专利名称：一种具有抗癌活性拟康氏木霉胞外多糖的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
根据世界卫生组织统计数据，截至2009年，全球平均期望寿命已经到达68岁。但是现代社会的电磁污染、土壤和水体的重金属污染、空气污染等等，给人类健康造成了越来越多的危害。随着全球人口老龄化加剧及世界总人口的持续增长，以及逐年增多的患癌高危行为(发展中国家或地区中以吸烟尤为显著)，使得全球癌症患者数量急剧增加。2008年GL0B0CAN的统计数据显示，在约1270万癌症病例和760万癌症死亡者中约56%的癌症 病例和64%的癌症死亡者来自发展中国豕或地区，其中24%发生在中国。我国癌症患者的生存患者和治愈患者仅为13%,每年约有180万人因此病去世,癌症已经成为严重威胁我国人民健康的头号杀手。随着癌症发病和死亡人数的持续增加，因癌症而带来的经济负担和对社会经济发展的不良影响越来越明显的显现出来。手术、放疗、化疗是治疗肿瘤的三大传统方法，但是这些方法也给患者带来严重的副作用和并发症。据最新统计表明，肿瘤死亡病例许多是由于手术、放疗、化疗过程中引发的合并症造成的。且上述治疗方法费用昂贵、预后较差，寻求疗效显著、副作用小、费用低廉的抗肿瘤药物和治疗方法具有重要意义。多糖(polysaccharide)是由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的含醒基或酮基的多羟基聚合物及其衍生物。多糖具有广泛的生物学功能，不仅可以作为体内的供能物质及细胞的基本组分，还参与细胞识别、机体免疫功能调节、细胞间物质运输、细胞的转化、细胞凋亡等过程。多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面具有良好的生物活性作用，并且副作用较小，其中真菌多糖以其抗肿瘤活性强、毒性小等优点引起中外学者的广泛重视。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的一种活性多糖。香菇多糖、云芝多糖、灰树花多糖等作为抗肿瘤辅助药物已进入临床应用。近20年来，随着生物化学、分子生物学等学科的飞速发展，人们对多糖及其复合物的活性作用有了越来越深入的认识。真菌多糖的抗肿瘤活性主要在两方面发挥作用一是直接作用于肿瘤细胞，通过改变肿瘤细胞膜生化特性、调节细胞增殖和凋亡相关基因的表达抑制肿瘤细胞生长；二是激活免疫细胞，提高机体免疫力。如地黄多糖体外给药可以明显上调Lewis肺癌细胞内p53基因的表达；桑黄多糖可以抑制SW480细胞的生长、侵袭，并调节Wnt/i3-catenin通路。菌种保藏号为CGMCC No. 1443 的拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)是从玉米秸杆中分离获得的，具有很强的生长势，液体发酵培养过程中分泌大量的胞外多糖。拟康氏木霉胞外粗多糖包含多种组分，采用不同的分离纯化方法可以获得多种均一多糖， 由于其结构和单糖组成的差异，具有不同的生理活性。研究表明拟康氏木霉胞外多糖具有优异的免疫活性，可以促进脾淋巴细胞增殖和IL-2的分泌，增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力和酸性磷酸酶活性。拟康氏木霉胞外多糖灌胃处理的正常小鼠和免疫低下模型小鼠血清中IL-2及TNF-α含量显著提高，增强小鼠迟发型免疫反应，提高胸腺指数和脾指数。如中国专利文献CN101220101A(申请号为200810014047.8)公开了一种拟康氏木霉胞外多糖。该多糖的特征在于，(I)通过高效凝胶过滤层析检测，其具有单一对称峰，分子量为18325 ； (2)通过改良的硫酸-苯酚法和间苯基苯酚法检测，其中性多糖含量为65. 2%，糖醛酸含量为32.6% ；(3)通过糖醇乙酸酯的GC分析，其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为RHA GLC GAL = 5. 6 2.7 1.0。该多糖完全还原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为RHA GLC GAL =14. 5 9. 3 I. 0，并且其含有摩尔含量为26. 6%的葡萄糖醛酸。这种拟康氏木霉胞外多糖的制备方法包括粗多糖的制备和多糖的纯化。这种拟康氏木霉胞外多糖在制备提高哺乳动物免疫活性药物或功能性食品中以及在制备治疗或辅助治疗肿瘤的药物、功能性食品中具有广泛的用途。目前，拟康氏木霉胞外多糖的功能性研究已成为拟康氏木霉菌研究的热点，但拟康氏木霉胞外多糖对人类慢性粒细胞白血病细胞K562生长的影响的研究还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖及其应用。术语说明mRNA的表达丰度指mRNA在某个细胞中表达的平均分子数。seveage试剂一种蛋白质变性剂,可以使蛋白质变形从溶液中析出。本发明的技术方案如下具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖在制备抑制肿瘤生长药物或辅助药物中的应用。上述药物可以在体外降低K562细胞活力，提高其胞内活性氧和游离钙离子浓度，提高p53、Bax基因mRNA的表达丰度，下调Bcl_2转录水平的表达，引起人类慢性粒细胞白血病细胞K562细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，诱导K562细胞核聚缩、碎裂产生凋亡小体，发生凋亡；体内给药可以增加荷瘤小鼠体重，减缓荷瘤小鼠肿瘤的生长速度和瘤重，从而达到杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的目的。上述应用，所述具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖的分子量为31. 9KDa，单糖组成的摩尔比为鼠李糖木糖岩藻糖甘露糖葡萄糖半乳糖=16. 2 14.4 I 25.8 23.6 48. I0上述应用，所述具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖通过如下步骤制备(I)将菌种保藏号为CGMCC No. 1443的拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)接种于PDA培养基中活化,制得活化菌丝；(2)将步骤(I)制得的活化菌丝转接于PDB发酵培养基中，在培养温度为25°C 300C，120rpm摇床培养9 11天，制得液体发酵液；(3)将步骤(2)制得的液体发酵液经过滤除去菌丝，滤液经60°C减压浓缩至原体积的20% 30%，得浓缩液，然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的95% (体积浓度)的乙醇溶液，4°C过夜，离心，收集沉淀；(4)将步骤(3)收集的沉淀用去离子水溶解，然后加入溶解液体积1/3的seveage试剂振荡脱去蛋白质，制得粗糖溶液；(5)将步骤(4)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和Sephadex G_75凝胶分离纯化,制得纯化的拟康氏木霉胞外多糖(EPS-I)溶液；(6)将步骤(5)制得的纯化的拟康氏木霉胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得拟康氏木霉胞外多糖；所述步骤(4)的seveage试剂由氯仿与正丁醇按体积比4 I的比例混合。所述步骤(I)中活化的时间为20 26h，活化温度为25°C 30°C。所述步骤(2)中的培养温度为28°C。 所述步骤(3)中的离心条件为IOOOOrpm离心5min。由上述制备方法制得的具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖，其分子量为31. 9KDa,单糖组成为鼠李糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩尔比为16. 2 14.4 I 25.8 23.6 48. I0有益效果本发明所述的拟康氏木霉胞外多糖应用于抑制肿瘤生长药物或辅助药物中，可以在体外降低K562细胞活力，提高其胞内活性氧和游离钙离子浓度，提高p53、Bax基因mRNA的表达丰度，下调Bcl-2转录水平的表达，引起人类慢性粒细胞白血病细胞K562细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，诱导K562细胞核聚缩、碎裂产生凋亡小体，发生凋亡；体内给药可以增加荷瘤小鼠体重，减缓荷瘤小鼠肿瘤的生长速度和瘤重，从而达到杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的目的。
图I拟康氏木霉胞外多糖高效凝胶渗透层析图谱；图2拟康氏木霉胞外多糖单糖组成分析；图3拟康氏木霉胞外多糖体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562体外增殖活性的影响；其中*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P < O. 05)**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P < O. 01)图4拟康氏木霉胞外多糖体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562形态的影响；其中A为对照组；B、C、D分别为拟康氏木霉胞外多糖O. 2mg/ml浓度、O. 6mg/ml浓度、lmg/ml浓度处理组。图5拟康氏木霉胞外多糖体外给药诱导人类慢性粒细胞白血病细胞K562发生凋亡；其中A为对照组；B、C、D分别为拟康氏木霉胞外多糖O. 2mg/ml浓度、O. 6mg/ml浓度、lmg/ml浓度处理组。图6拟康氏木霉胞外多糖体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562p53、Bcl-2、BaxmRNA表达的影响；图7拟康氏木霉胞外多糖体内给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562荷瘤小鼠肿瘤生长的影响；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中，拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No. 1443 ;DEAE_Fast Flow阴离子交换凝胶、S^hadexG-75凝胶购自GE公司；弱碱性阴离子交换树脂D-301R购自天津南大树脂有限公司；SRB购自Sigma-Aldrich公司；Hoechst 33258染色液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；人类慢性粒细胞白血病细胞K562购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；台盼蓝购自上海沪宇生物有限公司，TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自Takara公司；其他试剂均为本领域常用市售试剂，分析纯。实施例I一种具有抗癌活性拟康氏木霉胞外多糖的制备方法，包括如下步骤(I)将菌种保藏号为CGMCC No. 1443的拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)接种于PDA培养基中，在28°C条件下活化24h,制得活化菌丝；所述PDA培养基，每升组分如下马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂2g，水定容至IOOOmL,自然 pH;(2)将步骤(I)制得的活化菌丝转接于PDB发酵培养基中，培养温度28°C，120rpm摇床培养10天，制得液体发酵液；所述PDB发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g，蔗糖20g，水定容至IOOOmL,自然pH;(3)将步骤(2)制得的液体发酵液经4层纱布过滤除去菌丝，滤液经60°C减压浓缩至原体积的25%，得浓缩液，然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的95% (体积浓度)的乙醇溶液，4°C过夜，IOOOOrpm离心5min，收集沉淀；(4)将步骤(3)收集的沉淀用去离子水溶解,得溶解液,然后加入溶解液体积1/3的seveage试剂剧烈振荡脱去蛋白质，seveage试剂由氯仿与正丁醇按体积比4 I的比例混合制得，制得粗糖溶液；(5)将步骤(4)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和Sephadex G_75凝胶分离纯化,制得纯化的拟康氏木霉胞外多糖溶液； (6)将步骤(5)制得的纯化的拟康氏木霉胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖(EPS-I)。经上述方法制得的EPS-I为白色固态，呈絮状；经红外光谱检测，发现其有多糖的特征峰吸收，证明EPS-I为多糖；碘-碘化钾反应、双缩脲反应、紫外吸收检测结果表明EPS-I中不含淀粉、蛋白质、核酸杂质；通过高效渗透色谱法测定EPS-I分子量为31. 9KDa(如图I所示)；利用气相色谱法测得其单糖组成为鼠李糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄、半乳糖，摩尔比为16. 214. 4 I 25. 8 23. 6 48. I (如图2所示)，表明EPS-1是一种杂多糖。
实施例2EPS-I体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562增殖活性的影响SRB是一种蛋白质结合染料，可以与经三氯乙酸固定后的细胞蛋白质的碱性氨基酸结合呈现一种明亮的粉红色，并且其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比，用酶联免疫检测仪测定吸光度，可得到一个准 确的细胞蛋白含量的数值，以此来计算细胞数目，反映细胞的增殖活性。实验方法取处于对数生长期的人类慢性粒细胞白血病细胞K562，制成密度为I X IO4个/ml细胞悬液，接种于96孔板内，180 μ L/孔。培养24h后,每孔加不同浓度的拟康氏木霉胞外多糖溶液20 μ L (终浓度为0.2,0. 4,0. 6,0. 8、lmg/ml)，每孔总液量为200 μ L，每个药物浓度设6个复孔，并设空白对照(没有细胞，只加RPMI-1640培养液)和正常对照孔(不加药物，加等量RPMI-1640培养液)，37°C、5% CO2、饱和湿度(下述细胞培养条件同此)培养24、48、72小时。培养结束后，每孔加入50yL4°C的50wt%的三氯乙酸(TCA)溶液，使TCA的终浓度为IOwt %，放入4°C冰箱中固定lh。去离子水洗涤5遍，晾干后每孔加入IOOyLO. 4被％的51 ，室温放置30min，弃去各孔液体，用lwt%乙酸洗涤5遍，每孔加入150uL pH为10. 5的10mmol/L Tris base (三轻甲基氨基甲烧)溶液,振荡5min,直至染料全部溶解，使用酶联免疫检测仪490nm处测定OD值并记录。 抑制率=(对照组OD值-处理组OD值)/对照孔OD值X 100 %实施例I制得的拟康氏木霉胞外多糖在体外对人类慢性粒细胞白血病细胞K562的增殖活性有抑制作用，实验结果见图3。拟康氏木霉胞外多糖显著抑制了人类慢性粒细胞白血病细胞K562的体外增殖，并具有时间和剂量依赖性。不同浓度拟康氏木霉胞外多糖处理24h、48h和72h，对人类慢性粒细胞白血病细胞K562的生长均产生了抑制作用，抑制率最高达到41%。实施例3拟康氏木霉胞外多糖体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562染色质形态的影响细胞发生凋亡时细胞膜通透性发生改变，染色质聚缩并产生凋亡小体，使用具有膜通透性并可以特异性结合DNA的H0echst33258染色液染色后，可以在倒置荧光显微镜下直观的观察到细胞核的形态变化。实验方法将无菌盖玻片置于六孔板内，种入人类慢性粒细胞白血病细胞K562孵育24h。次日加入不同浓度的拟康氏木霉胞外多糖溶液刺激细胞48小时后，移除培养液，加入O. 5ml固定液，固定10分钟。吸去固定液，PBS清洗后加入O. 5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟，PBS洗去染色液。荧光显微镜下观察并拍照，激发波长为350nm左右，发射波长460nm左右。实施例I制得的拟康氏木霉胞外多糖体外给药导致人类慢性粒细胞白血病细胞K562细胞核染色质形态的改变，结果如图4。Hoechst 33238染色液染色结果显示，对照组(A)细胞大小均匀、形态规则、细胞核染色较浅，拟康氏木霉胞外多糖处理组(B、C、D)细胞膜皱缩，细胞核染色质聚缩深染，性状不规则，出现凋亡小体。凋亡小体的产生是细胞发生凋亡的显著标志，说明拟康氏木霉胞外多糖诱导人类慢性粒细胞白血病细胞K562发生凋亡。实施例4EPS-I体外给药诱导人类慢性粒细胞白血病细胞K562发生凋亡
细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻是细胞早期凋亡的重要标志之一，Annexin-V是一种对磷脂酰丝氨酸具有高亲和性的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，可以作为翻转至细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸的特异性探针。实验方法取对数生长期人类慢性粒细胞白血病细胞K562，调整浓度为5X IO5个/ml，种于六孔板内，孵育24h。次日加入不同浓度拟康氏木霉胞外多糖溶液，处理48h后收获细胞。取5-10万细胞，加入195 μ L Annexin V-FITC结合液，然后加入5 μ L Annexin V-FITC，室温(20-25°C)避光孵育10分钟，IOOOg离心5分钟，弃上清，加入190 μ LAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10 μ L碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即上机检测，Annexin V-FITC激发光为绿色荧光，碘化丙啶激发光为红色荧光。实施例I制得的拟康氏木霉胞外多糖体外给药诱导人类慢性粒细胞白血病细胞Κ562发生凋亡，结果见图5。人类慢性粒细胞白血病细胞Κ562经拟康氏木霉胞外多糖处理48h后，相对于对照组，处理组人类慢性粒细胞白血病细胞Κ562的早期凋亡细胞(右下象限)比例从O. 1%上升至20.5%，晚期凋亡和坏死细胞(右上象限)从1.7%提高到18. 75%，随浓度提高，凋亡细胞数目逐步增加，呈剂量依赖性，说明拟康氏木霉胞外多糖可以诱导人类慢性粒细胞白血病细胞K562发生凋亡。实施例5拟康氏木霉胞外多糖体外给药对人类慢性粒细胞白血病细胞K562p53、Bcl-2、Bax的mRNA表达的影响P53、Bcl-2、Bax是肿瘤细胞凋亡过程中的标志基因，其中p53可以诱导并调节细胞凋亡过程，Bax/Bcl-2比例是细胞是判断细胞是否发生凋亡的重要指标。实验方法将处于对数长期的人类慢性粒细胞白血病细胞K562接种于六孔板，24小时后，力口入拟康氏木霉胞外多糖母液，使其终浓度为O. 2,0. 6、lmg/ml，并设对照组。刺激24h后收获细胞，使用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录为cDNA后根据各目的基因序列设计引物进行聚合酶链式反应，引物序列见表I。实施例I制得的拟康氏木霉胞外多糖体外给药上调K562细胞p53和Bax的转录水平，降低Bcl-2的mRNA丰度，结果如图6。随拟康氏木霉胞外多糖浓度的提高，p53和Bax的mRNA表达量提高，Bcl-2的mRNA的表达下调，Bax/Bcl-2比率提高，说明拟康氏木霉胞外多糖处理的K562细胞发生细胞凋亡。表I聚合酶链式反应所用引物序列
权利要求
1.具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖在制备抑制肿瘤生长药物或辅助药物中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述具有抑制K562细胞生长活性的拟康氏木霉胞外多糖的分子量为31. 9KDa，单糖组成的摩尔比为鼠李糖木糖岩藻糖甘露糖葡萄糖半乳糖=16. 2 14. 4 I 25. 8 23. 6 48. I0
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的拟康氏木霉胞外多糖通过如下步骤制备 (1)将菌种保藏号为CGMCCNo. 1443的拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)接种于PDA培养基中活化，制得活化菌丝； (2)将步骤(I)制得的活化菌丝转接于PDB发酵培养基中，在培养温度为25°C 30°C，120rpm摇床培养9 11天,制得液体发酵液； (3)将步骤(2)制得的液体发酵液经过滤除去菌丝，滤液经60°C减压浓缩至原体积的20% 30%，得浓缩液，然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的95% (体积浓度)的こ醇溶液，4°C过夜，离心，收集沉淀； (4)将步骤(3)收集的沉淀用去离子水溶解,然后加入溶解液体积1/3的seveage试剂震荡脱去蛋白质，制得粗糖溶液； (5)将步骤(4)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和Sephadex G_75凝胶分离纯化,制得纯化的拟康氏木霉胞外多糖溶液； (6)将步骤(5)制得的纯化的拟康氏木霉胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得拟康氏木霉胞外多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(I)中活化的时间为20 26h，活化温度为25°C 30°C。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的培养温度为28°C。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中的离心条件为IOOOOrpm离心 5min。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗癌活性拟康氏木霉胞外多糖的应用，本发明所述的拟康氏木霉胞外多糖应用于抑制肿瘤生长药物或辅助药物中，可以在体外降低K562细胞活力，提高其胞内活性氧和游离钙离子浓度，提高p53、Bax基因mRNA的表达丰度，下调Bcl-2转录水平的表达，引起人类慢性粒细胞白血病细胞K562细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，诱导K562细胞核聚缩、碎裂产生凋亡小体，发生凋亡；体内给药可以增加荷瘤小鼠体重，减缓荷瘤小鼠肿瘤的生长速度和瘤重，从而达到杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的目的。
文档编号C12P19/04GK102657674SQ20121010539
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者张鹏英, 陈国创, 陈靠山, 黄涛涛 申请人:山东大学