专利名称：利拉鲁肽变构体及其缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及利拉鲁肽变构体及其缀合物。
背景技术：
利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司研制的胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)受体激动剂， 在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-I相似。利拉鲁肽的分子结构与 GLP-I (7-36)类似，不同之处在于利拉鲁肽将GLP-I的第34位赖氨酸替换为精氨酸，并在第沈位增加了一个棕榈酰脂肪酸侧链。多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解的特性。利拉鲁肽作为一种皮下注射制剂，半衰期约12 14h，需每天一次使用，能起到良好的降低血糖作用，但给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性。因此，对利拉鲁肽进行结构改造及开发新的剂型，从而延长其血浆周期和增加其系统性药物暴露，具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其缀合物，延长了半衰期，可有效地降低血糖浓度。本发明首先提供一种利拉鲁肽变构体，其氨基酸序列为 Xl-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-
X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-Xll ；其中Χ1 为 His 或 Cys ；X2 为 Gly 或 Cys ；X3 为 Thr 或 Cys ；X4 为 Ser 或 Cys ；X5 为 Ser 或 Cys ；X6 为 Ser 或 Cys ；X7 为 Glu 或 Cys ；X8 为 Ala 或删除；X9 为 Ala 或 Cys ；XlO 为 Leu 或 Cys 或 D-Ala ；Xll 为 Gly 或 Cys 或 Gly-Gly。采用上述技术方案，利拉鲁肽变构体保留了利拉鲁肽的生物学活性，可有效地降低血糖，且延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地。作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X5 为 Cys0作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为=His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Pa lmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X8 删除。作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α-Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述 XlO 为 D_Ala。作为本发明的进一步改进，所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly,所述 Xll 为 Gly-Gly。相应的，本发明还提供一种利拉鲁肽变构体的制备方法，包括如下步骤
A)2-CTC树脂用DMF洗涤2 3次，用DMF溶胀30分钟；
B)称取N端Fmoc保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化3飞分钟，加入反应柱反应广3 小时；
C)用体积比为1:4的哌啶和DMF混合液(DBLK)脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除；
D)重复上述步骤A、B和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用FmOC-Lys(AllOC)-0H，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；
E)脱除赖氨酸Alloc侧链保护基，偶联上I^almitoyl-Glu-OtBu，得到的肽树脂用DCM 洗3次，加入12eq苯基硅烷，反应5分钟，加入0. 8eq Pd (PPh3) 4，反应60分钟，用茚三酮检测，树脂有颜色，表明 Fmoc 已脱除；加入 kq Palmitamide-Glu-OtBu, 5eq H0At,5eq HATU, IOeq TMP，偶联2小时，收缩，抽干得到利拉鲁肽变构体树脂；
F)将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应广3小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；
G)对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；
H)用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和Edman降解分析其序列。本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。本发明还提供所述利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物，包含所述PEG修饰基团和所述利拉鲁肽变构体。采用上述技术方案，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，大大延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数。作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团的分子量在2 kDa 20 kDa之间。作为本发明的进一步改进，一个或者多个PEG修饰基团缀合到利拉鲁肽变构体上，所述PEG修饰基团可以相同，也可以不同。所述PEG修饰基团可以修饰的利拉鲁肽变构体位点包括
DCys的修饰PEG修饰基团可以通过Cys残基缀合到利拉鲁肽变构体上，以硫醚的形式实现特异性修饰；
2)N端氨基的修饰采用的PEG修饰基团为mPEG-丙醛，mPEG-丙醛的一个重要特性就是在酸性条件(ρΗ=5. 0)下，与α -氨基的耦合具有很高的选择性；3)侧链羧基的修饰利拉鲁肽变构体含有谷氨酸、天冬氨酸，谷氨酸和天冬氨酸是很有活性的修饰位点。第一种方法是以mPEG-NH2为原料修饰谷氨酸或天冬氨酸侧链，得到 Fmoc-Asp (mPE-NH) -OH或Fmoc-Glu (mPE-NH) -OH,再以这种氨基酸PEG修饰物为原料直接合成利拉鲁肽PEG侧链修饰物；第二种方法是选用烯丙酯保护的谷氨酸和天冬氨酸，肽链组装完毕后直接脱除烯丙酯，再与mPEG-NH2偶联，得到PEG修饰产物；
4)C端羧基的修饰采用的PEG修饰基团为PEG-NH2，用PEG-NH2在二环己基碳二亚胺或者1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐作用下与C端羧基偶联，得到PEG 修饰产物；
5)组氨酸侧链咪唑基的修饰。作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选自以下结构
(CH3) 2CH- (OCH2CH2)n- , CH3 (CH2) m- (OCH2CH2) η-, R- (OCH2CH2) η- , Lys-PEG2， Glu-PEG2 ,Tris-PEG3，Biotin-PEG11。其中，m表示广6之间的整数；η表示40 120之间的整数；R选自H、(0Γ030)烷基、环(C6 C30)烷基或苯基(C6 C30)烷基；
Lys-PEG2表示以赖氨酸为核的二分支型PEG ；Glu-PEG2表示以谷氨酸为核的二分支型 PEG ；TrIs-PEG3表示三分支型PEG ；Biotin-PEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团选自PEG或mPEG。相应的，本发明还提供一种制备所述利拉鲁肽变构体缀合物的方法，包括如下步骤
A)称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；
B)按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇勻使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；
C)用过量的Cys溶液终止反应，RP-HPLC检测反应并纯化得到目标化合物。作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液选自醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTA-NH4Ac缓冲溶液或EDTA-磷酸钠盐缓冲溶液。作为本发明的进一步改进，所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔比为 3飞；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0. 5^12小时。本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。本发明还提供所述利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明提供的利拉鲁肽变构体保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，为患者提供了更多的药物选择余地；本发明在提供利拉鲁肽变构体的基础上，通过PEG修饰基团的修饰，提供的利拉鲁肽变构体缀合物，在保留利拉鲁肽生物学活性的同时，延长了半衰期，不易被体内的蛋白酶降解，提高了稳定性，可以减少患者的用药次数；本发明提供的利拉鲁肽变构体及其缀合物的制备方法简便，降血糖和降体重的效果好，为降低血糖药物和降低体重药物的制备提供了更多的选择，延长了半衰期，提高了稳定性，降低了生产成本，有利于患者负担的减轻。
图1为本发明利拉鲁肽变构体的固相合成工艺流程图。图2为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5在体外对细胞内cAMP活性的影响。
图3为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物在体外对细胞内cAMP活性的影响。图4为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5降血糖作用实效试验。图5为本发明利拉鲁肽与利拉鲁肽变构体5缀合物降血糖作用实效试验。图6为本发明利拉鲁肽变构体5及其缀合物对体重的影响。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中。
权利要求
1.一种利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为 Xl-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ-glu tamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-Xll ；其中X1 为 His 或 Cys ；X2 为 Gly 或 Cys ；X3 为 Ilir 或 Cys ；X4 为 Ser 或 Cys ；X5 为 Ser 或 Cys ；X6 为 Ser 或 Cys ；X7 为 Glu 或 Cys ；X8 为 Ala 或删除；X9 为 Ala 或 Cys ；XlO 为 Leu 或 Cys 或 D-Ala ；Xll 为 Gly 或 Cys 或 Gly-Gly。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为=His-Ala-Glu -Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(Να -Palmitoyl-L- γ -glutamyl)) -Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X5 为 Cys0
3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Pa Imitoyl-L- γ -glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述 X8 删除。
4.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N- ε - (Να -Palmitoyl-L- γ -glutamyl)) -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 XlO 为 D_Ala。
5.根据权利要求1所述的利拉鲁肽变构体，其特征在于氨基酸序列为=His-Ala-Glu -Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(Να -Palmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly, 所述 Xll 为 Gly-Gly。
6.一种制备权利要求1所述的利拉鲁肽变构体的方法，其特征在于包括如下步骤A)2-CTC树脂用DMF洗涤2 3次，用DMF溶胀30分钟；B)称取N端Fmoc保护的氨基酸，加入有机碱DIEA，活化3飞分钟，加入反应柱反应广3 小时；C)用体积比为1:4的哌啶和DMF混合液脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮法检测 Fmoc是否脱除完全；D)重复上述步骤Α、Β和C，按照所述利拉鲁肽变构体的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨基酸，其中，赖氨酸采用FmOC-Lys(AllOC)-0H，直到序列中最后一个氨基酸偶联结束；Ε)脱除赖氨酸Alloc侧链保护基，偶联上I^almitoyl-Glu-OtBu，得到利拉鲁肽变构体树脂；F)将得到的利拉鲁肽变构体树脂用TFA裂解，反应广3小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链保护基；G)对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到所需要的利拉鲁肽变构体；H)用HPLC方法检测其纯度和含量，用二级质谱和Edman降解分析其序列。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低血糖的药物中的用途。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体在制备用于降低体重的药物中的用途。
9.一种利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于包含PEG修饰基团和权利要求1至5中任一项所述的利拉鲁肽变构体。
10.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团通过Cys、N端氨基、侧链羧基、C端羧基或组氨酸侧链咪唑基缀合到利拉鲁肽变构体上。
11.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团的分子量在2 kDa 20 kDa之间。
12.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团选自以下结构=(CH3)2CH-(OCH2CH2)n- ,CH3 (CH2) m-( OCH2CH2) n- , R-(OCH2CH2)n-，Lys-PEG2，Glu-PEG2，Tris-PEG3，Biotin-PEG11 ；其中，m表示广6之间的整数；η表示4(Γ120之间的整数；R选自H、(C1 C30)烷基、环 (〇6飞30)烷基或苯基(06飞30)烷基；Lys-PEh表示以赖氨酸为核的二分支型PEG ；Glu-PEG2 表示以谷氨酸为核的二分支型PEG ；Tris-PEQ表示三分支型PEG ；Biotin-PEG11表示末端连接生物素的11个单元PEG。
13.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物，其特征在于所述PEG修饰基团选自 PEG 或 mPEG。
14.一种制备权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于包括如下步骤A)称取一定量的所述利拉鲁肽变构体，溶于适当的缓冲溶液中；B)按一定的PEG修饰基团与利拉鲁肽变构体摩尔比，称取PEG修饰基团，加入上述缓冲溶液中，适当摇勻使PEG修饰基团溶解并与利拉鲁肽变构体反应；C)用过量的Cys溶液终止反应，RP-HPLC检测反应并纯化得到目标化合物。
15.根据权利要求14所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于所述缓冲溶液选自醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸钠盐缓冲溶液、碳酸氢钠、EDTA-NH4Ac缓冲溶液或 EDTA-磷酸钠盐缓冲溶液。
16.根据权利要求14所述的利拉鲁肽变构体缀合物的方法，其特征在于所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的摩尔比为3飞；所述PEG修饰基团与所述利拉鲁肽变构体的反应时间为0. 5 12小时。
17.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。
18.根据权利要求9所述的利拉鲁肽变构体缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供一种利拉鲁肽变构体及其制备方法，利拉鲁肽变构体的氨基酸序列为X1-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-X11；其中X1为His或Cys；X2为Gly或Cys；X3为Thr或Cys；X4为Ser或Cys；X5为Ser或Cys；X6为Ser或Cys；X7为Glu或Cys；X8为Ala或删除；X9为Ala或Cys；X10为Leu或Cys或D-Ala；X11为Gly或Cys或Gly-Gly。本发明还提供一种利拉鲁肽变构体缀合物及其制备方法。本发明提供的利拉鲁肽变构体及其缀合物保留了利拉鲁肽的生物学活性，延长了半衰期，有利于患者负担的减轻。
文档编号C07K1/06GK102321170SQ20111027134
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者刘建, 潘俊锋, 袁建成, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司