用的大部分化妆品成分的动物测试的禁令，在2009年生效，除了一些测试`到2013年生效。因此，用于测定化学品致敏能力的实验动物的可靠体外替代方法的研发是迫切需要的。迄今为止，没有非动物替代可用于鉴定皮肤致敏化学品，替代地，优选的试验是小鼠局部淋巴结试验(LLNA) [6]，接着是豚鼠最大化测试(GPMT) [7]。这些动物模型的体外替代方法将优选呈现出提高的可靠性、准确性，并且重要地，与人反应性相关。
[0006]通过在先天免疫和获得性免疫之间架起重要的连接，树突细胞(DC)在免疫应答中起着关键作用。在引发时，它们可以快速地产生大量介质，其通过经由抗原递呈微调细胞应答，影响炎性部位的其他细胞的移动和活化，并且选择性地应答各种病原体和环境因子。因此，研发和利用致敏剂刺激过程中DC的免疫判定可以用作预测致敏的有效测试策略。
[0007]然而，不同DC亚群的多层面表型和专门化的功能，及其广泛且不足的分布，是一个复杂的因素，这阻碍了初级DC用作测试平台。因此，对建立准确且可靠的，并且还绕过了与获得DC的可变性和困难相关问题的体外试验存在真实的需求。

【发明内容】

[0008]因此，基于DC功能可预测性的试验研发应当优先依赖于体内DC的可替换细胞类型或模拟物。为此，具有DC特征的细胞系将是有利的，因为其构成稳定的、可再生产的和无限的细胞供应。就DC模拟物而言，分化的骨髓单核细胞MUTZ-3细胞是目前为止优选的候选物[8]。MUTZ-3作为CD34+DC祖代的无限来源，并且在细胞因子刺激时可以获得与未成熟DC或朗格汉斯-样DC相似的表型[9]，通过⑶Id、I和II类MHC递呈抗原，并且诱使特异性T-细胞增殖[8]。用炎性介质刺激时，MUTZ-3还呈现出成熟的转录和表型特征[10]。
[0009]本发明的发明人已经研发了一种用于预测皮肤致敏剂的新测试原理。令人惊讶地发现了使用DC祖细胞(如MUTZ-3细胞)可以准确地鉴定/预测皮肤致敏剂，而在过程中不需要进一步的分化，由此用一组致敏化学品、非致敏化学品和/或其他对照物(例如，只包含稀释剂的载体对照，如DMSO和/或蒸馏水)刺激细胞。发现这很大程度上简化和提高了程序的再现性。
[0010]用全基因组概括分析(genome-wide profiling)测定了对化学刺激的转录应答。从数据分析，鉴定了 200个转录物的生物标记信号，其完全分离了由致敏化学品相比于非致敏化学品和载体对照诱发的转录应答。此外，使用SVM和ROC曲线分析，说明了有效的信号预测力。生物标记信号包括相关生物途径(如DC成熟和细胞因子应答)中涉及的转录物，其可以阐明致敏过程中涉及的分子相互作用。总之，已经鉴定了具有有效预测力的生物标记信号，其表示用于鉴定人致敏化学品的体外试验的令人信服的读出结果。
[0011]因此，本发明的第一个方面提供了用于鉴定能够诱使哺乳动物皮肤致敏的试剂的体外方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤组成:
[0012]a)将树突细胞群或树突样细胞群暴露于测试试剂；和
[0013]b)测量细胞中一种或多种选自表3中限定的生物标记的表达，
[0014]其中步骤(b)中测量的细胞中的一种或多种生物标记的表达表示了测试试剂的致敏作用。
[0015]“能够诱使哺乳动物皮肤致敏的试剂”意思是能够诱使和引发哺乳动物中IV型延迟型超敏反应的任何试剂。优选，IV型延迟型超敏反应是DC-介导的。
[0016]在一个实施方案中，“能够诱使哺乳动物皮肤致敏的试剂”是能够在哺乳动物表皮接触部位诱使和引发IV型延迟型超敏反应的试剂。
[0017]哺乳动物可以是任何驯养或农场动物。优选，哺乳动物是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、马或灵长类动物。最优选，哺乳动物是人。如以上所讨论的，测定致敏的体内方法是本领域已知的。优选的方法是局部淋巴结试验(对于详细内容，参见Basketter，D.A.等，Local lymph node assay-validation, conduct and use in practice.FoodChem Toxicol, 2002.40(5):p.593-8)。再一个合适的但不太优选的方法是豚鼠最大化测试(对于详细内容，参见 Magnusson, B.和 A.M.Kligman, The identification of contactallergens by animal assay.The guinea pig maximization test.J Invest Dermatol，1969.52(3):p.268076)。
[0018]“树突样细胞”意思是呈现出树突细胞特异性的功能和表型特征的非树突细胞，所述特征如形态特征、共同刺激分子和II类MHC分子的表达，以及胞饮大分子和激活静息T细胞的能力。
[0019]在一个实施方案中，树突样细胞是⑶34+树突细胞祖先。任选，⑶34+树突细胞祖先在细胞因子刺激时可以获得通过⑶ld、I和II类MHC递呈抗原的表型，诱使特异性T-细胞增殖和/或用炎性介质刺激时呈现出成熟的转录和表型特征(即，与未成熟树突细胞或朗格汉斯-样树突细胞相似的表型)。
[0020]可以通过功能、通过表型和/或通过基因表达模式，特别是通过细胞表面表型，来识别树突细胞。这些细胞的特征在于其与众不同的形态、高水平的表面II类MHC表达以及将抗原递呈至⑶4+和/或⑶8+T细胞的能力，特别是递呈至原始(na_i_vc) T细胞(Steinman等，(1991), Ann.Rev.1mmunol.9:271)。
[0021]树突细胞的细胞表面是特殊的，具有特征性的面罩样突出物，并且其特征在于细胞表面标记CDllc和II类MHC的表达。大部分DC对于其他白细胞世系的标记是阴性的，所述其他白细胞世系包括T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞和粒细胞。树突细胞的亚群还可以表达其他标记，包括 33D1、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CDla-d、CD4、CD5、CD8 α、CD9、CDllb、CD24、CD40、CD48、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86、CD91、CD117、CD123 (IL3Ra)、CD134、CD137、CD150、CD153、CD162、CXCR1、CXCR2、CXCR4、DCIR、DC-LAMP、DC-SIGN、DEC205、E-钙粘蛋白、Langerin、甘露糖受体、MARCO、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9 和几种凝集素。
[0022]这些细胞表面标记的表达模式可以随着树突细胞的成熟、组织来源和/或物种来源而改变。未成熟的树突细胞表达低水平的II类MHC，但能够内吞抗原蛋白质并将它们加工呈现为与II类MHC分子的复合物。激活的树突细胞表达高水平的11类MHC、ICAM-1和CD86，并且能够刺激原始异源T细胞的增殖，例如，在混合白细胞反应(MLR)中。
[0023]在功能上，通过用于测定抗原递呈的任何方便的试验来鉴定树突细胞或树突样细胞。这样的试验包括测试通过测试抗原递呈刺激抗原引发的和/或原始T细胞的能力，接着测定T细胞增殖，IL-2的释放等等。
[0024]“表达”意思是基因产物(如，mRNA或蛋白质)的水平或含量。
[0025]检测和/或测量蛋白质和/或核酸浓度的方法是本领域技术人员公知的，参见，例如，Sambrook 和 Russ ell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0026]用于检测和/或测量蛋白质的优选方法包括Western印迹、North-Western印迹、免疫吸附试验(ELISA)、抗体微阵列、组织微阵列(TMA)、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射性免疫试验(RIA)、免疫放射性测量试验(IRMA)和免疫酶试验(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹层试验。示例性夹层试验由David等描述于US专利N0.4，376，110和4，486，530中，在此将其引入作为参考。如本领域技术人员公知的，载波片上的细胞的抗体染色可以用于细胞学实验诊断测试中公知的方法中。
[0027]通常，ELISA涉及使用产生有色反应产物的酶，通常在固相试验中。如辣根过氧化物酶和磷酸酶这样的酶已经被广泛使用。扩增磷酸酶反应的一种方法是使用NADP作为底物来产生NAD，其立刻作为用于第二个酶系统的辅酶。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的焦磷酸酶提供了良好的缀合物，因为该酶不存在于组织中，是稳定的，并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶(如荧光素酶)的化学发光系统。
[0028]常常使用与维生素生物素的缀合，因为这可以容易地通过以高特异性和亲和性与其结合的酶联抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链霉素的反应而得到检测。
[0029]用于检测和/或测量核酸(例如,mRNA)的优选方法包括southern印迹、northern印迹、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳阵列、微阵列、大阵列、放射自显影法和原位杂交。[0030]在一个实施方案中，该方法包括将另一群树突细胞或树突样细胞群暴露于不使人类皮肤致敏的阴性对照剂，并且测量细胞中步骤(b)中测量的一种或多种生物标记的表达。因此，步骤(b)中测量的一种或多种生物标记在细胞群中的表达不同于阴性对照样品中的表达表示了事件中的测试试剂的致敏作用。
[0031]在一个实施方案中，阴性对照剂是与本发明的测试或对照剂一起使用的溶剂。因此，阴性对照可以是DMSO和/或蒸馏水。
[0032]在另一个实施方案中，将测试试剂暴露之前树突细胞或树突样细胞中步骤(b)中测量的一种或多种生物标记的表达用作阴性对照。
[0033]再一个实施方案包括将另一群树突细胞或树突样细胞群暴露于使人类皮肤致敏的阳性对照剂并且测量细胞中步骤(b)中测量的一种或多种生物标记的表达。因此，步骤(b)中测量的一种或多种生物标记在细胞群中的表达与阳性对照样品中的表达相似或相同表示了事件中的测试 试剂的致敏作用。
[0034]优选，该方法包括，在步骤(b)中，测量至少一种选自以下的生物标记的表达:
[0035]i)味觉受体，2型，成员5 (TAS2R5)，
[0036]ii)角化细胞生长因子样蛋白1/2/假设蛋白FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)，
[0037]iii)跨膜前后转化蛋白I (TAPTl)，
[0038]iv) sprouty 同系物 2 (SPRY2)，
[0039]V)脂肪酸合成酶(FASN)，
[0040]Vi) B-细胞 CLL/ 淋巴瘤 7A (BCL7A)，
[0041]vii)溶质载体家族 25，成员 32(SLC25A32)，
[0042]viii)铁蛋白，重多肽假基因I (FTHPl)，
[0043]ix) ATPase, H+ 运输，溶酶体 50/57kDa，Vl 亚基 H(ATP6V1H)，
[0044]X)角鲨烯环氧酶(SQLE),和
[0045]xi)组蛋白簇 1，Hle(HISTlHlE)。
[0046]因此，在一个实施方案中，在步骤(b)中测量味觉受体，2型，成员5(TAS2R5)的表达。在进一步的实施方案中，在步骤(b)中，测量了角化细胞生长因子样蛋白1/2/假设蛋白FLJ20444(KGFLP1/2/FLJ20444)的表达。该方法可以包括在步骤(b)中测量跨膜前后转化蛋白I(TAPTl)的表达。在一个实施方案中，该方法包括在步骤(b)中测量sprouty同系物2(SPRY2)的表达。然而，再一个实施方案，方法包括在步骤(b)中测量脂肪酸合成酶(FASN)的表达。该方法可以包括在步骤(b)中测量B-细胞CLL/淋巴瘤7A(BCL7A)的表达。还可以包括在步骤(b)中测量溶质载体家族25，成员32(SLC25A32)的表达。另外可以包括在步骤(b)中测量铁蛋白，重多肽假基因I(FTHPl)的表达。再一个实施方案包括在步骤(b)中测量八了?&86，!1+运输、溶酶体50/571^&，￥1亚基!1(4了?6￥1?)的表达。在另一个实施方案中，步骤(b)包括测量角鲨烯环氧酶(SQLE)的表达。再另一个实施方案中，在步骤(b)中测量了组蛋白簇1，Hle(HISTlHlE)的表达。
[0047]该方法可以包括在步骤(b)中测量至少2种来自表3A的生物标记的表达，或该方法可以由在步骤(b)中测量至少2种来自表3A的生物标记的表达组成，例如，至少3、4、5、
6、7、8、9、10或11种来自表3A的生物标记。在优选的实施方案中，该方法包括在步骤(b)中测量脂肪酸合成酶(FASN)和角鲨烯环氧酶(SQLE)的表达，或该方法由在步骤(b)中测量脂肪酸合成酶(FASN)和角鲨烯环氧酶(SQLE)的表达组成。
[0048]该方法可以另外或替换地包括在步骤(b)中测量至少2种来自表3B的生物标记的表达，或该方法另外或替换地由在步骤(b)中测量至少2种来自表3B的生物标记的表达组成，例如，至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、
76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188，或至少 189 种来自表 3B 的生物标记。
[0049]因此，可以在步骤(b)中测量表3A中的全部生物标记和/或表3B中的全部生物标记的表达。
[0050]在优选的实施方案中，步骤(b)包括测量编码一种或多种生物标记的核酸分子的表达或步骤(b)由测量编码一种或多种生物标记的核酸分子的表达组成。核酸分子可以是cDNA分子或mRNA分子。优选，核酸分子是mRNA分子。
[0051]在一个实施方案中，使用选自Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳阵列、微阵列、大阵列、放射自显影法和原位杂交的方法进行步骤(b)中一种或多种生物标记的表达。优选，使用DNA微阵列测量一种或多种生物标记的表达。
[0052]该方法可以包括使用一种或多种结合部分测量步骤(b)中一种或多种生物标记的表达，每个结合部分能够选择性地结合编码表3中鉴定的生物标记之一的核酸分子。在一个实施方案中，一种或多种结合部分各自包含核酸分子或由核酸分子组成。在进一步的实施方案中，一种或多种结合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或ΡΜ0，或由DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO组成。在一个实施方案中，一种或多种结合部分各自包含DNA或由DNA组成。在一个实施方案中，一种或多种结合部分是5至100个核苷酸长。然而，在可替换的实施方案中，它们是15至35个核苷酸长。
[0053]如以下所讨论的，可以基于结合给定的核酸、蛋白质或氨基酸基序的能力，从文库中选择或筛选合适的结合剂(也称为结合分子)。
[0054]在优选的实施方案中，结合部分包含可检测部分。
[0055]“可检测部分”包括直接或间接允许检测其存在和/或相对量和/或位置(例如，在阵列上的位置)的部分。
[0056]合适的可检测部分是本领域公知的。
[0057]例如，可检测部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分，其暴露于特定条件时，可以检测。这样的荧光部分需要暴露于特定波长和强度的辐射(即，光)，以引起荧光部分的激发，由此使其发出可检测到的可检测特定波长荧光。
[0058]或者，可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化成视觉和/或检测可检测产物的酶。合适的酶的实例将在以下关于，例如，ELISA试验有更详细的讨论。
[0059]因此，可检测部分可以选自:荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。优选，可检测部分包含放射性原子或由放射性原子组成。放射性原子可以选自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、碘-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧_17、憐-32、硫_35、氣、氣、鍊-186、鍊-188和乾_90。
[0060]显然，待测试剂(如，例如，在此所述的测试样品和/或对照样品中的一种或多种生物标记和/或用于检测选定蛋白中的抗体分子)必须具有充足的合适原子同位素，使得可检测部分容易被检测到。
[0061]在可替换的优选实施方案中，结合部分的可检测部分是荧光部分。
[0062]可以以已知的方式将放射性或其他标记结合至本发明方法的样品中存在的生物标记中和/或本发明的结合部分中。例如，如果结合剂是多肽，可以涉及，例如，氟-19替代氢，将其生物合成或可以使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成。如99mTc、1231、186Rh和111In这样的标记，例如，可以通过结合部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。10D0GEN 方法(Fraker 等(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)可以用于结合 1231。参考文献(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(免疫闪烁扫描法中的单克隆抗体)，J-F Chatal,CRC Press, 1989)详细描述了其他方法。用于将其他可检测部分(如，酶、荧光、发光、化学发光或放射性部分)缀合蛋白质的方法是本领域公知的。
[0063]本领域技术人员将认识到待测试样品中的生物标记可以用与测定所述蛋白质的存在、含量和/或位置间·接相关的部分来标记。因此，该部分可以构成多组分可检测部分的一个组分。例如，待测试样品中的生物标记可以用生物素标记，这使得随后可以使用融合或另外结合可检测标记的抗生物素蛋白链菌素来检测。
[0064]在本发明的第一个方面的另一个实施方案中，步骤(b)包括测定一种或多种生物标记的蛋白质的表达。该方法可以包括使用一种或多种各自能够选择性地结合表3中鉴定的生物标记之一的结合部分在步骤(b)中测量一种或多种生物标记的表达。一种或多种结合部分可以包含抗体或其抗原结合片段(如单克隆抗体或其片段)，或可以由抗体或其抗原结合片段(如单克隆抗体或其片段)组成。
[0065]术语“抗体”包括任何合成的抗体、重组抗体或抗体混合物，如但不限于，通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示产生的单链抗体分子，或在本领域技术人员已知的免疫试验形式中能够结合抗原的其他免疫相互作用分子。
[0066]我们还包括使用抗体样结合剂，如亲和体(affibodies)和适配子(aptamer)。
[0067]涉及保持其特异性结合位点的抗体片段合成的技术的概述可以在ffinter&Milstein (1991) Nature349, 293-299 中找到。
[0068]另外，或可替换地，一种或多种第一个结合分子可以是适配子(参见Collett等，2005，Methods37:4-15)。
[0069]分子文库，如抗体文库(Clackson等，1991, Nature352,624-628 ;Marks 等，1991，JMol Biol222 (3):581-97)、肽文库(Smith, 1985, Science228 (4705): 1315-7)、表达的 cDNA文库(Santi等，(2000) J Mol Biol296 (2):497-508)、抗体框架以外的其他支架上的文库，如亲和体(Gunneriusson 等，1999, Appl Environ Microbiol65 (9):4134-40)或基于适配子的文库(Kenan等，1999, Methods Mol Biolll8, 217-31)可以用作从其选择对给定基序特异性的结合分子的来源，用于本发明的方法中。
[0070]可以在原核细胞(Clackson等，1991，前面引用的；Marks等，1991，前面引用的)或真核细胞(Kieke 等，1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96 (10): 5651-6)中在体内表达分子文库，或可以不涉及细胞在体外表达(Hanes&Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad SciUSA94(10):4937-42 ;He&Taussig，1997，Nucleic Acids Res25(24) ;Nemoto 等，1997，FEBSLett,414(2):405-8)。
[0071]在使用基于蛋白质的文库时的情况中，编码潜在结合分子文库的基因常常包装在病毒中，并且潜在结合分子展示在病毒表面上(Clackson等，1991，上文；Marks等，1991，上文;Smith，1985，上文)。
[0072]可能最常用的展示系统是在其表面上展示抗体片段的丝状噬菌体，抗体片段作为与噬菌体的次要外壳蛋白的融合体表达(Clackson等，1991，上文；Marks等，1991，上文)。然而，用于展示的其他合适系统包括使用其他病毒(EP39578)、细菌(Gunneriusson等，1999,上文;Daugherty 等，1998, Protein Engll (9): 825-32 ;Daugherty 等，1999, ProteinEngl2 (7):613-21)，和酵母(Shusta 等，1999，J Mol Biol292 (5): 949-56)。
[0073]此外，已经利用在所谓的核糖体展示系统中的多肽产物与其编码mRNA的连接研发了展不系统(Hanes&Pluckthun, 1997,上文；He&Taussig, 1997,上文；Nemoto 等，1997，上文)，或可替换地，多肽产物与编码DNA的连接(参见US专利N0.5，856，090和W098/37186)。
[0074]抗体的可变重链(Vh)和可变轻链结构域涉及抗原识别，这是通过早期蛋白酶消化实验第一个认可的论据。通过啮齿动物抗体的“人源化”发现了更多的证据。啮齿动物来源的可变结构域可以与人来源 的恒定结构域融合，使得所得到的抗体保持啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison 等(1984) Proc.Natl.Acad, Sc1.USA81,6851-6855)。
[0075]通过可变结构域给予了抗原特异性，并且从涉及抗体片段的细菌表达的实验知道与恒定结构域无关，所有抗体片段含有一个或多个可变结构域。这些分子包括Fab-样分子(Better 等(1988) Science240,1041) ;Fv 分子(Skerra 等(1988) Science240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中Vlj伴侣结构域通过可变形的寡肽连接(Bird等(1988)Science242，423 ；Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85, 5879)和包含分离的 V 结构域的单结构域抗体(dAbs) (Ward等(1989) Nature341, 544)。涉及保持其特异性结合位点的抗体片段合成的技术的概述可以在Winter&Milstein (1991) Nature349，293-299中找到。
[0076]抗体或抗体结合片段可以选自完整的抗体、Fv片段(例如，单链Fv和二硫化物键合的Fv)、Fab_样片段(例如，Fab片段，Fab’片段和F(ab)2片段)、单可变结构域(例如，Vh和\结构域)和结构域抗体(dAbs,包括单和双形式[即，dAb-连接物_dAb])。优选,抗体或抗原结合片段是单链Fv (scFv)。
[0077]一种或多种结合部分可以替换地包含抗体样结合剂或由抗体样结合剂组成，例如，亲和体或适配子。
[0078]“scFv分子”意思是其中Vh和\伴侣结构域是通过可变形寡肽连接的分子。
[0079]使用抗体片段而不是完整抗体的优点有几个方面。较小尺寸的片段可以导致提高的药物特性，如更好的实质组织的渗透。除去了完整抗体的效应物作用，如补体结合。Fab、Fv, ScFv和dAb抗体片段全部可以在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌分泌出来，因此使得可以容易地产生大量的所述片段。
[0080]完整抗体和F(ab’)2片段是“二价的”。“二价”意思是所述抗体和F(ab’)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的,只具有一个抗原结合位点。
[0081]抗体可以单克隆或多克隆的。合适的单克隆抗体可以通过已知技术来制备，例如，“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”(单克隆抗体:技术手册)，H Zola(CRC Press,1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques andapplications”(单克隆杂交瘤抗体:技术与应用)，J G R Hurrell (CRC Press, 1982)中公开的哪些，在此将两篇文献都引入作为参考。
[0082]当潜在的结合分子选自文库时，通常使用具有限定基序的一种或多种选择肽。在用于选择肽的基序的设计中，可以使用提供结构，降低肽可变性或带电荷的、极性或疏水性侧链使其与结合分子相互作用的氨基酸残基。例如:
[0083]⑴脯氨酸可以稳定肽结构，因为其侧链同时结合α碳以及氮；
[0084](ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族侧链并且是高度疏水的，而亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链，并且也是疏水的；
[0085](iii)赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链并且在中性pH下带有正电荷，同时天冬氨酸盐和谷氨酸盐具有酸性侧链，并且在中性PH下带有负电荷；
[0086](iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性pH下是中性的，但含有酰胺基团，其可以参与氢键；
`[0087](V)丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链含有羟基，其可以参与氢键。
[0088]通常，结合分子的选择涉及使用阵列技术和系统来分析与对应于结合分子类型的斑点的结合。
[0089]一种或多种蛋白结合部分可以包含可检测部分。可检测部分可以选自荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶部分。
[0090]在本发明方法的进一步的实施方案中，可以使用包括能够结合一种或多种蛋白质的第二种结合剂的试验来进行步骤(b)，第二种结合剂也包含可检测部分。合适的第二种结合剂如以上关于第一种结合剂详细描述的。
[0091]因此，首先使用第一种结合剂分离和/或固定待测试样品中的目标蛋白质，此后可以使用第二种结合剂测定所述生物标记的存在和/或相对含量。
[0092]在一个实施方案中，第二种结合剂是抗体或其抗原结合片段；通常是重组抗体或其片段。方便地，抗体或其片段选自:scFV;Fab;免疫球蛋白分子的结合结构域。合以上详细描述了适的抗体和片段，及其制备方法。
[0093]或者，第二种结合剂可以是抗体样结合剂，如亲和体或适配子。
[0094]或者，在待测试样品中的蛋白质上的可检测部分包含特定结合对(例如，生物素)或由特定结合对(例如，生物素)组成的情况中，第二种结合剂可以包含特定结合对的complimentary成员(例如,抗生物素蛋白链菌素)或由特定结合对的complimentary成员(例如，抗生物素蛋白链菌素)组成。[0095]在使用检测试验的情况中，优选可检测部分选自:荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。以上描述了用于本发明方法中的合适的可检测部分的实例。
[0096]用于检测血清或血浆蛋白的优选试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(RIA)、免疫放射性测量试验(IRMA)和免疫酶试验(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹层试验。示例性夹层试验由David等描述于US专利N0.4，376，110和4，486，530中，在此将其引入作为参考。如本领域技术人员公知的，载波片上的细胞的抗体染色可以用于细胞学实验诊断测试中公知的方法中。
[0097]因此，在一个实施方案中，试验是ELISA (酶联免疫吸附试验)，其通常涉及使用产生有色反应产物的酶，通常在固相试验中。如辣根过氧化物酶和磷酸酶这样的酶已经被广泛使用。扩增磷酸酶反应的一种方法是使用NADP作为底物来产生NAD，其立刻作为用于第二个酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供了良好的缀合物，因为该酶不存在于组织中，是稳定的，并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶(如荧光素酶)的化学发光系统。
[0098]常常使用与维生素生物素的缀合，因为这可以容易地通过以高特异性和亲和性与其结合的酶联抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链霉素的反应而得到检测。
[0099]在可替换的实施方案中，用于蛋白质检测的试验方便地是荧光试验。因此，第二种结合剂的可检测部分可以是荧光部分，如Alexa荧光团(例如，Alexa-647)。
[0100]优选，使用阵列进行步骤(b)。阵列可以是基于珠子的阵列或基于表面的阵列。阵列可以选自:大阵列；微阵列；纳阵列。
[0101]在一个实施方案中，该方法是用于鉴定能够诱使人皮肤超敏反应的试剂。优选，超敏反应是细胞介导的超敏反应，例如，IV型超敏反应。优选,该方法用于鉴定能够诱发过敏性接触性皮炎(ACD)的试剂(即， 超敏反应是ACD)。
[0102]在一个实施方案中，树突细胞群或树突样细胞群是树突细胞群。优选，树突细胞是初级树突细胞。优选，树突细胞是骨髓树突细胞。
[0103]树突细胞或树突样细胞群优选是哺乳动物来源的。优选，哺乳动物是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、马或灵长类动物。最优选，哺乳动物是人。
[0104]在一个实施方案中，树突细胞群或树突样细胞群是树突样细胞群，优选骨髓树突样细胞群。
[0105]在一个实施方案中，树突样细胞表达至少一种选自⑶54、⑶86、⑶80、HLA-DR、⑶14、⑶34和⑶Ia的标记，例如，2、3、4、5、6或7种标记。在进一步的实施方案中，树突样细胞表达标记 CD54、CD86、CD80、HLA-DR、CD14、CD34 和 CDla。
[0106]在进一步的实施方案中，树突样细胞可以源自骨髓树突细胞。优选，树突样细胞是骨髓白血病衍生的细胞。优选，骨髓白血病衍生的细胞选自KG-1、THP-1、U-937、HL-60、Monomac-6、AML-193和MUTZ-3。最优选，树突样细胞是MUTZ-3细胞。MUTZ-3细胞是人急性骨髓单核细胞白血病细胞，其于1995年5月15日保藏在Deutsche Sammlung fiirMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),(Inhoffenstraβe7B,Braunschweig,德国)(www.dsma.de ;保藏号 ACC295)。
[0107]在一个实施方案中，树突样细胞，用细胞因子刺激后，通过⑶Id、I和II类MHC递呈抗原和/或诱使特异性T细胞增殖。[0108]在一个实施方案中，阴性对照剂选自1-丁醇、4-氨基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、酞酸二乙酯、二甲基甲酰胺、乙基香兰素、甘油、异丙醇、乳酸、水杨酸甲酯、辛酸、丙二醇、苯酚、P-羟基苯甲酸、高锰酸钾、水杨酸、十二烷基硫酸钠、吐温80和硫酸锌。
[0109]该方法包括使用至少2种阴性对照剂(即，非致敏剂)，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或至少 20 种阴性对照剂。
[0110]在另一个实施方案中，阳性对照剂选自2，4-二硝基氯苯、嘴唑酮、重铬酸钾、Kathon CH(MC/MC1)、甲醛、2-氨基酚、2-硝基-1，4-苯二胺、p-苯二胺、己基肉桂醛、2-羟乙基丙烯酸酯、2-巯基苯并噻唑、乙二醛、肉桂醛、异丁子香酚、乙二胺、间苯二酚、肉桂醇、丁子香酚、青霉素G或香叶醇。
[0111]该方法可以包括使用至少2种阳性对照(B卩，致敏剂)，例如，至少3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或至少 20 种阳性对照剂。
[0112]在一个实施方案中，该方法表示测试试剂是否是致敏剂。在可替换的或另外的实施方案中，该方法表示待测试样品的致敏效力。
[0113]在一个实施方案中，该方法表不待测试样品的致敏效力的局部淋巴结试验(LLNA)类别。对于 LLNA 的详细描述，参见 Basketter, D.A.等，Local lymph nodeassay-validation, conduct and use in practice (局部淋巴结试验-实践中的验证、进行和使用).Food Chem Toxicol, 2002.40(5):p.593-8，在此将其引入作为参考。
[0114]在可替换的实施方案中，该方法表示待测试样品的致敏效力的豚鼠最大化分类。对于豚鼠最大化测试的详细描述，参见Magnusson,B.和A.M.Kligman,The identificationof contact allergens by animal assay.The guinea pig maximization test.(通过动物试验鉴定接触性过敏。豚鼠最大化测试)，J Invest Dermatol, 1969.52(3):ρ.268-76,在此将其引入作为参考。
[0115]因此，在一个实施方案中，该方法表示测试试剂是非致敏剂、弱致敏剂、中度致敏齐U、强致敏剂或极端致敏剂。PCA中的判定值和距离与致敏剂效力相关。
[0116]通常，用至少0.55的ROC AUC来确定皮肤致敏剂，例如，用至少0.60,0.65,0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99 或用 1.00 的 ROC AUC。优选，用至少
0.85的ROC AUC确定皮肤致敏剂，并且最优选使用I的ROC AUC。
[0117]通常，使用支持向量机(SVM)来鉴定能够诱使致敏的试剂，如从http://cran.r-pro iect.0rg/web/packages/el071/index, html (例如，e 10711.5—24)可获得的那些。然而,也可以使用任何其他合适的方式。
[0118]支持向量机(SVMs)是一套用于分类和回归的相关监督学习方法。给定一套训练实例，每个标记为属于两个类别中的一个，SVM训练算法构建了一个模型，该模型预测一个新的实例是否落入一个类别或另一个。直观地，SVM模型是实例作为空间点的表示，作图使得分开类别的实例通过尽可能宽的明显间隙分开。然后将新的实例作图于相同的空间中，并基于它们落入间隙的哪一侧来预测属于哪个类别。
[0119]更正式地 ，支持向量机在高的或无限的三维空间中构建了一个超平面或一组朝平面，其可以用于分类、回归或其他任务。直观地，通过与任何类别最近的训练数据点具有最大距离(称为函数间隔(functional margin))的超平面获得了良好的分离，因为通常间隔越大，分类器产生的误差越低。对于SVM的更多信息，参见，例如，Burges，1998，Data Miningand Knowledge Discovery (数据挖掘和知识发现)，2:121-167。
[0120]在本发明的一个实施方案中，在进行本发明的方法前，使用已知试剂的生物标记特征(即，已知的致敏或非致敏剂)“训练” SVM。通过运行这些训练样品，SVM能够知道什么生物标记特征与能够诱使致敏的试剂相关。一旦完成训练过程，那么SVM能够确定测试的生物标记样本是否来自致敏剂或非致敏剂。
[0121]这使得可以将测试试剂归类为致敏或非致敏的。此外，通过用已知效力的致敏剂(即，非致敏、弱、中度、强或极端致敏剂)训练SVM，还可以比较地鉴定出测试试剂的效力。
[0122]然而，通过用必需的训练参数将SVM预先编程，可以绕过这种训练程序。例如，基于表3(A)和I(B)中列出的所有生物标记的测量，使用表5中详细描述的SVM算法，根据已知的SVM参数，来鉴定能够诱使致敏的试剂。
[0123]本领域技术人员将认识到通过用合适选择的数据(即，来自暴露于已知致敏和/或非致敏剂的细胞的生物标记测量)训练SVM机，可以确定表3所列生物标记的任何组合的合适SVM参数。
[0124]优选，本发明的方法具有至少73%的准确率，例如，74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的准确率。
[0125]优选，本发明的方法具有至少73%的灵敏度，例如，74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的灵敏度。
[0126]优选，本发明的方法具有至少68%的特异性，例如，69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 % 或 100% 的特异性。
[0127]“准确率”意思是方法的正确结果的比例，“灵敏度”意思是正确归类为阳性的所有阳性化学品的比例，而“特异性”意思是正确归类为阴性的所有阴性化学品的比例。
[0128]本发明的第二个方面提供了用于本发明的第一个方面的方法(或其任一个实施方案或实施方案的组合)中的阵列，阵列包含如上所限定的一种或多种结合部分。在一个实施方案中，结合部分(总地)能够结合表3A中限定的所有生物标记。在进一步的实施方案中，结合部分(总地)能够结合表3B中限定的所有生物标记。优选，结合部分(总地)能够结合表3A和表3B中限定的所有生物标记。
[0129]结合部分可以是固定的。
[0130]阵列本身在本领域是公知的。通常，它们由在固体支持物表面上形成的具有间隔部件(即，分开)区域(“斑点”)的线性或二维结构构成，每个区域具有有限的范围。阵列还可以是珠子结构，其中通过分子编码或颜色编码鉴定或在连续流中鉴定每个珠子。分析还可以连续进行，其中将样品通过一系列斑点，每个斑点从溶液中吸附一类分子。固体支持物通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管状、珠子、盘状、硅片、微型板、聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜、硝基纤维素膜、尼龙膜、其他多孔膜、非多孔膜(例如，其中包括塑料、聚合物、珀思配克斯有机玻璃、硅)、多个聚合钉或多个微滴定孔，或任何其他适用于固定蛋白质、聚核苷酸和其他合适分子和/或进行免疫试验的表面的形式。结合方法是本领域公知的并且通常由将蛋白质分子、聚核苷酸交联共价结合或物理吸附至固体支持物等组成。或者，可以使用通过亲和性标记物或相似构建体的探针的亲和性耦合。通过使用公知技术，如接触或非接触打印、遮盖或照相平版印刷术，可以限定每个斑点的位置。对于综述，参见Jenkins，R.E.，Pennington, S.R.(2001, Proteomics,2,13-29)和 Lai 等(2002, Drug Discov Todayl5 ；7(18 增补):S143-9)。
[0131]通常，阵列是微阵列。“微阵列”包括具有至少约100/cm2分开区域密度的区域阵列的意思，并且优选至少约1000/cm2。微阵列中的区域具有典型的尺寸，例如，直径，约10-250 μ m，并且以大致相同的距离与阵列中的其他区域分开。阵列可以替换地是大阵列或纳阵列。
[0132]一旦鉴定和分离合适的结合分子(以上讨论的)，本领域技术人员可以使用分子生物领域公知的方法制造阵列；参见以下的实施例。
[0133]本发明的第三个方面提供了一种或多种(优选两种或多种)选自表3A和/或表3B中限定的生物标记结 合用于鉴定超敏反应致敏剂的用途。优选，表3A和表3B中限定的所有生物标记共同用于鉴定超敏反应致敏剂。优选，该用途与本发明第一个方面和在此所述的实施方案中所述的方法相一致。
[0134]本发明的第四个方面提供了用于根据本发明第一个方面的方法中的分析试剂盒，其包含以下物质或由以下物质组成:
[0135]A)根据本发明第二个方面的阵列；和
[0136]B)用于进行根据本发明第一个方面的方法的说明书(任选)。
[0137]分析试剂盒可以包含一种或多种对照剂。优选，分析试剂盒包含以上特征，或由以上特征组成，并与一种或多种阴性对照剂和/或一种或多种阳性对照剂一起。
[0138]优选，现在将参照以下附图，来描述具体表现本发明特定方面的非限制性实例。
[0139]图1.用致敏和非致敏化学品刺激之前的MUTZ-3表型
[0140]⑶14、⑶la、⑶34、⑶54，⑶80、⑶86和HLA-DR的细胞表面表达水平用流式细胞术
测定。设定门控来排除碎片和死细胞，并且通过与相关同种型对照相比来建立象限。结果显示六个代表性实验中的一个。
[0141]图2.用致敏和非致敏化学品刺激后⑶86表达的变化
[0142]用化学品刺激24h后，监控⑶86的细胞表面表达水平。A)⑶86受化学品诱导的上调用流式细胞术来确定，以阳性细胞率的变化来表示，用经2-氨基酚刺激的细胞(右侧点图)和未刺激的对照(左侧点图)的比较来举例说明。结果显示三个代表性实验中的一个。设定门控来排除碎片和死细胞，并且通过与相关同种型对照相比来确定象限。B)刺激24h后CD86阳性细胞率的比较。统计学分析用配对Student’ s检验进行。*p〈0.05，#p〈0.01。NA,未分析。
[0143]图3.化学刺激后差异化表达的转录物的主成分分析
[0144]MUTZ-3细胞经20种致敏化学品和20种非致敏化学品刺激24h后的mRNA水平，用转录组(transcritomics)和Affymetrix Human Genel.0ST阵列测定。结构和基因表达数据集内相似性用软件Qluc0re中的主成分分析(PCA)来研究。A)与非致敏化学品(绿色)相比，用致敏化学品(红色)刺激的细胞中差异化表达的基因的PCA(用单向ANOVA鉴定了1010个基因)。B)与非致敏化学品相比，用致敏化学品刺激的细胞中差异化表达的基因的PCAdOlO个基因)，但现在用刺激时使用的化合物将样品着色。C)用双向ANOVA比较不同刺激时差异化表达的基因的PCA (1137个基因)。按照致敏(红色)和非致敏(绿色)化学品将样品着色。D)用双向ANOVA比较不同刺激时差异化表达的基因的PCA(1137个基因)，但现在用刺激时使用的化合物将样品着色。P，ANOVA的P-值。Q，为多重假设测试而校准的P-值。
[0145]图4.“预测信号(Predication Signature) ” 的鉴定和 PCA 分析
[0146]A)用致敏化学品刺激的细胞相比于用非致敏化学品刺激的细胞而言差异化表达显著的基因的数目(1010个基因)用后向消除法(Backward Elimination)减少。在消除810个分析物后观察到了最低的KLD，称为断点(Breakpoint)。剩余的200个基因被视为该数据集内的顶尖预测剂，称为“预测信号”。B)通过“预测信号”的PCA，观察到了致敏剂(红色)和非致敏剂(绿色)之间的彻底分离。C)与B中相同的PCA，现在使用按LLNA效力着色的样品。
[0147]图5.“预测信号”选择程序的确认
[0148]创建“预测信号”的方法通过从所述数据集随机选出70%进行重复来确认。用剩余的30%数据作为信号确认的测试集。A) PCA证实“测试基因信号(Test Gene Signature)”可以分出致敏剂和非致敏剂。用仅仅70%训练集的样品(呈现出亮色)架构由头三种主成分组成的空间。基于“测试基因信号”中的分析物的表达水平，将呈现出暗色的测试集样品标示于该空间中。B)基于70%训练集来训练SVM，用30%测试集予以验证。ROC曲线1.0以下的面积证明，对测试集中所有样品的组归属的预测是正确的，这说明“测试基因信号”是很有力度的，也说明关联后 我们的“预测信号”是很有力度的。
[0149]图6.“预测信号”的相互作用组(interactome)
[0150]200个分子(橙色)与按IPA证据连接各个点(theses)的分子的相互作用组。直接相互作用显示为实线，间接相互作用显示为点线。
实施例
[0151]过敏性接触性皮炎是影响很大一部分人群的炎性皮肤病。其通常是由针对化学半抗原的免疫应答引起的，给社会造成了相当大的经济负担。目前用于致敏化学品的测试依赖于动物实验。有关药物和化妆品等行业内化学品的注册和使用的新立法刺激了显著的研究热情，来研发可替换的基于人类细胞的试验进行致敏性的预测。其目的在于用呈现出更高预测力的体外测试替代动物实验。
[0152]我们研发了用于预测致敏化学品的新的基于细胞的试验。通过分析用20种不同的致敏化学品、20种非致敏化学品和载体对照刺激24h后人细胞系MUTZ-3的转录组(trasncriptome)，我们已经鉴定出具有有效辨别能力的200个基因的生物标记信号。使用用于监督分类的支持向量机(Support Vector Machine),试验的预测性能揭示了 100%的准确率、100%的灵敏度和100%的特异性。此外，按LLNA试验对化学品进行分类，该基因信号也可以预测效力。所鉴定的这些标记涉及多个具有免疫相关功能的生物途径，这有助于了解人类致敏的过程。
[0153]用体外人细胞系预测致敏性的基因信号已研发出来。这种简便且强效的基于细胞的试验可以完全替代或大大减少现有的使用实验动物的测试系统。基于人类生物学，该试验被认为对于预测人的致敏性比传统的基于动物的测试更相关且更准确。
[0154]结果
[0155]体外细胞培养系统的细胞学原理(cellular rational)
[0156]作为先天免疫和获得性免疫之间的连接，DC是免疫系统基本的免疫调节细胞。它们特有的识别抗原以启动T细胞应答的特性，以及它们在偏移免疫应答方面的强力调节功能，使得它们成为试验研发的目标。然而，初级DC构成不适于筛选的异源小细胞群。使用有多个相比于初级DC的特征的细胞系作为预测性测试的基础，明显的优势是细胞的稳定性、繁殖能力和无限制的供应。迄今为止，尚无具有明显DC样特性的白血病的报道，可能是由于这类细胞的特征由仅见于细胞分裂之后的复杂末端分化过程来决定[11]，并且因此，DC-样细胞系的产生依赖于可获得的髓系白血病细胞系。MUTZ-3是人类急性骨髓单核细胞白血病细胞系，具有分化成DC、呈递抗原以及诱导特异性T-细胞增殖的潜力。在现有多个髓系人细胞系中，MUTZ-3是到目前为止的优选候选者。与未成熟的初级DC相似，MUTZ-3祖先表达⑶la、HLA-DR和⑶54，以及低水平的⑶80和⑶86 (图1)。MUTZ-3群还包含三个亚群:CD14+、⑶34+和双阴性细胞，之前报道是从增殖性⑶34+祖先向非增殖性⑶14+DC祖先过渡的分化步骤[9]。因此，我们利用了组成型分化的祖先MUTZ-3细胞作为测试系统的基础。
[0157]应答致敏剂刺激的CD86表面表达:CD86是迄今为止在细胞系统中得到最广泛研究的用于致敏的生物标记，所述细胞系统如单核细胞衍生的树突细胞(MoDCs)或树突细胞样人类细胞系及其祖先，如THP-1、U-937和KG-1。因此，作为参照，⑶86的细胞表面表达用流式细胞术进行了测量，这是在用20种致敏剂和20种非致敏剂以及用载体对照(表I)刺激24h后。⑶86在用以下物质刺激的细胞表面显著上调:2_氨基酚、KathonCG,2-硝基-1，4-苯二胺、2，4-二硝基氯 苯、2-轻乙基丙烯酸酯、肉桂醒(cinnamic aldehyde)、p-苯二胺、间苯二酚和2-巯基苯并噻唑。这样一来，基于单种生物标记(如CD86)测量的试验将获得47%的灵敏度和100%的特异性。结果是，使用基于细胞(如MUTZ-3)的系统，CD86不能将皮肤致敏剂分类。
[0158]化学刺激的MUTZ-3细胞中转录谱的分析:使用基因组表达阵列来测试20种致敏剂(一式三份)、20种非致敏剂(一式三份)、以及载体对照(如DMSO和蒸馏水，一式十二份)。总之，基于144个样本产生了数据集。对样品进行RMA标准化和质量控制发现，嗔唑酮和肉桂醛样品是明显的异常值(outlier)，必须去除，否则它们在数据集中占优势，妨碍生物标记的鉴定(数据未显示)。此外，高锰酸钾重复中的一个因阵列有误而必须除去。留下了由137个样本组成的数据集，每个具有来自33，297个转录物的测量的数据。为了采集数据集中关于致敏剂相比于非致敏剂的专门信息，使用了软件Qlucore Omics Explore2.1,其能够进行实时主成分分析(PCA)，同时基于ANOVA P-值选择，将输入的基因分拣至所需标准(例如，致敏剂和非致敏剂)后。图3A和3B显示了基于1010个转录物的PCAs，其ANOVA分析的P值< 2.0X 10_6，是致敏相比于非致敏化学品的比较。如图3A所示，两组之间有明显区别，非致敏剂在图的较低部分形成密集云团(绿色)，致敏剂以各种方向向上伸展(红色)。然而，在该显著性水平下，两组之间未实现完全分离。图3B根据刺激进行着色，可看出，乙二醛、丁子香酚、己基肉桂醛、异丁子香酚、间苯二酚、青霉素G和乙二胺组中的一个或多个重复与对照组在一起。此外，非致敏剂吐温80、辛酸和苯酚的一个或多个重复趋于与致敏剂在一组。图3C和3D显示了基于1137个基因的PCA图，当比较不同刺激时，全部都具有<7.0X 10_21的P值。在该显著水平鉴定如此大量基因，充分说明该数据集的能力强大。在图3D中，清楚看到多个重复集合在一起，表明是高质量的数据。重铬酸钾的三个重复样本具有离散的图谱，表明与非致敏剂相比对细胞的实质性影响。此外，2-羟乙基丙烯酸酯、2-氨基酚、Kathon CG、甲醛、2-硝基-1，4-苯二胺、2，4- 二硝基氯苯甲酸、p_苯二胺、2-巯基苯并噻唑、肉桂醇和间苯二酚具有集合在一起、与阴性组分开的重复。如图3C和3A所示，用1010和1137个基因的基因信号分别都未实现完全分离。
[0159]后向消除法鉴定出最有辨别力的基因:即使数据集含有P-值低至1X10_17的基因，降低P-值截留值仍不能实现致敏剂和非致敏剂之间的完全分离。全部基于P-值选出的基因信号未能提供最可能的预测力，因为低P-值不保证基因提供任何其他信息。为了进一步降低用于预测性生物标记信号的转录物的数量，我们使用了后向消除算法(图4A)。该算法一个一个地除去基因，同时不仅考虑基因单独的影响，还考虑它们怎样与全部的选定基因信号共同发挥作用。对于每个被消除的基因，降低Kullback-Leibler离散(Kullback-Leibler divergence, KLD)值,直至达到断点,在该点,还剩余200个基因。在该点继续消除基因，导致KLD再次升高，表明信息正在丢失(图4A)。因此，选择具有最低KLD值的200个基因用于进一步分析。200个分析物的PCA揭示，它们具有完全分离致敏剂和非致敏剂的能力，表明这些转录物可以用作未知样品的致敏特性的预测剂(图4B)。重要的是，将PCA中的多个样本根据LLNA按其效力进行着色，表明可以用这些基因预测效力(图4C)。将这200个基因称为“预测信号”，它们的特性列于表3中。
[0160]用于鉴定预测信号的分析方法的确认:为了确认我们的信号的预测力，我们使用了称为支持向量机(SVM)的监督学习法[12]，其将来自训练集的数据在空间中作图，以便使致敏化学品和非致敏化学品所致基因表达的分离最大化。作为训练集，随机选择数据集的70%，并重复整·个选择过程(如上所述)。从29，141个转录物开始，使用ANOVA过滤和后向消除，将信号减少至200个转录物，称为“测试基因信号”。用数据集的剩余30%测试所得信号。以分层次的随机方式，将数据集分成子集:70%训练数据集和30%测试数据集，这意味着，两个子集中都保留有该完整数据集中的致敏剂和非致敏剂部分，但两个子集任一个中包括的样本是随机选择的。此后，用“测试基因信号”训练含训练集的SVM模型，用测试集评估该模型的预测力。图5A显示了基于“测试基因信号”和测试集样本的PCA图。显然，致敏剂(红色)和非致敏剂(绿色)之间的分离情形与图4B中“预测信号”的观察结果相似。在图5A的PCA中，测试集的致敏和非致敏化学品样本已分别着深红色和深绿色，表示它们不能为绘图的主成分出力，而仅仅是基于选定的“测试基因信号”的表达值来作图。如所看到的，来自测试集的致敏剂与来自训练集的致敏剂集合在一起，而来自测试集的非致敏剂与来自训练集的非致敏剂集合在一起。这是非常直观的预测了测试集中样本的组归属方式，只需要使用眼睛进行模式识别。SVM训练和确认的结果可见于图5B，其中数值I的ROC曲线下面积证实了“测试基因信号”预测测试集中的样本属于哪一组的能力。该试验的预测性能显示出96%的准确率、100%的灵敏度和92%的特异性。尽管该实验没有证实“预测信号”本身的预测力，但确实证实了选出“预测信号”所用的方法，支持了 “预测信号”能够准确预测未知样本的致敏特性的主张。
[0161]“预测信号”的分子功能和规范途径[0162]使用Ingenuity Pathways Analysis (IPA, Ingenuity Systems Inc.),表征了所述信号中200个分子之184个的功能和已知(规范)途径。剩余的16个分子未能作图至任何IPA入口(entries)。所鉴定的优势功能是小分子生物化学(38个分子)、细胞死亡(33)、月旨质代谢(24)、血液系统发育(19)、细胞生长和增殖(16)、分子转运(15)、细胞周期(15)和碳水化合物代谢(15)，详见表4。184个分子中的67个涉及所列功能。在剩余的117个分子中，30个已知来自各种人类疾病和分子功能，如所述的生物标记(SCARB2、RFC2、VPS37A和BCL7A)和药物靶(ABAT)。这些分子中的大部分是代谢标记。在作为整体的信号中，存在几个药物靶，如 HMGCR、HMOXl、ABAT、RXRA、CD33、MAP2K1、MAPK13 和 CD86。两个描述为用于皮肤疾病:⑶86 (牛皮癣)和RXRA (湿疹)。该信号还包含皮肤发育标记(DHCR24)和树突细胞标记(MAP2K1、NLRP12 和 RFC2)。
[0163]可能被所述信号中多个分子引发的途径也用IPA进行了研究。最密集的是:NRF2介导的氧化应答(10)、异型生物质(xenobiotic)代谢信号传导(8)、LPS/IL-1介导的对RXR功能的抑制(6)、芳烃受体信号传导(6)和蛋白激酶A信号传导(6)。这些途径中五个最高等级的途径全部已知参与由外源物质，异型生物质引起的反应。异型生物质是相对于人体而言外源的天然或合成的化学化合物。
[0164]结论
[0165]过敏性接触性皮炎(ACD)是由对过敏原失调的获得性免疫应答引起的炎性皮肤病[13]。小分子量化学品，称为半抗原，可以结合皮肤中的自体蛋白，其能够通过皮肤树突细胞(DC)将蛋白质结合的过致敏学品内在化。DC，在局部微环境的影响下，加工蛋白质-半抗原复合物，移动至局部淋巴结并激活幼稚T细胞。过敏原特异性应答的启动和发展，主要是效应物CD8+T细胞和Thl细胞，以及免疫调节蛋白的产生，是ACD中观察到的免疫活动的特点。这种T-细胞介导的IV型超敏反应的特征在于诸如皮疹、水泡和瘙痒之类的症状。ACD是人体中观察到的免疫毒性的最常见表现[13]，上百种化学品已经显示出引起皮肤致敏[14]。即使已经进行了密集的`研究尝试来鉴定针对过致敏学品的免疫应答，但致敏中涉及的驱动因子和分子机理仍然是未知的。REACH立法要求所有超过I吨/年生产的化学品要测试其有害特性，如毒性和致过敏性[5]，这增加了对用于预测力的准确试验的需求。目前，潜在的人致敏剂的鉴定依赖于动物实验，特别是小鼠局部淋巴结试验(LLNA) [6]。LLNA是基于化学暴露后小鼠的引流淋巴结中诱发的增殖的测量[15]。如果与对照相比，它们引起增殖三倍的增加，则将化学品限定为致敏剂，并且该增加所需的化学品含量为EC3值。因此，基于致敏效力，LLNA还可以用于将化学品归类。然而，LLNA在许多方面不是最佳的。除了明显的伦理原因以外，该试验还是费时和昂贵的。人类致敏数据常常源于人类最大化测试(HMT) [16]和人类斑贴测试(HPT) ο 在来自 Interagency Coordinating Committee onthe Validation of Alternative Methods (ICCVAM)的大量报告中，将 LLNA 的性能特征与其他可用的基于动物的方法和人致敏数据(HMT和HPT)相比较[17]。与人数据(74个测定值)相比，LLNA性能显示出72%的准确率、72%的灵敏度和67%的特异性。准确率定义为一种方法的正确结果的比例，“灵敏度”是所有阳性化学品中正确归类为阳性的比例，而“特异性”是所有阴性化学品中正确归类为阴性的比例。因此，存在明显的需求来研发更可靠的用于致敏的测试方法。此外，Cosmetics Directive (化妆品规范)的第7次修改(76/768/EEC)提出了当科学的可靠方法可用时，使用用于化妆品成分的动物测试的全面禁令在2013年生效。因此，行业内对基于人细胞的可靠预测测试方法存在很大的需求。涉及致敏的各种人细胞系和初级细胞已作为预测测试系统进行了评价，如上皮细胞、树突细胞和T细胞，然而目前没有经证实的测试试验可用。已经表明各种单个生物标记在用致敏化学品刺激时上调，如 CD40、CD80、CXCL8、IL-1 β、MIP-1 β、p38MAPK，如[18]中概述的，然而，其中没有一个在单独时具有区分致敏和非致敏化学品的预测力。⑶86是这些标记中得到最广泛研究的；然而，在我们的试验中对该标记表达水平的测定只是相关，但不足以作为用于致敏的读数(图2)。19种致敏化学品中只有9种诱使了⑶86的显著上调。替代地，我们坚信多个生物标记信号的分析优于任何单个生物标记。我们因此利用完整基因组转录组学的力量，筛选了由一大组成分明确的化学品和对照品诱导的基因调控。在MUTZ-3细胞中，经ANOVA鉴定出，用致敏化学品刺激相比于用非致敏对照有差异化表达的大量基因(图3)，这表明MUTZ-3真正具有区分这两组的能力，因此是用于致敏的体外试验的合适细胞系统。已有多项努力旨在在诸如CD34+祖先细胞衍生的DC等多种细胞系统中形成基于全基因组分析的试验[19-21]。尽管这样的试验可能提供了类似体内的环境，但仍会有人认为，初级细胞不是非常适于这种高商业兴趣的试验。此外，在这样的系统中需要考虑伦理方面。此外，之前依赖于全基因组分析的用于致敏的体外试验研发使用了非常有限组的测试化合物。迄今为止，本研究是在该领域内进行的最大研究，利用了 20种阳性和20种阴性的训练化合物。我们尝试将这些训练化合 物分成两组，分别用于训练和测试。尽管这些实验导致了成功的预测(数据未显示)，但我们的经验是，致敏化合物在它们诱导的基因表达谱方面有很大不同，见图3D。从这方面看，当鉴定我们的“预测信号”时，我们希望包括尽可能多的训练化合物。因此，我们没有将任何化合物排除在验证之外。反而是，我们通过将样本进一步随机细分成训练集和测试集，用未见过的数据进行证实，验证了鉴定出“预测信号”的这种方法，见图5。通过包括具备广泛多种反应机制和致敏效力的所有致敏化合物，我们主张，我们已经鉴定出非常适于预测未知样本的致敏特性的预测信号。值得注意的是，我们的“预测信号”能够预测致敏化合物(如经LLNA确定的那些)的效力，可参见图4C。然而，LLNA的预测效力与我们的分类法的并非对所有样本都匹配。尤其，中度致敏剂2-羟乙基丙烯酸酯显示出在基因表达谱方面与强致敏剂和极端致敏剂的强烈相似性。同样，中度致敏剂乙二胺、己基肉桂醛和乙二醛与弱致敏剂归在一组。这些发现强烈暗示:致敏效力的定义可能需要修正。我们主张，我们的“预测信号”可以用于这样的分类。
[0166]总之，我们提供了一种体外试验，其基于具有经鉴定的由200个基因组成的“预测信号”的MUTZ-3细胞系统，能将样本正确地归类为致敏剂或非致敏剂。此外，该试验可以预测致敏化合物的效力，并且可以用于修正这样的分类。
[0167]材料和方法
[0168]化学品
[0169]使用了由20种致敏剂和20种非致敏剂组成的一组化学品用于细胞刺激。致敏
剂是2，4-二氯甲苯、肉桂醛、间苯二酚、嘴唑酮、乙二醛、2-巯基苯并噻唑、丁子香酚、异丁
子香酚、肉桂醇和P-苯二胺、甲醛、乙二胺、2-羟乙基丙烯酸酯、己基肉桂醛、重铬酸钾、青霉素G、Katchon CG(MCI/MI)、2_氨基酚、香叶醇和2-硝基-1，4-苯二胺(表I)。非致敏剂是十二烷基硫酸钠、水杨酸、苯酚、甘油、乳酸、氯苯、P-氢苯甲酸、苯甲醛、酞酸二乙酯和辛酸、硫酸锌、4-氨基苯甲酸、水杨酸甲酯、乙基香兰素、异丙醇、二甲基甲酰胺、1-丁醇、高锰酸钾、丙二醇和吐温80 (表I)。所有化学品来自Sigma-Aldrich，St.Louis, MO, USA。将化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)或蒸馏水中。在刺激之前，用碘化丙啶(PI)按说明书(BDBiosciences, San Diego7CA)监控所有化合物的细胞毒性。受刺激的细胞的相对活力如下计算
【权利要求】
1.鉴定能诱导哺乳动物皮肤致敏的试剂的体外方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤组成: a)将树突细胞群或树突样细胞群暴露于测试试剂；和 b)测量所述细胞中一种或多种选自表3的生物标记的表达； 其中，步骤(b)中测量的一种或多种生物标记在所述细胞中的表达指示待测试样品的致敏作用。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括将另一群树突细胞或树突样细胞暴露于不使人类皮肤致敏的阴性对照剂、并测量一种或多种在步骤(b)中测量的生物标记在这些细胞中的表达。
3.根据权利要求1的方法，进一步包括将另一群树突细胞或树突样细胞群暴露于使人类皮肤致敏的阳性对照剂、并测量一种或多种在步骤(b)中测量的生物标记在这些细胞中的表达。
4.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量至少一种选自以下的生物标记的表达: i)味觉受体，2型，成员5 (TAS2R5), ?)角化细胞生长因子样蛋白1/2/假设蛋白FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)， iii)跨膜前后转化蛋白I(TAPTl)，
iv)sprouty 同系物 2 (SPRY2)， V)脂肪酸合成酶(FASN)， vi)B-细胞 CLL/ 淋巴瘤 7A(BCL7A)， vii)溶质载体家族25，成员32(SLC25A32)， viii)铁蛋白，重多肽假基因I(FTHPl)， ix)ATPase, H+ 运输，溶酶体 50/57kDa，Vl 亚基 H(ATP6V1H)， X)角鲨烯环氧酶(SQLE)JP xi)组蛋白簇 1，Hle(HISTlHlE)。
5.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量味觉受体，2型，成员5 (TAS2R5)的表达。
6.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量角化细胞生长因子样蛋白1/2/假设蛋白 FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)的表达。
7.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量跨膜前后转化蛋白I (TAPTl)的表达。
8.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量sprouty同系物2(SPRY2)的表达。
9.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量脂肪酸合成酶(FASN)的表达。
10.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量B-细胞CLL/淋巴瘤7A (BCL7A)的表达。
11.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量溶质载体家族25，成员.32 (SLC25A32)的表达。
12.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量铁蛋白，重多肽假基因I (FTHPl)的表达。
13.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量ATPase，H+运输，溶酶体50/57kDa, Vl 亚基 H(ATP6V1H)的表达。
14.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量角鲨烯环氧酶(SQLE)的表达。
15.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量组蛋白簇1，Hle(HISTlHlE)的表达。
16.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量至少两种来自表3A的生物标记的表达或步骤(b)由测量至少两种来自表3A的生物标记的表达组成，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10或11种来自表3A的生物标记。
17.根据 之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量至少两种来自表3B的生物标记的表达或步骤(b)由测量至少两种来自表3B的生物标记的表达组成，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188，或至少 189 种来自表 3B 的生物标记。
18.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量表3A中的所有生物标记的表达或步骤(b)由测量表3A中的所有生物标记的表达组成。
19.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量表3B中的所有生物标记的表达或步骤(b)由测量表3B中的所有生物标记的表达组成。
20.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量表3A和表3B中的所有生物标记的表达或步骤(b)由测量表3A和表3B中的所有生物标记的表达组成。
21.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括测量编码一种或多种生物标记的核酸分子的表达。
22.根据权利要求21的方法，其中核酸分子是cDNA分子或mRNA分子。
23.根据权利要求21的方法，其中核酸分子是mRNA分子。
24.根据权利要求22或23的方法,其中使用选自Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳阵列、微阵列、大阵列、放射自显影法和原位杂交的方法进行步骤(b)中一种或多种生物标记表达的测量。
25.根据权利要求22-24任一项的方法，其中使用DNA微阵列测定了步骤(b)中一种或多种生物标记表达的测量。
26.根据之前任一项权利要求的方法，其中使用一种或多种结合部分进行了步骤(b)中一种或多种生物标记表达的测量，每个结合部分能够选择性地结合编码表3中鉴定的生物标记之一的核酸分子。
27.根据权利要求26的方法,其中一种或多种结合部分各自包括核酸分子或由核酸分子组成。
28.根据权利要求27的方法，其中一种或多种结合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA 或 PMO 或由 DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA 或 PMO 组成。
29.根据权利要求27或28的方法，一种或多种结合部分各自包含DNA或由DNA组成。
30.根据权利要求27-29任一项的方法，其中一种或多种结合部分是5至100个核苷酸长。
31.根据权利要求27-30任一项的方法,其中一种或多种核酸分子是15至35个核苷酸长。
32.根据权利要求25-31任一项的方法，其中结合部分包含可检测部分。
33.根据权利要求32的方法,其中可检测部分选自:突光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。
34.根据权利要求33的方法，其中可检测部分包含放射性原子或由放射性原子组成。
35.根据权利要求34的方法，其中放射性原子选自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、鹏-111、氣-19、碳-13、氣-15、氧-17、憐-32、硫 _35、氣、氣、鍊-186、鍊-188 和?乙-90。
36.根据权利要求33的方法，其中结合部分的可检测部分是荧光部分。
37.根据权利要求1至21任一项的方法，其中步骤(b)包括测量一种或多种生物标记的蛋白的表达。
38.根据权利要求37的方法，其中使用一种或多种结合部分进行了步骤(b)中一种或多种生物标记表达的测量，各个结合部分能够选择性地结合表I中鉴定的生物标记之一。
39.根据权利要求37的方法，其中一种或多种结合部分包含抗体或其抗原结合片段或由抗体或其抗原结合片段组成。
40.根据权利要求39的方法，其中抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。
41.根据权利要求39或40的方法，其中抗体或抗原结合片段选自完整的抗体、Fv片段(例如，单链Fv和二硫化物键合的Fv)、Fab-样片段(例如，Fab片段，Fab’片段和F(ab)2片段)、单可变结构域(例如，Vh和 '结构域)和结构域抗体(dAbs，包括单和双形式[即，dAb-连接物-dAb])。
42.根据权利要求41的方法，其中抗体或抗原结合片段是单链Fv(scFv)。
43.根据权利要求39的方法，其中一种或多种结合部分包括抗体样结合剂或由抗体样结合剂组成，例如亲和体或适配子。
44.根据权利要求38至43任一项的方法，其中一种或多种结合部分包含可检测部分。
45.根据权利要求44的方法,其中可检测部分选自突光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶部分。
46.根据之前任一项权利要求的方法，其中使用阵列进行了步骤(b)。
47.根据权利要求46的方法，其中阵列是基于珠子的阵列。
48.根据权利要求47的方法，其中阵列是基于表面的阵列。
49.根据权利要求46至48任一项的方法，其中阵列选自:大阵列；微阵列；纳阵列。
50.一种用于根据之前任一项权利要求的方法中的阵列,该阵列包含如权利要求26至36和38至45任一项中限定的一种或多种第一种结合剂。
51.根据权利要求50的阵列，其包含总地能够结合表I中的所有生物标记的结合剂。
52.根据权利要求50或51的阵列，其中第一种结合剂是固定的。
53.根据之前任一项权利要求的方法，用于鉴定能够诱发人皮肤超敏反应的试剂。
54.根据之前任一项权利要求的方法，其中超敏反应是细胞介导的超敏反应。
55.根据权利要求48的方法，其中超敏反应是IV型超敏反应。
56.根据之前任一项权利要求的方法，用于鉴定能够诱发过敏性接触性皮炎(AOT)的试剂。
57.根据之前任一项权利要求的方法，其中树突细胞群或树突样细胞群是树突样细胞群。
58.根据权利要求57的方法，其中树突样细胞是骨髓树突样细胞。
59.根据权利要 求58的方法，其中骨髓树突样细胞源自骨髓树突细胞。
60.根据权利要求59的方法，其中源自骨髓树突细胞的细胞是骨髓白血病衍生的细胞。
61.根据权利要求60的方法，其中骨髓白血病衍生的细胞选自KG-1、THP-UU-937、HL-60、Monomac-6、AML-193 和 MUTZ-3。
62.根据之前任一项权利要求的方法，其中树突样细胞是MUTZ-3细胞。
63.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(e)中提供的对照非致敏剂选自1-丁醇、4-氨基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、酞酸二乙酯、二甲基甲酰胺、乙基香兰素、甘油、异丙醇、乳酸、水杨酸甲酯、辛酸、丙二醇、苯酚、对羟基苯甲酸、高锰酸钾、水杨酸、十二烷基硫酸钠、吐温80和硫酸锌。
64.根据权利要求63的方法，其中提供至少2种对照非致敏剂，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少 20 种对照非致敏剂。
65.根据之前任一项权利要求的方法，其中步骤(i)中提供的对照致敏剂选自2，4-二硝基氯苯、jtS唑酮、重铬酸钾、Kathon CH(MC/MC1)、甲醛、2-氨基酚、2-硝基-1，4-苯二胺、对苯二胺、己基肉桂醛、2-羟乙基丙烯酸酯、2-巯基苯并噻唑、乙二醛、肉桂醛、异丁子香酚、乙二胺、间苯二酚、肉桂醇、丁子香酚、青霉素G或香叶醇。
66.根据权利要求65的方法，其中提供至少2种对照致敏剂，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少 20 种对照致敏剂。
67.根据之前任一项权利要求的方法，其中该方法表示待测试样品的致敏效力。
68.根据权利要求67的方法，其中该方法指示待测试样品的致敏效力的局部淋巴结试验(LLNA)类别。
69.—种用于根据之前任一项权利要求的方法中的阵列，该阵列包含一种或多种如权利要求26至36或38-45中所限定的结合部分。
70.根据权利要求69的阵列，其中结合部分能够结合表3A中的所有生物标记。
71.根据权利要求70的阵列，其中结合部分能够结合表3B中的所有生物标记。
72.根据权利要求50-52任一项的阵列，其中结合部分能够结合表3A和表3B中的所有生物标记。
73.根据权利要求50-52任一项的阵列，其中结合部分是固定的。
74.两种或多种选自表3A或表3B中的生物标记结合用于鉴定超敏反应致敏剂的用途。
75.根据权利要求74的用途，其中表3A和表3B中的所有生物标记总地用于鉴定超敏反应致敏剂。
76.一种用于根据权利要求1至68任一项的方法中的分析试剂盒，其包含: A)根据权利要求69至73任一项的阵列；和 B)用于进行权利要求1至68任一项中限定的方法的说明书(任选)。
77.根据权利要求76的分析试剂盒，进一步包含一种或多种对照样品。
78.根据权利要求77的分析试剂盒，包含一种或多种非致敏剂。
79.根据权利要求77或权利要求78的分析试剂盒，包含一种或多种致敏剂。
80.基本上如本文中所述的方法或用途。
81.基本上如本文中 所述的阵列或试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103429756SQ201180062886
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月26日 优先权日:2010年10月26日
【发明者】M.林德斯泰特, C.A.K.伯莱拜克, H.乔汉森, A-S.阿尔布雷克特 申请人:森扎基因有限责任公司