一种纯化利拉鲁肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多肽化合物的纯化方法，主要是涉及到运用不同基质填料为固定相的色谱柱以及与不同纯化体系相结合，纯化一种固相合成利拉鲁肽的方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种全球性的高发病，全球约有4亿2型糖尿病患者，到2035年，这一数字将接近6亿，其中80%生活在中低收入国家。据流行病学统计，我国2010年糖尿病患者近9200万。由于糖尿病涉及全身各个系统，甚至诱发愈多致使性并发症，严重影响任的劳动能力，并威胁人的生命安全，对你们的健康形成极大的危害。尽管已有多个2型糖尿病管理的临床指南，但目前尚缺乏不同国家和地区患者管理模式、影响治疗决策的因素以及相应治疗结局的相关资料。纪立农教授等开展的DISCOVER(NCT02322762)研究项目将提供来自5大洲25个国家12000名2型糖尿病患者的相关数据。
[0003]利拉鲁肽是第一个也是目前唯一一个人GLP-1 (胰高素样肽-1)类似物，可以长效治疗糖尿病，在欧洲美国日本已获广泛应用。胰高素样肽-1是一种肠促胰素，当口服摄入营养物质时，胰高素样肽-1可以促进胰岛素的分秘，但人体的GLP-1可被二肽基肽酶-4(DPP-4)迅速降解。利拉鲁肽是GLP-1受体完全激动剂，其97%的氨基酸序列和人GLP-1分子相同。人结构上说，两个分子间只有两处存在差别，首先C16脂肪酸在第26位上通过谷氨酸连接到赖氨酸上。其次，在第34们上赖氨酸被精氨酸所替代，以确保C16侧链只能结合在第26位上。脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血夜中与白蛋白可逆性地结合，使利拉鲁肽的作用时间延长，且增强对DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸侧链还可以使利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体，从而延缓其自皮下吸引，使其作用时间可长达接近24小时，每天注射一次并且可在任意时间注射，与进餐无关。适合成人2型糖尿病患者，以葡萄糖浓度依赖的方式调节血糖，直接保护B细胞，增加胰岛素分泌和减少a细胞不当的胰高糖素分泌，通过提高饱腹感和减少热量摄入而降低体重，降低收缩压.越早应用越好。利拉鲁肽绝对是2型糖尿病治疗领域革命性的药物。
[0004]2008年诺和诺德公司研制出治疗糖尿病的新药，胰高糖素样多肽-1 (GLP-1)类似物一利拉鲁肽(Liraglutide)。利拉鲁肽是胰升血糖素样肽I ( GLP-1)经脂肪酸修饰后的衍生物，可降低2型糖尿病(T2DM)患者的HbAlc水平、降低体重和改善β细胞功能。由于它仅在人体血糖高于正常值时才刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，因此不会引起严重低血糖不良反应。2010年I月25日，利拉鲁肽被FDA批准用于治疗2型糖尿病，可单独作为2型糖尿病的二线治疗药物，也可与其他口服降糖药联合使用。利拉鲁肽注射剂是等渗注射液，经皮下注射给药，血药浓度达峰时间为10~14h，半衰期为ll~13h，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其药代动力学特性不受性别或年龄影响。
[0005]目前也有不少针对纯化利拉鲁肽的方法以及相关的专利，但是都有一个问题在里面，步骤繁琐并且收率很低，还有一些专利里面涉及到的色谱柱子的填料品种较多并且有些填料也是非常昂贵的。因为利拉鲁肽是一个很疏水的三十一肽，采用一般的纯化方法不仅分离效果不好而且收率很低柱子损伤也很大。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一条适于纯化利拉鲁肽的方法，主要解决现有技术分离得到利拉鲁肽纯度较低且收率低的技术问题。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤:
O将固相合成的利拉鲁肽粗样溶解于质量百分浓度为10%的稀氨水溶解中，得粗液；2)取粗液，以聚苯乙烯二乙烯苯基质的填料为固定相，配置含有质量百分浓度为0.1%的氨水水溶液为B相，含有质量百分浓度为0.1%氨水乙腈溶液为A相，梯度为20-70%，检测波长245nm进行HPLC线性梯度洗脱，得到第一步样品溶液，样品溶液为偏碱性；
3 )取第一步样品溶液用质量百分浓度为20%的碳酸氢铵调样品溶液pH值至偏中性，然后对样品溶液减压浓缩至50-500ml左右(去除过多的乙腈溶液，为第二步纯化做准备)；
4)将偏中性的样品溶液进行第二步纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，配置含有质量百分浓度为0.01%的盐酸水溶液为B相，含有质量百分浓度为0.01%的盐酸乙腈溶解为A相，梯度为40-65%进行HPLC线性梯度洗脱，得到第二步样品溶解，样品溶液为偏酸性；
5)取第二步样品溶液用弱碱性阴离子树脂转盐至偏弱碱性，得到含有弱碱性样品溶液，弱碱性条件下的利拉鲁肽产品相对更加稳定；
6)将转盐后的样品溶解进行减压浓缩，冷冻，干燥，得到最终产品。
[0008]本发明的有益效果:经研究发现聚苯乙烯二乙烯苯可以承受强酸强碱，以此填料为固定相的色谱柱，加上碱性质量百分浓度为0.1%的氨水体系做第一步纯化，然后再用以普通十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，加上质量百分浓度为0.05%的盐酸体系做第二步纯化。两大步骤最终能得到高纯度的利拉鲁肽成品，且收率高达64.5%。
【具体实施方式】
[0009]一种纯化利拉鲁肽的方法，包括如下步骤:
1.样品处理:将固相合成所得的利拉鲁肽用质量百分浓度为10%左右的稀氨水来溶解(溶解浓度约为15mg/ml)，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用；
2.纯化
第一步纯化条件:色谱柱:以聚苯乙烯二乙烯苯基质的填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:3CmX25Cm.流动相:A相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水水溶液；B相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水乙腈溶液。流速:25-30ml/min。检测波长:245nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:20-65%，梯度处理时间40-55min。进样量为0.8g ;
纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为溶解过滤之后的样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，纯度为92%左右，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
3.将纯化后收集的肽溶液用20%的碳酸氢胺调样品溶液PH值至偏中性，减压浓缩至一定体积50-100ml除过多的乙腈，为了第二步纯化做准备)
4.第二步纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:3CmX25Cm，流动相:A相配比含有质量百分浓度为0.01%的盐酸水溶液；B相:色谱纯乙腈溶液；流速:25-30ml/min ;检测波长:245nm.梯度:流动相B的质量百分浓度:40-60%，梯度处理时间45-60min ;进样量为第一步纯化浓缩之后含量92%的样品溶液；
纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为第一步纯化浓缩之后含量92%的样品溶液，线性梯度洗脱，收集目的峰，纯度为98%左右，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
5.转盐:取10g阴离子交换树脂LeratitMP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗，再碱洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；
6.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过40°C，然后冷冻干燥得纯度大于98.0%的利拉鲁肽，纯化收率可得60%以上。
[0010]实施例2
1.样品处理:将固相合成所得的利拉鲁肽用质量百分浓度为10%左右的稀氨水来溶解(溶解浓度约为30mg/ml)，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用；
2.纯化
第一步纯化条件:色谱柱:以聚苯乙烯二乙烯苯基质的填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:5CmX25Cm.流动相:A相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水水溶液；B相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水乙腈溶液。流速:45-50ml/min。检测波长:245nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:30-70%，梯度处理时间50-60min。进样量为2.785g ;
纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为溶解过滤之后的样品溶液。