硼替佐米对k562细胞株中dna甲基转移酶表达的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方法，设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10％灭活新鲜小牛血清RPMI-1640培养液，在37℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力＞97％，取指数生长期的K562细胞（1×105/ml）分为对照组与实验组（3）Annexin-V法流式细胞仪（FCM）检测K562细胞凋亡率。本申请的方法能确定硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的抑制效果，从而为硼替佐米在白血病中的研究提供了可靠依据。
【专利说明】硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学检测技术，具体是指一种硼替佐米对K562细胞株DNA甲基转 移酶表达的检测方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化异常是人类恶性肿瘤及白血病的一种最常见的可以查明的分子异 常，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs)活性增高是其重要原因，硼替佐米 (bortezomib，商品名：万珂）是蛋白酶体抑制剂类抗肿瘤药物，临床主要用于治疗复发及难 治性多发性骨髓瘤，在白血病治疗方面的应用仍处于理论研究和探索阶段。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种硼替佐米对 K562细胞株DNA甲基转移酶表达的检测方法。通过该方法能确定硼替佐米对K562细胞株 中DNA甲基转移酶表达的抑制效果，从而为硼替佐米在白血病中的研究提供了可靠依据。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案是 (1) 设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10%灭活新鲜小牛血清RPMI-1640培 养液，在37 °C，体积分数为5% C02、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力> 97%，取指数生 长期的K562细胞（1 X 105/ml)分为对照组与实验组，实验组分别加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分别作用时间分别为12 h、24 h和36 h;对照组加入无硼替佐米的 细胞培养液，相同条件下培养； 本步骤获得以下实验组和对照组： A组，不加任何处理的对照组；B组，6 nmol/L硼替佐米处理组；C组，20 nmol/L硼 替佐米处理组；D组，60nmol/L硼替佐米处理组； (2) 蛋白印迹法检测胞内DNMT1表达：收集硼替佐米作用12 h后的各处理组细 胞，Western及IP细胞裂解液提取胞内蛋白，参照试剂盒说明用BCA方法测定蛋白浓 度，并调节浓度，每泳道取100 μ g上样，于10 %十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)后，电转至硝酸纤维膜，以β-actin为内参蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 体、β-actin -抗，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显 色，采用BandScan软件分析各组蛋白条带与相应β-actin的A值之比。实验重复3次； (3) Annexin-V法流式细胞仪（FCM)检测K562细胞凋亡率：收集硼替佐米各浓度处理 12-36 h的K562细胞IX 106个，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，离心弃上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室温避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反应 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 进行定 量检测，同时以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。单纯FITC阳性（FITC + /PI-)细胞群为早期凋亡细胞。
[0005] 总之，本检测方法研究证实了在硼替佐米的干预下，白血病K562细胞株的DNMT1 的表达水平下降，肿瘤细胞的生长受到抑制，凋亡率增加，本研究为硼替佐米在白血病治疗 中的应用以及其他以DNMT1为靶点药物在白血病中的研究提供了可靠依据，同时为白血病 的基因治疗提供新思路。
[0006] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步介绍。
【具体实施方式】
[0007] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不 能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明 作出一些非本质的改进和调整。 实施例
[0008] 材料的选择： K562细胞株由浙江大学医学院血液病实验室赠送；RPMI1640培养基、蛋白提取试剂 盒及实验相关引物合成由南京凯基生物公司提供。RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产 品，Annexin V -异硫氰酸 荧光素（FITC)凋亡试剂盒为美国Bipec公司产品，硼替佐米为美国Millennium公司 产品。兔抗人DNMTl、0_actin多克隆抗体为美国Cell-signaling公司产品，碱性磷酸酶 标志山羊抗兔二抗，BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自上海优宁维生物科技有限公司。
[0009] 检测方法： (1) 设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10%灭活新鲜小牛血清RPMI-1640培 养液，在37 °C，体积分数为5% C02、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力> 97%，取指数生 长期的K562细胞（1 X 105/ml)分为对照组与实验组，实验组分别加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分别作用时间分别为12 h、24 h和36 h;对照组加入无硼替佐米的 细胞培养液，相同条件下培养； 本步骤获得以下实验组和对照组： A组，不加任何处理的对照组；B组，6 nmol/L硼替佐米处理组；C组，20 nmol/L硼 替佐米处理组；D组，60nmol/L硼替佐米处理组； (2) 蛋白印迹法检测胞内DNMT1表达：收集硼替佐米作用12 h后的各处理组细 胞，Western及IP细胞裂解液提取胞内蛋白，参照试剂盒说明用BCA方法测定蛋白浓 度，并调节浓度，每泳道取100 μ g上样，于10 %十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)后，电转至硝酸纤维膜，以β-actin为内参蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 体、β-actin -抗，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显 色，采用BandScan软件分析各组蛋白条带与相应β-actin的A值之比。实验重复3次； (3) Annexin-V法流式细胞仪（FCM)检测K562细胞凋亡率：收集硼替佐米各浓度处理 12-36 h的K562细胞IX 106个，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，离心弃上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室温避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反应 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 进行定 量检测，同时以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。单纯FITC阳性（FITC + /PI-)细胞群为早期凋亡细胞。
[0010] 本申请检测了硼替佐米干预K562细胞株后，DNMT1酶催化活性和细胞生活状态 变化。用蛋白印迹法分析硼替佐米作用12 h后，发现胞内DNMT1的活性均下降，与对照组 相比，差异有统计学意义（P<〇. 05)。提示DNMT1转录水平及催化甲基转移能力下降。同 时，研究还发现该作用在一定的浓度范围内呈现明显的浓度依赖性。
[0011] 本申请的检测方法亦证实经硼替佐米处理K562细胞后，肿瘤细胞增殖减缓，凋亡 率增加。硼替佐米能有效地诱导K562细胞凋亡，细胞凋亡率随硼替佐米浓度的升高而增 大，硼替佐米作用36 h后凋亡细胞比例显著高于其他时间，细胞凋亡率与作用时间呈正相 关趋势。
【权利要求】
1. 一种硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方法，其特征在于： (1) 设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10%灭活新鲜小牛血清RPMI-1640培 养液，在37 °C，体积分数为5% C02、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力> 97%，取指数生 长期的K562细胞（1 X 105/ml)分为对照组与实验组，实验组分别加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分别作用时间分别为12 h、24 h和36 h;对照组加入无硼替佐米的 细胞培养液，相同条件下培养； 本步骤获得以下实验组和对照组： A组，不加任何处理的对照组；B组，6 nmol/L硼替佐米处理组；C组，20 nmol/L硼 替佐米处理组；D组，60nmol/L硼替佐米处理组； (2) 蛋白印迹法检测胞内DNMT1表达：收集硼替佐米作用12 h后的各处理组细 胞，Western及IP细胞裂解液提取胞内蛋白，参照试剂盒说明用BCA方法测定蛋白浓 度，并调节浓度，每泳道取100 μ g上样，于10 %十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)后，电转至硝酸纤维膜，以β-actin为内参蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 体、β-actin -抗，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显 色，采用BandScan软件分析各组蛋白条带与相应β -actin的A值之比；实验重复3次； (3) Annexin-V法流式细胞仪（FCM)检测K562细胞凋亡率：收集硼替佐米各浓度处理 12-36 h的K562细胞IX 106个，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，离心弃上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室温避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反应 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 进行定 量检测，同时以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照，单纯FITC阳性（FITC + /PI-)细胞群为早期凋亡细胞。
【文档编号】G01N33/68GK104142405SQ201410371771
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】吴圣豪, 郑翠苹, 陈松燕, 蔡小平, 石岳坚 申请人:温州市中心医院