专利名称：叉聚肽,其药物组合物与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类以赖氨酸为支架的具有混双叉链结构的肽类化合
物；本发明还公开了这类肽的制备方法，包括液相片段合成、固相逐 步合成、液一固片段组装合成；含有这类化合物的药物组合物，体夕卜、
体内抗癌细胞浸润及转移的活性试验表明这类肽类化合物可抑制癌细 胞转移。
背景技术：
现有技术中许多活性内源肽对肿瘤细胞转移具有一定的抑制活性。
例如纤维粘连蛋白中的RGD片段具有粘附识别活性；该蛋白中CS-1 片段(1978-1982) EILDV可促进肿瘤细胞之间紧密粘合，不宜脱落扩 散；层粘连蛋白中的YIGSR片段可阻断肿瘤细胞与基底膜的附着。然 而它们一旦脱离了原有的结合状态，就很容易被体内的蛋白酶降解。 因此它们作为外源性的药物，因过快降解很难发挥抑制肿瘤扩散及转 移的作用。
为了克服这种弊端，药物化学家们已经进行了很多相关的研究。 1986年Saiki等人合成并验证了均聚型(RGD)。及(YIGSR)。，发现它们 的抗癌转移作用强于各自单体肽Brit. J. Cancer, 1989,59:194。Nomizu 等人设计、合成了 16叉链(Ac-YIGSR),6-K,6-K8-K4-K2-K肽。活性试验 证明，抑制肿瘤细胞扩散的作用比单体肽高7.4倍Brit. J. Cancer, 1996， 73:589。美中不足的是，这种肽化合物的分子量多在10000Da以上， 合成难度及成本均高，而且由于分子量过高，易出现异蛋白样副作用。 考虑到肿瘤的扩散及转移是由多个环节组成的串接过程，单一使用上 述活性肽的一种化合物很难有效的阻断扩散、转移中的全部链条。
发明内容
针对现有技术中的存在的技术问题，本发明提供一类降解速度适 中；生产难度低，成本低；分子量适中，无异蛋白样副作用；能作用 于肿瘤扩散及转移的多个环节的叉聚肽化合物；
本发明还提供了含有这类叉聚肽化合物的药物组合物以及制备抗 癌转移药物组合中的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案 本发明从两方面对活性肽进行新设计与合成
① 位点改造，使相关的天然氨基酸残基Glu(E)、 Asp(D)、 Ile(I) 及Arg(R)分别换为酚基苯甲酸、Ida(亚氨基二乙酸)及胱氨 酸。旨在迷惑蛋白酶的识别，提高抗水解能力。
② 把不同的活性肽段或其位点改造肽结合在同一个Lys支架上， 构成混合叉聚型肽化合物。其结果是一方面加强了肽的分子量 效应，另一方面该种化合物具有多靶点的"鸡尾酒分子"性能， 具有效发挥抗扩散及转移作用。
本发明设计了具有以下结构通式的肽化合物，其特征在于，它们具
有下列结构通式
Z1、 Z、 C"—Z\
〕Lys-X-R 〉ys-X-R | /Lys-X-R
Z2 或 Z 或 Cys-Z
Z1、 Z2，相同或不同，Z、 Z1、 z2分别独立的选自 Arg-Gly-X' (X'=Asp, Ida)
X2-X3- Gly-Ser-Arg (X2=Tyr， 3，5 二羟基苯甲酰Gly; X3=Ile, Cys) X4-X5- Leu -X6- Val (X4= Ida, Glu; X5= Ile， Cys; X6= Asp， Ida) 其中Glu可以替换为3，5-二羟基苯甲酰Gly、 Asp可以替换为Ida、 Arg 可以替换为Arg(N02)
及上述结构的反序肽段，正序及反序的类似肽段 例如Arg-Gly-Asp (RGD) 、 Tyr隱Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)、 Gly-Asp-Ala-Lys ( GDAK )、 Glu-Ile-Leu-Asp-Val ( EILDV ),及其反序 结构为DGR、 RSGIY、 VDLIE。
X选自Ala、 -Ala或des(缺失)
R选自OH、 OCH3、 NH2、 NHR，(R^C, io烷基)、NH-CH2-CHrOH。
优选的R选自NHMe、 NHEt、 NHCHMe2、 NHBu。
优选的Z、 Z1、 ZZ分别独立的选自 Arg-Gly-Asp Arg-Gly-Ida Ida-Gly-Arg
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr
Ida-IIe-Leu-Asp-Val
Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Glu-Ile-Leu醒Ida-Val
3,5-二羟基苯甲酰-Gly-Ile-Leu- Ida—VaL
更优选的化合物选自
Arg-Gly-Asp \
,Lys-OMe
Arg-Gly-Asp
Arg-Gly-Asp—Lys—OMe Tyr-He-Gly-Ser-Arg
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg\
,Lys-OMe
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
Glu-lle~Leu-lda-Val\
>s-NHEt
Glu-"e-Leu-lda-Val
Gly-He-Leu-lda-Val—Lys—NHBu
6' 9、
Gly-lle-Leu-lda層Val
OH
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr\
》ys-Glyol
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr
Cys-Tyr-lle-Gly-Ser-Arg \
i 》ys-NHBu Cys-Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
Arg-Ser-G ly-l le-Ty r\
》ys-NHEt
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr
lda-lle-Leu-Asp-Val \
,Lys—NHMe
lda-lle-Leu-Asp-Val
Glu-lle-Leu-Asp-Val—Lys—p-Ala-NHMe Tyr-lle-Gly-Ser-Ar丄Glu-lle-Leu墨Asp-Val—Lys—p-Ala-NHMe Arg-Gly-lda
Cys-Glu-lle-Leu-Asp-Val \
i -Lys-NHMe
Cys-Glu-lle-Leu-Asp-Val
Arg-Gly-Asp—Lys—p-Ala-NHMe
j
Tyr-"e-Gly-Ser-Arg
TyMle-Gly-Ser-Arg—Lys—P"Ala隱NHMe lda-Gly-Arg
Ida:亚氨基二乙酸单酰
A = Ala D = Asp E = Glu G = Gly I = Ile K-Lys L = Leu O-Ida R-Arg， S = Ser V-Val Y - Tyr
本发明还提供了这类化合物的制备方法。
由于本发明涉及的化合物具有不同序列肽段的并列叉聚结构，因此 不便采用传统的逐步串接方式接肽。本发明综合了液相片段分别预制、 赖氨酰两个氨基正交式分别与不同的片段缩合及固相组装等策略，实 施了目标化合物的合成。
其中涉及的各氨基酸的保护形式为Boc-Arg(HCl)-OH， Fmoc-Arg(Mtr)-OH， Boc-Gly-OH， Boc-Ala画OH， Boc- -Ala-OH， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH， Fmoc-Glu(tBu)-OH， Boc-Ida誦OH (Boc-亚氨基二乙酸)，Fmoc-Ile-OH， Boc-Ile-OH， Fmoc-Leu-OH, Boc-Tyr-OH, Boc隱Ser-OH， Boc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH及Boc-Lys(Boc)-OH。缩合剂配方分别为DCC (二环己基碳二亚胺)与HOBt (N-羟基苯 丙三唑)等摩尔混合物，HBTU (O-苯丙三唑-N，N,N，,N，-四甲基脲錄六 氟磷酸盐)与HOBt及NMM等摩尔混合物，TBTU (O-苯丙三唑 -N，N,N，，N，-四曱基脲鐵四氟硼酸盐)与HOBt及NMM等摩尔混合物。
其他试剂与溶剂的缩写形式为H2NMe (曱胺)、H2NEt (乙胺)、 H2NBu(正丁胺)、TEA(三乙胺)、TFA(三氟乙酸)、TESi(三乙基 硅)、DMF ( 二甲基加酰胺)、Py.(吡。定)、DCM ( 二氯甲烷)、THF (四 氬p夫喃)、HOAc (乙@吏)、EtOAc (乙酸乙酯)、Et20 (乙醚)。
脱除Boc试剂3N HCl/HOAc或饱和HCl/EtOAc。脱除Fmoc试剂 20。/。哌啶/DMF。脱除Pac (苯羰亚甲基)酯试剂Zn/HOAc。切除树 脂试剂H2NR/H2OTHF。
全部产物均经溶剂重沉淀或C-18滤层纯化，并由FAB-MS或 ESI-MS分析证明结构。
本发明因此还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该 药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与 一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适 于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量 通常为0.1-95重量％。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药 途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、月几肉注射、皮下注射、 鼻腔、口腔粘膜、目艮、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以 是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复 乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻 剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含 片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶嚢剂(包括硬胶嚢、 软胶嚢、肠溶胶嚢)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、 气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂 等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是緩释制剂、控释制剂、 靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种 赋形剂，包括稀释剂、勦合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。 稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、 木糖醇、微晶纤维素、硫酸4丐、磷酸氩4丐、碳酸钓等；湿润剂可以是 水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡
萄糖溶波、孩史晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧曱基纤维素钠、甲 基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、
聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、 低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、 羧曱基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十 二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸 盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、 肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀 释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶嚢或软胶囊中。也可将有 效成分本发明化合物先与稀释剂、翁合剂、崩解剂制成颗粒或微丸， 再置于硬胶嚢或软胶嚢中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、 祐合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的 胶嚢剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二 醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、 pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、 羟丙基-P-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化 钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸 盐等。如制备冻千粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。 此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、
矫P木剂或其它添力D剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可 用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的 性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有 大范围的变化。 一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为
0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为l-60mg/Kg 体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成 几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗 手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症 药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时， 应根据实际情况调整它的剂量。
本发明的优点
降解速度适中 生产难度低，成本低。 分子量适中，无异蛋白样副作用。 能作用于肿瘤扩散及转移的多个环节。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受限于这 些实施例。
制备例
片段肽的液相合成试验
制备例1 Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH(I)的制备
(1) Boc-Ser-OPac的制备
称取3.078g Boc-Ser-OH ( 15mmo1)和3.284g淡代苯乙酮 U6.5mmo1)共同溶于30ml乙酸乙酯中，水水外浴下边搅拌边 滴加2.31ml三乙胺，搅拌反应过夜。次日向反应液中加入70ml 乙酸乙酯，依次以饱和NaHC03溶液x3、 1NHC1溶液x3、饱和 食盐水x3、蒸馏水x2洗涤(每次100ml),有机层以无水疏酸钠 干燥后过滤，滤液浓缩为油状物后低温固化为针状结晶，以石油 醚:乙醚=1:2混合溶剂研磨后抽滤得到白色固体粉末，产率92%。 Mp: 91.5~92.5°C ESI-MS:324.4 [M+H]+
(2 ) HOH2N-Ser-OPac的制备
以饱和HC1的EtOAc溶解Boc-Ser-OPac,水水外浴下搅拌 反应4小时后减压蒸出溶剂和酸气，残余物以Et20研磨后抽滤 得到白色光泽4分末，产率99%。
Mp: 155~157°C
(3) HOH2N-Gly-Ser-OPac的制备
称取3.854g Boc-Gly-OH( 22mmol)与2.97g HOBt( 22mmol) 共同溶于80ml四氢呋喃(THF )中，水水外浴下加入2 mmol/ml DCC的四氳呋喃溶液llml，置于4'C下活化4小时后过滤除去 DCU，滤液在0。C下加入到以10ml DMF+10ml THF溶解的 5.197g HOH2N-Ser-OPac ( 20mmol)溶液中，搅拌10分钟后在 水水外浴下边搅拌边滴入2.32ml NMM,反应过夜。次日减压蒸 出THF,向所得溶液中加入80ml饱和食盐水以100ml EtOAc分 两次萃取，合并有机层依次以饱和NaHCCV溶液x3、 1NHC1溶 液x3、饱和食盐水x3、蒸馏水x2洗涤(每次100ml),有机层以 无水硫酸钠千燥后过滤，减压浓缩后以无水乙醚重结晶的到白色 固体粉末，产率82%。 Mp: 52 54°C ESI画MS:381.2 [M+H〗+。 Boc 保护基的脱除按(2)节中的方法进行，以无水乙醚研磨得到白
色粉末，产率96°/。
Mp: 157-160°C (4 ) HCl*H2N-Ile-Giy-Ser-OPac的制备
Boc-Ile-OH的活化按照(2)节中DCC活化方法操作，将 活化后的羧基组分与本实施例(3)节的产物的THF:DMF=1:1 混合溶剂的溶液在0。C下混合，反应液浓度1 mmol/ml,混合10 分钟后加入NMM，搅拌反应过夜。后处理同(3)节的后处理 方法，最后以无水乙醚研磨后抽滤得到白色粉末，产率94%。 Mp: 154 156°C ESI-MS:516.2 [M+Na]+。 Boc保护基的脱除按 (2)节中的方法进行，以无水乙醚研磨得到白色粉末，产率 96%。 Mp: 106~110°C
(5 ) Boc-Tyr-Ile誦Gly-Ser-OPac的制备
以10ml无水THF和10ml DMF的混合溶液溶解1.406g Boc-Tyr-OH ( 5mmo1)和l，954g ( 4 )节所得产物(4.54mmol), -16匸下边搅拌边加入1.05ml NMM ( 9.53mmol )， 5分钟后緩慢 滴加0.664ml氯曱酸异丁酯(IBCF, 5mmo1) 3小时后转为室温 并反应过夜。次日蒸出THF后向反应液中加入70ml饱和食盐 水，以100ml EtOAc萃取，有机层依次以饱和NaHC03溶液x3、 IN HC1溶液x3、饱和食盐水x3、蒸馏水x2洗涤(每次100ml), 直接抽滤得到白色固体并以EtOAc重结晶后得到产物，产率 55%。 Mp:212 214。C， ESI-MS: 657.3 [M+H]+
(6 ) Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH的制备
以50ml HOAc溶解1.614g (5)节所得产物(2.456mmol )，油 浴40。C下边搅拌边加入30倍量锌粉搅拌反应1小时后再加入 20倍量锌粉，继续反应5小时后过滤除去锌粉，滤液浓缩后以 80mlEtOAc稀释，以IN HC1溶液x2饱和食盐水溶液x3洗，有 机层以无水石克酸钠千燥后过滤，滤液浓缩至干，以无水乙醚研 磨过夜后抽滤得到白色固体产物，产率83%。 Mp: 145-147°C ESI-MS: 539,3 [M+H]+
制备例2Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH (II)的制备
(1 ) HOH2N-Ida-OPac的制备
按照实施例1中(1 ) 、 ( 2 )节的方法得到中间体 HOH2N-Ida-OPac。投料比Boc-Ida-OH:溴代苯乙酮4:2.2，反应 液浓度0.5mmol/ml。两步总产率92%。 Mp: 131-132°C
(2) HOH2N-Gly-Ida-OPac的制备
称取 0.741g Boc-Gly-OH ( 4.231mmol ) 和 1.561g HCl*H2N-Ida-OPac (3.874mmol)共同溶于20ml DMF中，0于搅 拌下滴加0.74ml ( 4.231mmol) DIPEA,搅拌5分钟后加入0.811g
EDOHC1 (4.231mmol)。搅拌反应过夜，次日向反应液中加入 120ml饱和食盐水，以乙酸乙酯萃取，有机层依次以饱和NaHC03 溶液x3、 1NHC1溶液x3、饱和食盐水x3、蒸馏水x2洗涤(每次 100ml),以无水石充酸钠干燥后过滤。将滤液蒸千，加入无水乙醚 研磨过夜，过滤后得乳白色固体粉末。产率58%, Mp: 126 130°C, ESI-MS: 549.3 [M+Na]+。 Boc保护基的脱除按实施例1中(2) 节的方法进行，以无水乙醚研磨得到白色粉末，产率96%。 (3 ) Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH的制备
Boc-Arg(Mtr)-OH的活化按照实施例1中(2)节的DCC活化方 法操作，将活化后的羧基组分与本实施例中(2)节所得产物的 THF:DMF (l:l)溶液在0。C下混合，反应物液浓度0.5 mmol/ml， IO分钟后加入NMM,搅拌反应过夜，后处理同产率51%。 Mp: 99 102°C, ESI-MS: 917.5 [M+Na]+。羧基端Pac酯保护的脱除按 照实施例1中(6)节的方法进行，锌粉投料比为1:100，按60/40 的比例分两次加入。产物为白色固体，产率80%, ESI-MS: 659.4 [M+H]+
制备例3Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH (III)的制备
(1 )HC1'H2N-Leu-OPac的制备
按照实施例1中(1 ) 、 ( 2 )节的方法得到中间体 HCl*H2N-Leu-OPac。投料比Boc-Leu-OH:溴代苯乙酮=1:1.05, 反应液浓度0.5mmol/ml。两步总产率80%。 Mp: 163 165°C (2) HCl*H2N-Ile-Leu-OPac的制备
按照实施例1中(5)节的方法采用IBCF混合酸酐法活化接肽 制备Boc-Ile-Leu-OPac，投料比例为羧基组分:氨基组分=1 :U无 水乙醚重结晶得到白色粉末，产率53%。 Mp:143 144。C。 Boc 保护基的脱除按实施例1中(2)节的方法进行，以无水乙醚研 磨得到白色粉末，产率98%。 Mp: 181~183°C (3 ) Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH的制备
按照实施例1中(5 )节的方法采用IBCF混合酸酐法活化接肽 制备Fmoc画Glu(OtBu)-Ile-Leu-OPac,投料比例为羧基组分:氨 基组分=1:1.05无水乙醚重结晶得到白色粉末，产率53%。 Mp:210 212。C。 ESI-MS: 792.5 [M+Na]+。羧基端Pac酯保护的 脱除按照实施例1中(6)节的方法进行，锌粉投料比为1:50, 按30/20的比例分两次加入。终产物经无水乙醇中结晶纯化得 到白色固体粉末，产率86%， Mp: 254~256°C， ESI-MS: 652.5 [M+H]+
制备例4固相肽合成试-睑
(1) Boc-氨基酸与氯曱基树脂的键合
称取10g (5 mmol)氯曱基树脂(取代当量0.5 mmol/g,粒度 100 200目，交联度1%)、两倍(10 mmol)摩尔数的Boc-氨基 酸[Boc-Lys(Boc)-OH或Boc- -Ala-OH]、两倍(10 mmol)摩尔 数的K2C03及十分之一摩尔数(0.5 mmol )的KI共同与DMF( 100 mL)混合在圓底烧瓶中。经70。C空气裕旋转加热反应24h。将 反应混悬物移入带抽滤砂板的反应管中，依次用60 70。C的 DMFx3, 95%EtOHx3、 DMFx3、 50%EtOHx3、 EtOHx3及常温 的无水Et202混摇洗涤各lmin，抽干备用。
(2) 脱除Boc
Boc-AA-树月旨(约5 mmol)与100 mL含3N HC1的无水HOAc 混合，室温摇动5min。抽除酸液后再加100 mL 3N HCl/HOAc， 再摇动反应40 min。抽除酸液后，树脂依次用下列溶剂洗滤 DCMx5、 Et202、 DMFx2、 95%EtOHx2、 70。C的DMFx2、 70°C 的EtOHx3、无水Et20x2,抽干备用。
(3) 脱除Fmoc
Fmoc-AA-树脂与适量20Q/o哌咬/DMF混摇两次(5+20min )，依次 用EtOAcx3、 DMFx3、 EtOHx3、 DMFx2、 EtOHx3、 Et2Ox2, 抽干备用。
(4) 羧基组分Boc-AA-OH或Fmoc-AA-OH的活化 称取三倍于树脂上氨基组分的Boc(或Fmoc)-AA-OH、 HBTU及 HOBt共溶于适量的千燥DMF中。然后加入四倍摩尔量(当氨 基组分为.HC1盐时)或三倍摩尔量(当氨基组分为游离胺时)的 N-曱基吗啉(NMM)。溶液澄清全溶后备用。
(5) 缩合接肽
将上述预制的羧基组分活化溶液与适量的氨基组分树脂混合。室 温摇动反应，终点由茚三酮试验结果决定。本发明中多数接肽反 应为两次缩合，每次5 6h。反应后树脂依次用下列溶剂淋洗 DMFx3、 EtOHx2、 DMFx3、 EtOHx3、无水Et202。抽千，待 下一循环脱Boc或脱Fmoc用。
(6) 脱除側链保护基
合成中使用 Fmoc-Ser(tBu)-OH ， Fmoc-Arg(Mtr)-OH , Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH及Fmoc-Cys(Trt)-OH 时，在肽链组装完成后脱除侧链保护基tBu、 Mtr、 Trt的条件为 硫代苯甲醚:H20:TFA-5:5:90 (v:v:v),脱除Trt时加用5%EDT， 共两次(10min+50min)。抽干酸液后树脂依次用DCMx5 、 EtOAcx2、 EtOHx2、 60。C的DMFx3、 EtOAcx2、 10%TEA/DMFx2、 60。C的DMFx3、 50%EtOHx2、 60。C的DMFx2、 60。C的EtOHx5 进行洗滤，每次lmin。抽干溶剂后待做胺解用。
(7)氨解反应切除树脂
取脱除全部保护基的肽树脂，按每克树脂10mL胺溶液的比例加 入一种相应的H2NR/EtOH (或H20):THF (l:l)溶液。室温反应 24h，然后收集上清液。残余树脂再用60°C 95。/。EtOH洗滤三次， 合并醇洗液与氨解液。在50 6(TC下减压浓缩，蒸干溶剂。残留 物在与适量曱苯混合，再蒸千。残留物经无水Et20研磨成粉状， 过滤收集沉淀，得产物。
实施例
实施例i目标化=::=pLys-QMe合物的制备i
按照制备例4中(1) (5)节的方法得到中间体(Arg-Gly-Asp)2Lys-树脂。此树脂3g与5%TEA/MeOH ( 30mL ) i 55。C加热时旋转 反应24h,收集滤液后，残余树脂再与30mL 5% TEA/MeOH混 合，55°C 24h重复反映一次。合并两次滤液，于50。C下减压浓缩 至干。残留物经无水Et20研磨，出现粉状沉淀，过滤收集沉淀 的目标化合物。
FAB-MS分析817.3 [M+H]+ 实施例2.目标化,lle;:y=》S-oMe合物的制备2
按照制备例4中(l) (5)节的方法先制备中间体Fmoc-Lys(Arg)-树 月旨。然后以Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH为羧基组分(制法见制备例 1 )，按照制备例4中(4 )及(5 )节的方法予以活化并与中间体 侧链 Arg 的氨基缩合，得到中间体 Fmoc-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)-树脂。随之脱除Fmoc基[见制 备例4中第(3)节]，再依次有逐步法接上Boc-Arg-Gly-Asp,得到 中间体Boc-Arg-Gly-Asp(OtBu)-Lys(Boc-Tyr-Ile画Gly-Ser-Arg)-树 月旨。此中间体的Boc及tBu保护基用TFAAt代苯甲醚/H20脱除[详 见制备例4中第(6)节]。最后用酯交换法(详见实施例1 .)切除
树脂得到终产物。 FAB-MS: 1065.5 [M+H〗+
实施例3.目标化=Ss=:^ 0l合物的制备3
按照前述方法，逐步缩合得到中间体(Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr)2-Lys-
树脂，最后用乙醇胺为氨解试剂切除树脂30倍摩尔量的 H2N-CH2CH2OH/H20/THF(2:l:3，体积比)溶液与1摩尔量的肽树 脂混合摇动24h,收集上清液。于50。C下减压蒸除THF。残留液 用50倍体积的蒸馏水稀释。此溶液经C-18滤层过滤。全部滤完 后，用大量蒸馏水、洗滤C-18滤层，直至滴出液呈茚三酮为阴性 反应，表明乙醇胺已被洗净。尽量抽除C-18滤层中的水分，再 用无水Et20洗滤C-18滤层。最后用混合纟容剂HOAc-EtOH( 1:2)洗 脱滤层中的产物，收集洗出液。直至流出液成茚三酮为阴性反应。 洗脱液在5(TC下减压浓缩至千。残留物经EtOAc研磨，使粘稠 物粉末化。过滤收集沉淀，得目标化合物。 FAB-MS分析1374.6 [M+H]+
实施例4.目标化^^;t;》ys-隨合物的制备8
由实施例3 .得到的肽树脂(Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr)2-Lys-树脂中间体 用乙胺为试剂切除树脂(详见制备例4中第7节)。得目标化合物。
FAB-MS分析1358 [M+H]+ 实施例5.目标化===-》3-國6合物的制备9
用固相逐步缩合法[见制备例4中第(1) (5)节]完成双叉链的组装。 其中，Ida、 Leu、 Asp(tBu)三个残基是用Fmoc保护形式引入， 以防止Asp上的tBu侧链保护基提前被脱除。其余均用Boc保护 方式。最后以曱胺解方法与制备例4中第(7)节相同。得目标化合 物。
FAB-MS分析1270.6 [M+H]+
实施例6.目标化Hfe:te^》Lys—,-NHMe合物的制备^
依照制备例4中第(1).(2).(4)及(5)节的方法，首先制得 Fmoc-Lys(Boc-Arg-)- -Ala-树脂中间体。然后将侧链上的Boc脱 除，再与预制的片段肽Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH (制备方法见实施 例1.)经HBTU/NMM法缩合，得到肽树脂中间体 Fmoc-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-), -Ala-树脂。后者依照制备 例4中第(3)~(7)节的方法制得目标化合物。 ESI-MS分析1376.9 [M+H]+
实施例7.目标化GIU-|le-L=gA^:=-LyS-PAia-NHMe合物的制备ll
依照制备例4中第(1).(2).(勺及(5)节的方法，首先制备
Fmoc-Lys(HONH2-)- -Ala-树脂中间体。然后将制备例2种制备 的三肽片段Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH用HBTU/NMM活化，在 与 Lys 侧链氨基缩合，得到中间体 Fmoc-Lys[Boc-Arg(Mtr)-Gly-Idal- -Ala-树脂。后者经逐步法先后 与Fmoc-Val-OH及Fmoc-Asp(OtBu)-OH缩合，再与预制好的片 段肽Fmoc-Glu-Ile-Leu-OH (制备方法制备例3.)进行缩合，得 到 双 叉 肽 中 间 体
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Val-Lys[Boc隱Arg(Mtr)-Gly-Id a]— -Ala-树脂，最后依次脱除。tBu、 Mtr及Fmoc基，再经曱胺 解切除树脂，得到目标产物。 ESI-MS分析1128.8 [M]+
实施例8.目标化合物的制备12
按照制备例4 中第(1)~(5)节的方法先制备出 [Fmoc-Asp(OtBu)-Val]2-Lys-树脂中间体。脱除Fmoc后，再与片 段肽Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH (由制备例3制备)缩合，得到 双叉肽中间体[Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Val]2-Lys-树 月旨。后者经脱除Fmoc后再与Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合，得到双叉 肽中间体[Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)陽Ile-Leu扁Asp(OtBu)-Val]2-Lys-树脂。对其脱除Fmoc后，用制备例4中第(6)节的条件脱除Trt 及tBu基。将肽树脂与DMSO-DMF(l:l)溶液在室温中混摇50h， 使形成二硫键。最后经甲胺解切除树脂[详见制备例4中第(7) 节],得到目标化合物。 ESI-MS分析1502.7 [M+H]+
实施例9.目标化t ,, 二。:y "Lys-pAla-NHMe合物的制备14
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
按上迷方法，现制备中间体Fmoc-Lys(Arg)- -Ala-树脂。其側链 Arg的-氨基再与肽片段Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH (由实施例3 制备)缩合。随后将Lys的Fmoc基脱除，再经逐步法一次与 Fmoc-Arg(Mtr)-OH、 Fmoc-Gly-OH及Boc-Ida-OH缩合，得到 Bco-Ida-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg誦)--Ala- 树 月旨。后者经TFA-EDT-H2O(90:5:5)处理，脱除Boc及Mtr基。最 后经10%TEA/EtOAc中和及曱胺解切除树脂得到目标化合物。 ESI-MS分析1135.6 [M+H〗+
1 药理实验
本发明涉及的各化合物经过下述的实验评价其生物活性
1、 体外对肿瘤细胞侵袭重组基底膜影响实验
在Transwell小室中，将各合成肽分别与高转移性肺巨细胞癌PG细 胞在37°C、 5%(302条件中共育48小时后，再浸入含趋化因子的溶液 中作用10h。滤膜经染色、淋洗，于显微镜下计数各视野的侵袭细胞数。 取平均值，按下公式计算侵袭抑制率(结果见表l)-侵袭抑制率(％) = 1『旭药组侵-表堪胞数
2、 体内黑素瘤肺转移试验
对照组侵袭细胞数
x ■%
用B,6-F,。高转移黑素肿瘤细胞接种的C57/BL6近交系小鼠为模型，
10只为一组，先在爪趾接种瘤细胞，随后腹腔注射各组的肽化合物， 剂量为lmg/只/天。共25天后解剖动物，检査统计肺部转移灶。抑制 率由下公式计算(结果见表l):
侵袭抑制率(％) = i-^SIfSSS: x ■%
接种对照组肺瘤灶数 表i.部分叉聚肽对肿瘤细胞侵袭与转移的抑制作用
RGD
Y1GSR
RGD RGD
RGD YIGSR
YIGSR YIGSR'
EILOV-曰LOV RSGIY-RSGIY
EILDV-YIGSR
* O-lda
肽结构体外抑制率(％)体内抑制率
29.2111
38.7319
:Lys-OMe7.70一
'-Lys-OMe70.3161
^Lys-OMe59.8253
，Lys-NHEt*39.1047
,，Lys-Glyol61.9760
')Lys-pAla-NHMe72.6881
上述结果表明，①不同活性肽段构成的"鸡尾酒式"叉聚肽的抗癌侵
润及抗转移的作用强于均叉肽，更强于非叉的线性肽；②活性差别在 体内更明显。
权利要求
1、一类化合物，其特征在于，它们具有下列结构通式id="icf0001" file="A2006101144480002C1.gif" wi="133" he="14" top= "39" left = "41" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，Z1、Z2，相同或不同，Z、Z1、Z2分别独立的选自Arg-Gly-X1(X1＝Asp，Ida)X2-X3-Gly-Ser-Arg(X2＝Tyr，3，5二羟基苯甲酰Gly；X3＝Ile，Cys)X4-X5-Leu-X6-Val(X4＝Ida，Glu；X5＝Ile，Cys；X6＝Asp，Ida)其中Glu可以替换为3，5-二羟基苯甲酰Gly、Asp可以替换为Ida、Arg可以替换为Arg(NO2)及上述结构的反序肽段，正序及反序的类似肽段X选自Ala、-Ala或des(缺失)R选自OH、OCH3、NH2、NHR’(R’＝C1～10烷基)、NH-CH2-CH2-OH。
2、 根据权利要求1的化合物，其特征在于，R选自NHMe、 NHEt、 NHCHMe2、 NHBu。
3、 根据权利要求1的化合物，其特征在于，Z、 Z1、 ZZ分别独立的选i)Arg-Gly-AspArg-Gly-IdaIda-Gly-ArgTyr-Ile-Gly- Ser-ArgArg-Ser-Gly-Ile-TyrIda-IIe-Leu-Asp-ValGlu-Ile-Leu-Asp-Val-Glu-Ile-Leu-Ida画Val3，5-二羟基苯曱酰-Gly-Ile-Leu- Ida-Val。
4、 根据权力要求1-3中所述的化合物，其特征在于，所述的化合物选 白<formula>formula see original document page 2</formula><formula>formula see original document page 3</formula>Arg-Gly-Asp—Lys—(3-Ala-NHMe Tyr-lle-Gly-Ser-ArgTyr-lte-Gly-Ser-Arg—Lys—p-Ala-NHMe lda-Gly-Arg 。
5、 一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如权利要求1-4 所述的任一化合物及药用栽体。
6、 根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可 以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、緩释制剂、控释制剂及各种微粒给 药系统。
7 、权力要求1 - 4中所述的所述的任一化合物在制备抗癌转移药物组 合中的应用。
全文摘要
本发明公开了一类以赖氨酸为支架的具有混双叉链结构的叉聚肽化合物；本发明还公开了这类叉聚肽的制备方法，包括液相片段合成、固相逐步合成、液-固片段组装合成；含有这类叉聚肽的药物组合物，体外、体内抗癌细胞浸润及转移的活性试验表明这类叉聚肽化合物可抑制癌细胞转移。
文档编号C07K2/00GK101177449SQ200610114448
公开日2008年5月14日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者付招娣, 刘红岩, 波 施, 杨潇骁, 王德心, 邱传亮, 锐 韩, 香 韩, 喜 龚 申请人:中国医学科学院药物研究所