专利名称：一种合成利拉鲁肽的方法
技术领域：
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利拉鲁肽的方法。
背景技术：
利拉鲁肽，英文名为Liraglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗II型糖尿病的药物。利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-I (GLP-I)类似物，其作为GLP-I受体激动剂能起到良好的降低血糖作用，肽序如下NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys (N- ε - (N- a -Palmitoyl-L- Y -glutamyl ))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH利拉鲁肽与天然GLP-I分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈·酰脂肪酸侧链，与天然人GLP-I有95%同源性。并且由于脂肪酸侧链的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能与白蛋白结合因而有较高的代谢稳定性。在利拉鲁肽的现有合成方法中，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽，但是国内无法得到酵母菌种进行生产。专利US6268343B1、US6458924B2以及文献 “Journal of Medicinal Chemistry 43,1664-1669, 2000” 均公开了利用中间体GLP-I (7-37) -OH和N° -alkanoyl_Glu (ONSu) -OtBu来制备利拉鲁肽的方法，但是这三种现有技术中，中间体GLP-1 (7-37) -OH均需要反相HPLC纯化，再在液相条件下与Na-alkanoyl-Glu (ONSu) -OtBu反应，并且由于GLP-1 (7-37) -OH N端未保护以及侧链保护基全部脱除，会导致产生许多杂质，难以纯化，操作繁琐，周期长，废液多，不利于环保，并且两步纯化，需花费大量乙腈，成本高昂，不利于大规模生产等。中国专利CN102286092A公开了一种全固相合成方法，采用2-CTC树脂或王树脂，按照利拉鲁肽肽序逐个偶联氨基酸，最后经过反向纯化得到利拉鲁肽，其不需要两步纯化而且杂质较少，优于上述几种现有制备方法。但是，这种方法需要逐个偶联氨基酸，合成周期长，总收率较低，仅为15%左右(参见CN102286092A实施例12-14)，仍需要进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利拉鲁肽的方法，使得本发明所述方法能够提高其总收率。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种合成利拉鲁肽的方法，包括以下步骤步骤I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、His侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段I ;固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2 ；固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段3 ；固相合成在SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列N端、Gln侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有Na-Palmitoyl-L- y -glutamyl-OtBu的多肽片段4 ；固相合成在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上偶联有保护基的多肽片段5 ；步骤2、将多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶联，偶联后脱除多肽片段4的N端保护基，得到肽树脂I ;步骤3、将多肽片段3的C端和肽树脂I的N端偶联，偶联后脱除多肽片段3的N端保护基，得到肽树脂II ；步骤4、将多肽片段2的C端和肽树脂II的N端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到肽树脂III ； 步骤5、将多肽片段I的C端和肽树脂III的N端偶联，得到利拉鲁肽树脂；步骤6、利拉鲁肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。其中，步骤I所述固相载体为树脂固相载体，更优选为2-CTC树脂。利拉鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能有利于提高利拉鲁肽的总收率。为此，申请人根据长期的试验研究以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来制备利拉鲁肽，提高了总收率。在本发明所述方法中，首先按照利拉鲁肽主链肽序分成5个片段，分别先合成这5个片段，然后再将5个片段逐步偶联获得利拉鲁肽。以利拉鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式NH2-Hisl-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Valio-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-G1u15-G1 Y16-Gln17-Ala18-Ala19-LyS20 (N- ε - (N- a -Palmitoyl-L- Y -glutamyl)) -Glu21-Ph
e22_Ile23_Ala24_Trp25_Leu26_Val27_Arg28_Gly29_Arg30_Gly31_co()HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即为上式中编号1_4的多肽序列，SEQ ID N0:2所示氨基酸序列即为上式中编号5-10的多肽序列，SEQ ID N0:3所示氨基酸序列即为上式中编号11-16的多肽序列，SEQ ID N0:4所示氨基酸序列即为上式中编号17-24的多肽序列，SEQ ID N0:5所示氨基酸序列即为上式中编号25-31的多肽序列。本发明在步骤I中固相合成的多肽片段I是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基础上，在其N端、His侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段2是在SEQID NO: 2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段3是在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列基础上，在其N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段4是在SEQID NO:4所示氨基酸序列基础上，在其N端、Gln侧链上、Glu侧链上分别偶联保护基以及在其Lys侧链上偶联有Na-Palmitoyl-L-Y-glutamyl-OtBu (OtBu为谷氨酸上α羧基的保护基)；固相合成的多肽片段5是在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列基础上，在其C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上分别偶联保护基。本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过Trt保护基保护组氨酸、谷氨酰胺的侧链；通过OtBu保护基保护谷氨酸、天冬氨酸的侧链；通过tBu保护基保护苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸的侧链；通过Boc保护基保护色氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，除组氨酸外，其余氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而组氨酸优选通过Boc保护基进行保护。作为优选方案，步骤I所述固相合成多肽片段I具体为将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)>N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala_OH)、N端偶联有Boc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸(Fmoc-His (Trt) -0H)进行延伸偶联，偶联后 裂解脱除固相载体得到多肽片段I (Boc-His (Trt)-Ala-Glu (OtBu)-Gly-ΟΗ)。作为优选方案，步骤I所述固相合成多肽片段2具体为将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Val-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-ThrC tBu)-0H)>N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -0H)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段 2(Fmoc_Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Val_0H)ο作为优选方案，步骤I所述固相合成多肽片段3具体为将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (0tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu_OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段 3(Fmoc_Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-OH)ο作为优选方案，步骤I所述固相合成多肽片段4具体为将N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ala-固相载体，然后按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸(Fmoc-Ile_OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(FmOC-Phe-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu)-OH),N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc保护基的丝氨酸(Fmoc-Lys (Alloc) -0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln (Trt) -0H)进行延伸偶联，然后脱除赖氨酸保护基Alloc并和Na -Palmotiyl-Glu-OtBu偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多妝片段 4 (Fmoc-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-Palmitoyl-L- Y -glutamyl-OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-OH)。其中，所述Na-Palmotiyl-Glu-OtBu中，OtBu为谷氨酸上α羧基(即主链上的羧基)的保护基，是为了使谷氨酸侧链上的羧基和赖氨酸侧链上的氨基缩合偶联形成谷酰基(glutamyl),最终完成利拉鲁肽赖氨酸侧链的合成。作为优选方案，步骤I所述固相合成多肽片段5具体为将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H) > N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc 保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H), N端偶联有Fmoc保护基的纟颜氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的色氨酸(Fmoc-Trp (Trt)-OH)进行延伸偶联得到N段偶联有Fmoc保护基的多肽片段5，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段5 (Trp(Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-固相载体)，所述固相载体为王树脂或2-CTC树脂。在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与固相载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK脱除N端保护基。在上述固相合成多肽片段1-4的优选方案中，进一步优选采用2-CTC树脂为固相载体进行合成，更优选采用替代度范围为O. 65-1. lmmol/g的2-CTC树脂为固相载体进行合成。在上述固相合成多肽片段1-4的优选方案中，进一步优选采用体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液进行裂解。在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选采用HOBT / DIC双体系偶联剂、PyBOP / HOBt / DIEA三体系偶联剂或TBTU / HOBt / DIEA三体系偶联剂进行偶联。更优选为，在固相合成多肽片段1-4的优选方案中采用TBTU / HOBt / DIEA三体系偶联剂偶联；在固相合成多肽片段5的优选方案中采用HOBT / DIC双体系偶联剂偶联。对于这些多体系的偶联剂，其各组分的配比在本领域中是一定的且是公知的，在此不再赘述。在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种溶剂来溶解，以及采用DIEA或DIC来活化，更优选为采用体积比DMFiDCM为I: I的混合溶剂、DMF或DCM来溶解，以及采用DIEA来活化。在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选，所述偶联的氨基酸与固相载体的摩尔比为3-5:1，所述偶联的氨基酸与偶联剂中HOBt的摩尔比为1:1. I。在上述固相合成多肽片段4的优选方案中，进一步优选用苯基硅烷和四三苯基磷钯来脱除Alloc保护基。在上述固相合成多肽片段5的优选方案中，进一步优选，所述王树脂或2-CTC树脂的替代度为O. 3-1. Ommol/go在本发明所述方法步骤2至步骤6中，所述偶联优选采用HOBT / DIC双体系偶联齐[J、PyBOP / HOBt / DIEA三体系偶联剂或HBTU / HOBt / DIEA三体系偶联剂进行偶联，所述脱出N端保护基优选采用DBLK脱除N端保护基。对于这些多体系的偶联剂，其各组分的配比在本领域中是一定的且是公知的，在此不再赘述。在本发明所述方法步骤2至步骤5中，所述偶联优选采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种为溶剂，更优选为在步骤2和步骤3中采用体积比NMP = DMF为I: I的混合溶剂，在步骤4中采用体积比NMP = DMSO为I: I的混合溶剂，在步骤5中采用DCM为溶剂。在本发明所述方法步骤6中，作为优选方案，所述裂解采用体积比TFA = H2O 为95:5的混合裂解液、TFA:EDT:PHOHiH2O为90-95:1-5:1-3:1-2的混合裂解液或TFA:PhSMe:TIS:PH0H:H2O为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液裂解，更优选为采用TFA:PhSMe:TIS:PHOHiH2O 为 80:5:5:5:5 的混合裂解液裂解。在本发明所述方法步骤6中，作为优选方案，所述纯化为HPLC反向纯化。由本发明所述方法合成的利拉鲁肽经HPLC检测，纯度为99%以上，总收率为30%以上，而且本发明所述方法中5个片段可以同时进行合成，与现有逐个合成氨基酸的技术方案相比，能够极大地缩短合成周期，提高效率。由以上技术方案可知，本发明先固相合成利拉鲁肽其中的5个多肽片段，而后再将多肽片段偶联制成成品，所述方法能够极大地缩短合成周期，提高效率，而且提高了利拉鲁肽的总收率，优于现有的合成方法。
具体实施例方式本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明具体实施方式
中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用王树脂和2-CTC树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表I。表I英文缩写释义
Fmoc9-荷甲氧裁基
叔丁氧羰基 tBu叔丁基
权利要求
1.一种合成利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、His侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段I ; 固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2 ； 固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段3 ； 固相合成在SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列N端、Gln侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有Na-Palmitoyl-L- y -glutamyl-OtBu的多肽片段4 ； 固相合成在SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上偶联有保护基的多肽片段5 ； 步骤2、将多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶联，偶联后脱除多肽片段4的N端保护基，得到肽树脂I ; 步骤3、将多肽片段3的C端和肽树脂I的N端偶联，偶联后脱除多肽片段3的N端保护基，得到肽树脂II ； 步骤4、将多肽片段2的C端和肽树脂II的N端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到肽树脂III; 步骤5、将多肽片段I的C端和肽树脂III的N端偶联，得到利拉鲁肽树脂； 步骤6、利拉鲁肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。
2.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I所述固相合成多肽片段I具体为 将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(0tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Boc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸(Fmoc-His (Trt) -OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段 I (Boc-His (Trt)-Ala-Glu (OtBu)-Gly-ΟΗ)。
3.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I所述固相合成多肽片段2具体为 将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Val-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu) -OH)> N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)_0H)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe_OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -0H)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多妝片段 2 (Fmoc-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Val-OH)
4.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I所述固相合成多肽片段3具体为 将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu) -OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多妝片段 3 (Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-ΟΗ)
5.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I所述固相合成多肽片段4具体为 将N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ala-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(FmOC-Phe-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (0tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc保护基的丝氨酸(Fmoc-Lys (Alloc) -0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln (Trt) -OH)进行延伸偶联，然后脱除赖氨酸保护基Alloc并和N°-Palmotiyl-Glu-OtBu偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多妝片段 4 (Fmoc-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-Palmitoyl-L- Y -glutamyI-OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-OH)。
6.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I所述固相合成多肽片段5具体为 将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf) -OH), N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基的缴氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的色氨酸(Fmoc-Trp (Trt) -OH)进行延伸偶联得到N段偶联有Fmoc保护基的多肽片段5，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段5 (Trp(Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-固相载体)，所述固相载体为王树脂或2-CTC树脂。
7.根据权利要求2-5任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的固相载体为2-CTC树脂。
8.根据权利要求2-5任意一项所述方法，其特征在于，所述裂解采用体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液裂解。
9.根据权利要求2-6任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用HOBT / DIC双体系偶联剂、PyBOP / HOBt / DIEA三体系偶联剂或TBTU / HOBt/DIEA三体系偶联剂偶联。
10.根据权利要求2-6任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种。
11.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2至步骤6所述偶联采用HOBT/ DIC双体系偶联剂、PyBOP / HOBt / DIEA三体系偶联剂或HBTU / HOBt/DIEA三体系偶联剂偶联。
12.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2至步骤6所述偶联采用的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种。
13.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤6所述裂解采用体积比TFA= H2O为95:5的混合裂解液、TFA:EDT:PHOHiH2O为90-95:1-5:1-3:1-2的混合裂解液或TFA: PhSMe: TIS: PHOHiH2O 为 80-85:1-5:1-5:1-5:1-5 的混合裂解液裂解。
全文摘要
本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成利拉鲁肽的方法。本发明所述方法按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸的5个多肽片段，然后偶联5个多肽片段合成利拉鲁肽。本发明所述方法能够同时进行5个片段的合成，极大地缩短合成周期，提高效率，而且该方法能够提高利拉鲁肽的总收率，优于现有的合成方法。
文档编号C07K14/605GK102875665SQ20121036996
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者潘俊锋, 覃亮政, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司