本发明属于多肽药物合成的技术领域，特别涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术：
利拉鲁肽，多肽序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG，分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20Da。利拉鲁肽是通过基因重组技术，利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。
现有的利拉鲁肽合成方法多为固液合成法，且合成周期长，生产成本高，不利于利拉鲁肽的大规模生产。US6268343B1和US6458924B2的合成方法中，中间体GLP-1(7-37)-OH均是在液相条件下与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，由此会导致产生许多杂质，降低产品的纯度和使用效果。
授权公告号CN 103145828 B一种利拉鲁肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，经过微波反应技术的处理，缩短了反应时间，提高了缩合效率。侧链修饰采用新颖ivDde侧链保护的赖氨酸，进行侧链修饰合成，期间采用20％哌啶脱Fmoc保护，直至直链多肽合成完毕。其次采用水合肼脱ivDde保护后，进行侧链修饰反应，得到的在固相载体上的全保护利拉鲁肽通过三氟醋酸的处理得到利拉鲁肽粗品。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的固相合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产利拉鲁肽粗肽产品的广泛应用前景,以用于大规模生产利拉鲁肽。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)以2-Cl Resin为起始树脂载体，通过固相合成法，并采用特异性微波技术反应，依次连接利拉鲁肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin如下：
Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；
(2)脱除赖氨酸的侧链保护基Dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽Ⅱ-2-Cl-Resin如下：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；
(3)切割沉降、冻干后，得到利拉鲁肽粗肽产品如下：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG；
步骤(1)所述氯树脂优选为2-Cl Resin；反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，进行多肽的连续缩合反应；所述特异性微波反应技术指在氨基酸的缩合反应步骤，缩合反应15min后，将Fmoc-利拉鲁肽-2-Cl Resin使用特异性的微波合成反应20s。
步骤(1)中缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，缩合反应中氨基酸投料量为1.5倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为25℃。
步骤(2)所述脱除赖氨酸的侧链保护基Dde的脱除反应，脱除试剂为水合肼：DMF＝1:15体积比的混合溶液，反应液体积为反应器容积的1/3-1/2。
步骤(3)所述切割沉降反应，切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2摩尔比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到利拉鲁肽粗肽产品。
本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率。本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。
实施例一
利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
1、2-Cl Resin的溶胀
称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。
2、Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin为：
Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-31个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Pip：六氢吡啶
TFA：三氟醋酸
tBu：叔丁基
DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
(1)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的合成
称取118.92mg Fmoc-Gly-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加3ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1h。
(2)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的封头反应
配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
(3)树脂的洗涤方法
用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。
(4)脱除Fmoc保护基
加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(5)保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-Cl-Resin的缩合为例，称取583.9mg Fmoc-Arg(pbf)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(6)Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应20-30min，然后将反应器置于微波化学反应器中微波反应20s后洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-31个Fmoc-保护氨基酸，即得到Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin。
实施例二
利拉鲁肽Ⅱ-2-Cl-Resin的合成
(1)连接Boc保护基
多肽连接至最后一个氨基酸缩合成功后，洗涤4次，将Boc酸酐(Mw＝218.25，ρ＝1.02g/cm3)按照第一个氨基酸投料量的三倍物质的量计算体积，DIEA:DCM＝1:4溶液3ml，溶液混合均匀，加入到反应器中反应20min。
(2)脱除Dde保护基
Boc接上后用DMF洗4遍后脱Dde，按照水合肼：DMF＝1:15配置溶液，每次用三倍树脂体积的混合溶液脱Dde，震荡反应5min后用DMF洗涤3次，第3次水合肼溶液脱Dde后，DMF洗涤5次。
(3)侧链氨基酸的连接
待脱Dde完成后，按固相氨基酸的缩合方法，连接侧链氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，缩合成功后用DMF洗5次，抽干，得到利拉鲁肽Ⅱ-2-Cl-Resin。
实施例三
利拉鲁肽粗肽产品的切割沉降
(1)配置切割试剂
100ml配方为:87.5ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5ml EDT+5g苯酚，置于棕色试剂瓶中。现配备用，配制量一般为1g树脂加10ml切割试剂。
(2)利拉鲁肽-2-Cl-Resin的切割
向抽干的反应器中加入切割试剂，置于脱色摇床上摇晃反应1h，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到利拉鲁肽粗肽产品。
实施例四
利拉鲁肽粗肽产品的收率
切割沉降后的粗品呈乳胶状态，其中含有较多的TFA盐和切割试剂，本发明采用C18色谱柱进行除盐，以便计算粗品得率。
将样品溶解并过滤，采用流动相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序进样分析：
称量冻干后的利拉鲁肽粗肽产品，质量为1075.3mg，经分析计算，粗品纯度为58.3％，粗品收率为85.8％，比现有技术仅60-70％的收率有大幅度提高。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。