sittingdropmethod)进 行养晶。找出适当的养晶条件后，再进而从其条件进行调整修正，例如：调整不同的盐类 及沉淀剂浓度，以找到最佳的养晶条件后，利用X-ray获得绕射图谱，最后利用分子置换法 (molecularreplacementmethod)，并经由计算机运算之后解出ManBK蛋白立体结构。
[0021] 第2图即显示本申请利用X-ray结晶学技术解出的ManBK蛋白立体结构图与瑞氏 木霉菌的甘露聚糖酶的重迭结构图，其中瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶结构是与甘露二醣结合 的复合体结构。ManBK蛋白立体结构属于（P/a)8barrel折迭（fold)，其结构内部由8个 3-sheet形成桶状构造，外部则被8个a-helix围绕着。藉由研究甘露聚糖酶结构，本申 请针对其活性区或具有关键性特性的三十多个氨基酸来做修改。根据蛋白结构重迭比对的 结果，ManBK蛋白序列第25个位置的酪氨酸（Y25)位于蛋白立体结构中的活性区内，故被 选择作为进行定点突变的位置之一，且发现针对Y25来进行定点突变能提升甘露聚糖酶之 蛋白产量及活性。其它的突变没有增强蛋白产量及活性的效果，在此即不再赘述。以下即 说明本申请定点突变、蛋白表现及活性测试方法。
[0022] 本申请系利用定点突变技术（site-directedmutagenesis)以野生甘露聚糖酶基 因做为模版进行聚合酶连锁反应步骤，当中所用的突变引物如第3图所示，该突变引物系 设计为可将甘露聚糖酶第25个氨基酸由酪氨酸（Tyrosine)突变成组氨酸（Histidine)。 接着加入DpnI限制酶于37°C下作用，将原始模板去除，再把突变质体送入大肠杆菌胜任细 胞中以抗生素（Ampicillin)作初步筛选，并藉由DNA定序步骤确认成功突变基因。因此， 本申请构筑了一个突变株Y25H，Y25H意指为甘露聚糖酶第25个氨基酸由酪氨酸突变成组 氨酸，而此突变株的序列列于第4图中，其中突变株Y25H的DNA序列以序列编号3标示，氨 基酸序列则以序列编号4标示。
[0023] 接着在毕赤酵母中表现重组甘露聚糖酶基因，其系将甘露聚糖酶之野生型及突变 型的重组基因利用PmeI把DNA质体进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母 内。接着将菌液涂于含有1〇〇Pg/mlZeocin抗生素的YH)培养基于30°C下进行培养两天。 再挑选菌落并接种到5mlYPD于30°C下培养，再次接种到50mlBMGY中于30°C下培养至隔 天。接着，将培养基换成含有〇. 5%甲醇的20mlBMMY以诱导蛋白表达，同样培养于30°C下。 每隔24小时取样并补充0.5%甲醇。在经过4天的蛋白质诱导表现之后，将菌液以3500rpm 转离心并收集上清液用以准备下一步的纯化。
[0024]藉由快速蛋白质液相层析仪（fastproteinliquidchromatography,FPLC)纯化 收集好的野生型及突变型甘露聚糖酶上清液。依序利用镍离子层析管柱以及DEAE阴离子 交换管柱分离出蛋白纯度达95%以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓 度在25mMTris;150mMNaCl;pH7. 5条件下保存于-80°C。DEAE阴离子交换管柱分离出蛋白 纯度达95 %以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓度在25mMTris; 150mM NaCl;pH7. 5条件下保存于-80°C。
[0025] 为了验证野生型与突变型甘露聚糖酶的差异，本申请进一步测量其蛋白产量、酶 活性及热稳定性。甘露聚糖酶的活性测试方式主要是将〇. 3%刺槐豆胶（locustbeangum) 与适当浓度的酶蛋白，其缓冲液为〇. 05MpH5. 3的柠檬酸溶液，以9 :1比例混合一起，在 50°C下反应5分钟。接着加入1. 5倍体积的1%DNS于100°C沸水中作用5分钟，以停止反 应且呈色。在0D540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位（unit)。其中酶活性的标准曲 线是由甘露糖标准溶液0-14iimol/ml之间制定，而limit的定义为每分钟释放Iiimole产 物所需的酶蛋白量。
[0026] 第5图显示甘露聚糖酶的蛋白产量及活性测试结果。野生型ManBK基因与Y25H 突变型基因系分别送入毕赤酵母内表达，再检测其细胞外酶蛋白产量及活性。结果发现，将 Y25突变成组氨酸的突变型Y25H其蛋白产量远高于野生型甘露聚糖酶，约为野生型的1. 68 倍，且活性也明显地高于野生型甘露聚糖酶，约为野生型的1. 5倍。
[0027] 在热稳定性方面，甘露聚糖酶的耐热试验主要是将相同蛋白浓度的野生型与突变 型酶蛋白分别在50°C至90°C之间，以间隔5°C之不同温度下热处理2分钟，并在冰上冷却5 分钟后测量其残存活性，其活性测试标准步骤如上所述。
[0028] 第6图显示甘露聚糖酶的热稳定性试验结果。结果显示，Y25H突变型蛋白与野生 型蛋白（WT)的热稳定性并没有很大差异。举例来说，在80°C的热处理后，野生型及Y25H突 变型蛋白皆维持其原始活性的80 %，显示将Y25突变成组氨酸的突变型Y25H并不会影响其 原本的耐热特性。
[0029] 此外，本申请亦将野生型ManBK基因及Y25H突变型基因分别送入毕赤酵母表达系 统中表达，并进行了 50L模拟工业生产的酸酵试验。而在50L酸酵的结果中，Y25H突变蛋 白的产量及活性也是明显地高于野生型，其总活性产量提升了大约1. 5倍。换言之，不论是 在小量摇瓶或是大量生产的酸酵技术上，突变后的甘露聚糖酶蛋白产量及活性皆明显高于 野生型。因此，对于一些需要耐热甘露聚糖酶所参与的工业而言，单一突变的Y25H活性较 高，在工业应用上能降低其生产成本并增加其应用在产业上的竞争力。
[0030] 综上所述，为了提升甘露聚糖酶之蛋白产量及活性，本申请系将甘露聚糖酶ManBK 的三维立体结构解析出来，并针对位于蛋白立体结构活性区内的Y25进行定点突变，将其 由酪氨酸突变成组氨酸，而此Y25H突变型可有效增进甘露聚糖酶之蛋白产量及活性，而且 酶本身的热稳定性也不会受到影响，故在工业应用上能降低其生产成本并增加其应用在产 业上的竞争力。此外，由于此甘露聚糖酶具高耐热性，可应用在许多具高温制程的工业上， 一旦酶产量及活性被提升，就相对使得成本下降及利润提高。因此，本申请利用基因改造的 方式成功地增加甘露聚糖酶之酶产量及活性，也相对地减少了制程成本，进而有效提升高 耐热性甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。由于上述优点系为习知技术所不及者，故本 申请之具提升酶活性之甘露聚糖极具产业价值。
[0031] 本领域技术人员对本申请所作的任何修饰，均不脱离所附权利要求书的保护范 围。
【主权项】
1. 一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取 代修饰之序列。2. 根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中编码该序列编号2之基因系筛选自黑曲菌 (Aspergillus niger BKOl)之甘露聚糖酶基因。3. 根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中该甘露聚糖酶系为耐热性及耐酸性甘露聚糖 酶。4. 根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中该甘露聚糖酶之氨基酸序列系为序列编号4之 氨基酸序列。5. -种编码权利要求1所述之甘露聚糖酶之核酸分子。6. -种重组质体，其系包含权利要求5所述之核酸分子。7. -种如权利要求1-4中任意一项所述之甘露聚糖酶在工业中的应用，其中该工业系 选自食品工业、饲料工业、以及造纸工业。
【专利摘要】本发明关于一种具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取代修饰之序列。
【IPC分类】C12R1/685, C12N9/42, C12N15/56, C12R1/84
【公开号】CN105087521
【申请号】CN201410216886
【发明人】郭瑞庭, 黄建文, 郑雅珊, 吴姿慧, 赖惠琳, 林正言, 黄婷沅
【申请人】东莞泛亚太生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月21日