人乳头状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置制造方法
【专利摘要】本发明公开一种用于快速基因型鉴定的方法和装置，在一个实施例中，本发明被应用到人乳头状瘤病毒(HPV)的基因型鉴定，包括使用病毒基因型特异性寡核苷酸探针、反向斑点杂交基因型点阵方式和导流杂交过程，从而提供一种更高效、更快速和更经济的方法进行HPV基因型鉴定。这种基因型鉴定的方法可以兼容通用探针，从而扩大了HPV基因型的检测范围。
【专利说明】人乳头状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
[0001]本申请要求2010年4月29日提交的美国专利申请序号12/770034的优先权，该申请是部份接续2006年4月4日提交的美国专利申请序号11/398433，而后者是部分接续2002年11月7日提交的美国专利申请序号10/291168，同时该申请声明要求2001年11月7日提交的美国专利申请序号60/345948的权益。美国专利申请序号11/398433也是部分延续2002年11月9号提交的美国专利申请序号10/293248。前述申请内容特此全文并入本申请中作为参考。
【技术领域】
[0002]本发明是关于鉴定人乳头状瘤病毒的多种基因型。
【背景技术】
鉴定人类白细胞抗原(HLA)
[0003]在器官或骨髓移植中，通过准确的HLA分型使得供体和受体相匹配(4)，是预防急性移植物抗宿主病(GVHD)发生的关键。HLA分型通常是通过标准血清学分型(2)来完成。最近的研究表明，DNA分型提供的结果更加准确和肯定(7，9，8)。将HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP分型检测结果用于高精度匹配，这已是选择潜在器官捐献者的必备途径(3)。先前已有报道，利用序列特异性引物的聚合酶链反应(SSP-PCR)扩增，可进行HLA基因分型。然而，由于HLA-DQ、DR和DP位点的高度多态性，所需序列特异性引物(SSP)的数目将会多达数百个，超出了多重PCR扩增极限，从而无法进行有效的PCR扩增。要确保HLA基因分型的结果在临床上有实际应用，必须设置多项检测，每项各有50至100个独立的PCR反应。如今市场上提供一种试剂盒，其中包括一个扩增过程，需要进行96个独立的PCR反应，然后对凝胶电泳分离得到的片段大小进行分析。这不仅耗费时间和金钱，而且非常容易出现差错，因为反应设置复杂，另外判断凝胶电泳中片段大小也存在不确定性。因此，DNA测序仍然被认为是HLA基因准确分型的首选方法。遗憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶链反应(PCR)中被共同扩增，使得单独通过DNA测序进行高分辨HLA基因分型将会更加困难并且昂贵。授予JWO Tam先生的美国专利第5471547和6020187号，公开了一种可以在费用低廉的设备上进行的快速退火过程，用于准确的突变型检测、基因分型和指纹图谱分析。本发明公开了一种使用改进的导流方式，利用ASO寡核苷酸探针对HLA基因座DP、DR和DQ beta序列进行快速分析的方法。
DNA指纹图谱快速鉴定人类和生物体
[0004] 1985年，基于限制性片段长度多态性(RFLP)的DNA指纹图谱首次应用于人类身份鉴定(12)，并随后开始应用于其他生物体的鉴定。在实际应用中，DNA指纹技术作为最好的法医学工具已经被广泛接受，可用于在刑事案件中确定犯罪嫌疑人、亲子纠纷、建立或证实一个人的身份。耗时的RFLP方法已逐渐被高通量的自动化过程取代。目前，利用PCR扩增，分析人类基因组10、16、18或更多位点上的短串联重复序列(STR)的数目(1991年发现(11))，已经实现了单细胞水平的鉴定。但是，不论STR还是可变数目的串联重复序列(VNTR)，都相对昂贵，因为这些方法需要使用复杂的设备，以及人工密集并且过程耗时的方法，比如Southern印迹杂交。自发突变(10)也可能会降低准确性和最终鉴定结果的确定性。此外，STR数据表明，突变的频率，特别是在癌症患者中，并不鲜见。因此，需要找到新的替代方法。单核苷酸多态性(SNP)基因型鉴定是在法医或个人身份识别中一种分辨率更高的方法，这种方法基于在不连锁位点上选择一定数量的SNP位点，其中每个位点的突变频率均低于VNTR或STR系统。本发明展示了一种利用SNP基因型鉴定的方法，快速、明确鉴定个体生物特征，包括人、动物、植物或其他生物。
HPV基因型鉴定
[0005]人乳头状瘤病毒(HPV)攻击粘膜细胞，具有高度多样性，世界范围内已报道的有大约200种不同的基因型，在不同种群中患病率各不相同。根据导致疾病的严重程度，人乳头状瘤病毒分为高风险株(HR)和低风险株(LR)。HR类型较常出现在宫颈的癌前病变或恶性病变，而LR类型多为良性病例(4)。每年有大约50万宫颈癌新发病例，死亡病例预计超过25万。因此，HPV感染与宫颈癌仍然是威胁全球女性的主要癌症(5)。基于这个原因，HPV筛查建议用于预防宫颈癌，因为它比细胞学方法更敏感(6，7)。
[0006]临床研究显示，99.7%的子宫颈癌与HR-HPV感染有关。尽管在大多数感染病例中，HPV可能会被清除，但是持续的HR-HPV感染，会导致重度宫颈上皮内瘤样病变(如:CIN
1、CIN II或CIN III)，并发展成为子宫颈癌(7，8)。因此，针对HPV病毒DNA的分析方法，已被开发并推向市场。美国食品药品监督局已经批准了 Hybrid capture2 (HC2)系统(Digene公司，美国马里兰州Gaithersburg)和AMPLICOR HPV测试(罗氏分子诊断,美国新泽西州Branchburg)。这些筛查测试 确定的是常见的HPV (HR株或LR株)是否存在，而无法区分其基因型。虽然这些测试提供了良好的HPV筛查检测，但是无法进行HPV的基因型鉴定限制了它们在临床诊断和预后中的应用，因为不同毒株引起疾病的严重程度有很大的不同，其中16型导致病症最为严重，紧随其后的是18型、33型、45型和59型等(8)。此外持续感染相同基因型的HPV，将进一步增加子宫颈癌的风险(9)。因此，有效和费用可接受的HPV基因型鉴定检测方法是最需要的。
[0007]LINEAR ARRAY HPV基因型检测(罗氏分子诊断，美国新泽西州Branchburg，涵盖37种基因型)和INNO-LIPA HPV基因型鉴定(Innogenetics公司，比利时，涵盖28种基因型)，可以作为HC2或AMPLICOR HPV测试的补充，用于区分特定HPV基因型，并确定涉及多个HPV基因型的感染。基于下列事实:1)不同HR-HPV毒株的致癌性不同；2)相同基因型的持续性感染导致风险升高；3)已有的HPV疫苗不能防止所有类型的HPV感染，除了确定HPV病毒存在与否的常规筛查，HPV基因型鉴定仍然是需要的。然而，上述测试非常昂贵，并且仍然使用传统的杂交过程，需要较高的运行成本和人工操作时间。最重要的是，这些基因型鉴定试剂盒不能检测超出预先设定的基因型谱，因此在HPV筛查中产生较高的假阴性率。因此，HPV基因型检测方法需要实现更快捷、更便宜、覆盖更多的基因型，并因此更高效，作为目前HPV检测的可负担的替代方法。
发明概要
HLA基因型鉴定
[0008]初步结果表明，在检测特定目标HLA的DNA序列时，等位基因特异性寡核苷酸反相斑点印迹(ASO-RDB)导流杂交是一种更好的选择。由其获得的数据代表HLA-DP、DR和DQbeta位点上的特征片段，因而能够准确地鉴定基因型。使用一对PCR引物和35个ASO寡核苷酸探针，可以将世界卫生组织(WHO)确定的83个DPBl等位基因进行有效的分类。同样，使用一对相同的PCR引物和18个ASO寡核苷酸探针，这个简单的杂交方法可以识别DR和DQ beta位点特定基因型的头两位编码，足以区分这些主要人类白细胞抗原。ASO数据通过直接测序法进行验证。但是，当相同的PCR引物对用于DR和DQ位点的直接测序时，经常会产生一些无法解释的数据，这是因为相同的引物对也可以同时扩增HLA基因簇内高度同源的内源性假基因片段。出于这个原因，DNA测序(许多人认为的金标准)可能无法保证HLA分类结果。在这样的情况下，为确认ASO数据，许多套相应于每一个待测HLA类型的PCR引物被创建，并用在独立的PCR反应中，以得到扩增产物进行测序。这是直接测序法费用高和耗时的一个主要的原因。相比之下，本发明提供了一种低成本的HLA识别程序，通过使用通用的引物对，执行一个简单的多重PCR，然后将所需数量的ASO探针，在低密度点阵列平台进行杂交。扩增所得到的HLA片段(包括假基因)，可以在一张包被有ASO探针的膜上进行明确的HLA分类。因此，这是一个比当前其他DNA或血清学方法优越得多的方法。尽管进行进一步具体的DR、DQ亚型分类，这种直接的导流方法需要额外的寡核苷酸探针，但是其数量已经完全在此平台检测能力范围内。本发明提供了一种更快和更简单的HLA分型技术，不需要昂贵的设备，因此制造和使用成本都低于直接DNA测序方法和多重PCR凝胶电泳过程。
[0009]此处公布的HLA基因型鉴定引物和寡核苷酸探针已经通过测试，并证实能用于上述相应的HLA-DR、DB和DP基因分类。依图1或图1A中设计所示，可以获得、测试、验证更多的引物或寡核苷酸探针，从而进行更全面的基因型鉴定。虽然在数据验证的例子中，PCR反应被用于扩增，但其它方法也可以使用，只要能够获得足够数量的特定靶序列用于ASO-RDB导流杂交分析。对本领域的普通技术人员而言，在阅读本文的教学后，其他适当的扩增方法或技术是显而易见的。只要能够获得足够数量的特定靶序列用于ASO-RDB导流杂交分析，扩增并非是必需的。检测可以通过对靶DNA或结合物进行标记来完成。
[0010]尽管在本申请中例示了 HLA基因型鉴定，遵照本应用的示教，基于SNP的基因型鉴定技术也可以应用到其他遗传材料或从任何有机体得到的序列，如图1或图1A中所示程序。类似美国专利第5741547或6020187号中描述的装置，或任何新的实施例，能够进行导流杂交的都可以使用。
SNP基因型鉴定
[0011]人类基因组与许多其他生物的基因组已经被测序和绘制图谱。任何物种内部，一般的DNA序列信息是非常相似的。然而，每一个物种都有它自己独特的一套遗传信息。因此，许多科学家们试图在种群中找到与疾病有联系的特征。例如，人类学家采用遗传变异来重建人类的历史，试图了解文化和地理对人类特征群体在全球分布的作用。单核苷酸多态性(SNP)数据可以实现这些目的(12)。Brightwell等报道了一个SNP基因型鉴定的应用，使用简单快速的，在单管中进行的，改进了的扩增阻滞突变系统(ARMS)，分析一个具有FRAXA重复扩张的男性群体中的6个SNP位点(15)。
[0012]本发明描述了等位基因特异性寡核苷酸(ASO)阵列的应用。在本领域的普通技术人员按照本应用的示教，可以轻易得到足够鉴定要求所需要的SNP数目。基于膜的微阵列ASO-RDB导流杂交平台(例如，见美国专利编号5741647)，可以用于进行SNP基因型鉴定。本发明的微阵列杂交平台上所产生的可见斑点，既可以通过目视检出，也可以通过使用成本低廉的图像分析仪分析。与此相反，目前市场上提供的杂交平台需要由高分辨率图像分析仪进行分析。原则上，基因组中的任何位置的单核苷酸多态性，只要数量足够，都可用于识别目的。然而，这可能会影响亲子鉴定和亲缘关系分析的准确性，因为在基因组不同部分的基因突变率有差异。因此，高度多态性位点或基因组中突变率相对较低的位点(包括但不限于编码区或任何满足条件的突变率相对低的区域)都可以选作以验证亲缘关系。从9个高度多态的染色体位点进行的单核苷酸多态性分析的初步数据显示，这些单核苷酸多态性已经足够用作SNP基因型鉴定。所需位点的数目将取决于鉴别要求的准确率，这对于本【技术领域】的普通技术人员在阅读本文的示教后是显而易见的。在构建每个位点的多态频率数据库时，对从50-150个无关个体取得的DNA样本进行测序。20个家庭亲缘关系的分析与STR Profile Plus人类身份试剂盒测试平行进行，结果100%吻合。SNP为基础的导流平台已被证明是人类身份识别的一个更好的选择。除了已经积累和分析的数据，在本【技术领域】的普通技术人员阅读本文的示教后，可以容易地实现多态频率数据库的扩展。
SNP基因型鉴定作为诊断工具
[0013]除了建立DNA指纹图谱，SNP基因型鉴定还可用于鉴定基因片段，或引起基因功能改变或减弱的基因多态性。出于这个原因，本发明可以用于快速、明确的鉴别传染性病原体、特定DNA序列造成的遗传性疾病，或者存在或缺失这类传染因子或DNA序列而引起的遗传性疾病。
HPV基因型鉴定
[0014]本发明提供了一种基于PCR试验的HPV基因型鉴定方法，包括通过基于膜的导流杂交技术(美国专利编号5741647)，共扩增一种人的基因作为内部对照，来测量样品中是否有靶HPV整合。这种方法确定了 33个高风险(HR)和低风险(LR)HPV病毒的基因型(6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82，84)。此外，新型通用探针也被设计用来捕捉具有HPV共有序列的HPV基因型。因此，在除了测试样板中包括的33种基因型，在临床筛查中通用探针还捕获至少5种其他HPV病毒亚型，敏感度和特异性令人满意，成本大幅度减少(10)，从而为HPV基因型鉴定提供了一个更好的选择。
[0015]虽然在数据验证的例子中，PCR反应被用于扩增，但其它方法也可以使用，只要能够获得足够数量的特定靶序列用于ASO-RDB导流杂交分析。对本领域的普通技术人员而言，在阅读本文的教学后，其他适当的扩增方法或技术是显而易见的。只要能够获得足够数量的特定靶序列用于ASO-RDB导流杂交分析，扩增并非是必需的。检测可以通过对靶DNA或结合物进行标记来完成。
[0016]类似美国专利第5741547或6020187号中描述的导流装置，或任何新的实施例，能够实施导流杂交过程的装置都可以使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1示本发明用于构建ASO探针和PCR引物库的方法。
[0018]图1A示本发明构建HLA基因型鉴定的寡核苷酸探针库的方法。[0019]图2示利用本发明的方法所获得的HLA-DQB基因型ASO检测结果。
[0020]图3示利用本发明的方法所获得的HLA-DPBl基因型ASO检测结果。
[0021]图4示某样本的HLA-DRB和DQB基因型鉴定结果。
[0022]图5示某样本的HLA-DPB基因型鉴定结果。
[0023]图6示本发明中用于高通量分析的膜。
[0024]图7示本发明中杂交装置的分解视图，以及连接到中央控制单元的多个侧向导流检测装置。在一个实施例中，杂交装置包括一个中央控制单元，和连接到中央控制单元的一个或多个侧向液流装置。中央控制单元提供电源并控制侧向液流装置，杂交和显影都在液流装置中进行。多个反应(或多个样品或分析物)可以同时在一个单一的侧向液流装置进行测试，也可以同时在几个装置(每个单独控制在不同的条件下)进行。侧向液流装置可以是nXm的点阵(排列)格式或线性点阵形式(如图所示)。由于在反应过程中，测试溶液从点阵的一端流至另一端(即从东到西或者由北向南的方向)，检测的灵敏度显著增加。灵敏度的增加程度取决于膜的面积和含有捕获探针的斑点或线的区域面积的比率。例如，假设的总面积是100平方毫米，斑点大小为I平方毫米。在直接导流过程中(即与常规流动过程一样，溶液从膜的顶部流动到膜的底部)，所使用的试验溶液仅有1/100会流经该点，而只有在该点目标分子才能与固定于膜上的探针结合。然而，如果使用侧向导流过程，灵敏度仅依赖于点的宽度和膜的宽度的比率(如膜的横截面)。例如，在一个侧向导流过程中，10毫米X 10毫米的膜上，从I毫米宽的点上流过的液体体积将是总量的约1/10，这意味着使用相同量的目标分析物(含有目标分子的试验溶液)，灵敏度有10倍的增加。当线性点阵被使用在侧向导流过程 中，灵敏度将进一步提高，因为所有的目标分子都将通过沿条带(或膜)分布的线。侧向导流过程允许定量测量，因为在杂交过程中待分析物的流动更加均匀。
[0025]图8示本发明用于构造SNP数据库的方法。
[0026]图9示使用SNP基因型鉴定人或生物体样本的数据。
[0027]图10示图8方法中使用的基因位点。
[0028]图11示一个中国人群样本中HLA-DPBl基因型鉴定结果(表1)。
[0029]图12示一个中国人群样本中HLA-DPBl等位基因和基因型频率(表2)。
[0030]图13示鉴定HLA各基因型的ASO寡核苷酸探针序列，和扩增相应片段进行分析的PCR引物对序列。
[0031]图14示鉴定HPV各基因型的寡核苷酸探针序列，和扩增相应LI片段进行分析的PCR引物对序列。“+A”表示腺嘌呤锁核酸，“+T”表示胸腺嘧啶锁核酸。
[0032]图15示HPV感染中HPV-33基因型鉴定阵列的典型影像。
[0033]图16示HPV感染中HR-HPV-14基因型鉴定阵列的典型影像。
[0034]图17示改进的HPV检测试剂盒简化筛查形式，以降低成本和提高通量。
[0035]图18示其他改进的HPV检测试剂盒简化筛查形式，以降低成本和提高通量。
【发明内容】
[0036]本发明使用下列术语描述。如果未在此处阐述具体定义，描述本发明所使用的术语均为本【技术领域】的普通技术人员所理解的通用意思。[0037]本处所用“等位基因特异性寡核苷酸反相斑点印迹(ASO-RDB) ”是指将等位基因特异的寡核苷酸探针固定在固体基质表面，在杂交过程中捕获待检测的目标分子。
[0038]本处所用“导流杂交”是指利用美国专利编号5741647中所描述技术进行的杂交过程。
[0039]本处所用“导流杂交装置”或“导流装置”指的是在美国专利编号6020187中所描述的设备和/或图5中所示的侧向液流装置，或随后设计的任何导流装置。
HLA基因型鉴定
[0040]下列文字描述了本发明从基因组序列数据库中获得HLA分型的ASO探针和PCR引物，并用于HLA基因型鉴定分析的方法。
选择合适的基因片段并确定适当的PCR引物和ASO位点
[0041]通过从GenBank中筛选，或对靶基因或DNA片段测序进行人群筛选，得到适合HLA基因型鉴定的SNP或ASO。
[0042]本发明中用于选择适当的目标序列的方法详述如下:
[0043](a)按各自的分类(I类、II类)和亚型(如DR、DQ和DP等)从GenBank中找出所有HLA DNA序列的数据。根据个自的分类和亚型对HLA DNA序列进行比对，以确定最具多态性的区域，用于HLA基因型鉴定。
[0044](b)在多态性区域内，确定PCR引物对能够匹配所感兴趣的亚型中的保守序列，从而当使用这些引物时，所有感兴趣的亚型都可以扩增得到PCR产物，用于进一步的导流杂交分析。
[0045](C)为验证这些引物的适用性，大量随机样本被用于PCR扩增，以获得统计学上该待查区域阳性扩增的满意结果，并确保没有由于假阴性扩增结果排除任何等位基因。除了统计学确认，验证时也包含内部对照(IC)，以确保测试样品中不存在任何PCR抑制剂，导致PCR扩增反应失败。内部对照的设计(可以是I个或多个)将取决于测试需要。利用HLA和SNP指纹图谱以及基因型鉴定确定遗传性疾病时，内部对照的序列不能和待查的人基因组存在同源性，也就是说，使用一个和待查序列完全无关的序列。由于人体细胞大多是二倍体的基因组(胚系细胞除外)，浓度问题相对非常简单，因为理论上测试位点的浓度或者是1(纯合子)或者是0.5(杂合子)。因此，两个序列不同而两侧具有相同PCR引物序列的片段即可作为内部对照。这是指，使用不同于待分析靶片段的片段作为内部对照时，可以选择该片段内部位点已知为纯合或杂合的序列作为探针，即该片段中有两个不同的探针(纯和探针和杂合探针)，这样使得这些内部对照的浓度比可以计算出来。由于PCR扩增不影响相对浓度，理论上信号的比值为2:1。比例上如果发生任何波动将被视作杂交效率的变化。以这两个比例为2:1的内部对照作为标准，分别指示待查位点为纯合子和杂合子。如果所观察到的结果表明只有一个等位基因，但待查浓度等于或小于0.5倍纯合子内部对照，或与杂合子内部对照比例接近1，此时应调查杂合性丢失的可能性:可能是两个染色体其中之一丢失或不能扩增。纯合子由于两个染色体是相同的，其印记点的预期结果应该是浓度接近纯合子内部对照，而不是杂合子内部对照。因此，内部对照对于获得精确的结果非常重要，因为临床上可靠的结果对任何诊断测试都至关重要。
[0046] 关于DNA数据库和序列比对的进一步信息可以在本申请的参考资料部分找到(见参考文献5和6)。[0047]这里所描述HLA基因型鉴定的程序，均可由本领域的普通技术人员在学习阅读本申请材料后，用于其他基因或感兴趣的DNA序列的基因型鉴定，或用于结合导流杂交过程来确定DNA指纹/识别的SNP检测。
[0048]为最大限度地提高PCR扩增的效率，通常选择的ASO探针的片段长度保持尽可能短，最好不超过几百个碱基对。
[0049]在开发基因型鉴定测试的过程中，如果找不到合适的引物对，可对PCR反应组分以及PCR扩增过程，即PCR程序进行调整，通过扩增反应条件的优化来确保产物得到扩增。这样的改进对于本领域的普通技术人员在学习阅读本申请材料后是显而易见的。在某些情况下，如果无法使用序列完全保守的PCR引物，可以使用具有相同识别位点的简并引物或多个引物。在这样的情况下，应该对PCR条件作出适当的调整，以确保不会错过任何位点。
[0050]如果不能找到成功区分亚型的独特区域时，可以使用多重PCR。设计引物时，引物的Tm值要保证扩增过程中的退火温度在可操作范围内。此处所述“Tm值”是指，例如，双链和单链的DNA分子浓度相等时的反应温度。因此，在较高的温度下更多的双链DNA解离成为单链，与此相反，在较低温度下，更多的单链分子将退火形成双链。对于一个序列数据未知的人群，通常通过直接DNA测序进行人群筛查。例如，对一个中国人群样本的筛查进行如下:(a)从超过一百个受试者随机取样，使用2对引物进行PCR扩增，随后使用ASO探针进行杂交，探针设计在下面章节描述；(b)DNA测序验证结果。
[0051]使用上述得到的数据，确定和选择被用于基因型鉴定的ASO位点。从GenBank或随机样本测序得到的数据中，判断用于抽样人群的HLA分型的位点选择是否的确为独特的。ASO探针的设计和独特性验证方法如下:
[0052](a)从亚型的序列比对中选择满意的多态性区域，进一步搜索得到具有独特性的20-30的核苷酸序列或片段。这样的独特性序列或片段将被用作等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针，通过杂交过程捕获已扩增的靶片段，从而检测到各独特的HLA亚型的存在。此处“独特的序列或片段”是指，例如，在这些亚型序列中，与该序列或片段完全同源的亚型序列只有一个。
[0053](b)为了验证ASO探针是独特的，将序列与GenBank中或欧洲的类似数据库中所有人类的DNA序列数据进行比对，以确定ASO探针是否的确是只100%匹配感兴趣的HLA亚型。这将确保至少在现有的数据基础上一直到新的序列发现前一ASO探针是该区域内特有的。
[0054](c)由于PCR扩增产物的长度要短，以提高扩增效率，单一 ASO探针可能不足以提供明确的结论以区分各独特亚型。因此，在同一 PCR片段和/或使用多重PCR生成的不同片段中，有必要运用多个ASO探针给出一个明确的基因型分类。在这种情况下，每一个给定的HLA亚型，将会产生一个独特的杂交谱图。经过深入的数据分析之后,ASO序列使用随机的人类DNA样本进行验证。
[0055]最终决定了使用的ASO捕获探针数量后，各基因型的点阵图谱将被确定。图2和图3显示的是特异性点阵图谱的例子。图2和图3所示的点阵图谱是用于测定HLA DRB、DQB和DPB亚型，分别使用了 18个ASO探针和35个ASO探针。
[0056]类似的步骤可以用于其他的基因和来自其它有机体的遗传物质。针对不同基因和不同应用，引物序列和ASO探针数目会有所变化。例如，人类身份识别可能需要50个或更多的ASO点阵以获得明确的识别(参见图3和图4)。检测形式可以包括一列点或线，取决于导流杂交装置的构造。
讲行ASO-RDB检测
[0057]ASO寡核苷酸被固定在膜或任何合适的基质上，用于捕获目标位点。此处“膜”是指，例如，任何合适的基质材料，能够固定ASO寡核苷酸探针，并且多孔以利于含有靶核酸分子的溶液自由通过。在一个实施例中，膜或基质可以是尼龙、硝酸纤维素、Biodyne、Porex、多孔金属或耐用凝胶基质。
[0058]靶序列(或位点)的固定可以通过共价键、非共价键(即静电吸引、疏水作用或其他的相互作用包括紫外线交联)，或通过介导物，如受体或抗体)的相互作用来实现。图2和3中显示的是Biodyne C膜，利用EDC在膜的羧基端和修饰后ASO探针的氨基端之间形成共价键。亲和素-生物素连接或ASO的多聚T尾部紫外交联也同样有效。
[0059]使用适当的引物对目标序列进行扩增，以生成足够量的扩增产物来满足分析需要。目标分子可以根据最终的信号检测方法，进行适当的标记以产生足够的信号。标记过程可以通过引物进行，在一个或两个引物5’末端共价结合上标记分子，或者在PCR扩增过程中，用标记的核苷酸代替四种dNTP核苷酸中的其中一种，使新延伸得到的扩增产物被标记。标记物可以是任何信号可以被检测到并显色的分子。生物素联合亲和素标记的酶可用于颜色检测。其它合适的标记系统包括(但不仅限于)胶体金和荧光标记、磁珠结合物、量子点、化学发光标记分子，或其它已经开发的或待开发的适合的系统也可以被应用。
[0060]ASO分析使用美国专利编号5741647描述的导流杂交方法进行。杂交在杂交室中进行，ASO捕获探针交联在膜上。ASO分析方法如下所述: [0061 ] (a)将含有靶DNA或序列的溶液变性并与膜接触；
[0062](b)用洗涤溶液(或者SSC，或封闭溶液)洗涤膜，最好三次；
[0063](c)显色，并目视检测或光谱测量。对于定量测量，可以使用扫描仪和图像处理软件来分析。另外，目标DNA或序列可以用荧光染料标记，并在洗涤步骤之后立即使用光谱成像仪分析。
[0064]结果与已知序列数据进行比较，以确保基因型检测的准确性。
[0065]探针和测试条件进一步优化，以提高基因型鉴定的准确性，并通过DNA测序验证RDB-ASO 数据。
骀证
[0066]使用随机样本进行验证。本发明的一个验证步骤描述如下:
[0067]如上文所述，一旦ASO的捕获探针被固定在膜上，足够数量的随机DNA样品被用来进行PCR扩增。靶序列或扩增并标记的DNA产物/分子被杂交以生成一个ASO点阵图谱。
[0068]HLA亚型和相应的DNA序列由ASO探针确定。相应的PCR样品被制备用于DNA直接测序。HLA基因型检测的验证，需要DNA测序的结果和导流阵列的结果相符。用于基因型检测验证的样品可以从任何随机选择的个体获得。一旦获得样品，真正的基因型鉴定可以如第3.5节中所述，经DNA测序进行。如果测序数据与从导流阵列得到的数据一致，数据的有效性即被确认。基因型检测的进一步验证可以通过现场测试进行，如随机抽样测试，数据分析和统计学比较，如灵敏度、特异性、阳性预测值或阴性预测值，以上均由独立实验室进行，以评估基因型检测的准确性。SNP基因型鉴定
[0069]下面是本发明用于构建SNP数据库和开发SNP基因型检测的方法。
选择SNP位点并确定排除概率
[0070]此处“排除概率”是指，比如区分人或有机体方法的准确性。例如，排除概率为100亿或1000亿分之一是指:当使用选定数目的SNP位点，分别需要筛查100亿或1000亿个体才可以找到两个完全相同的个体。
[0071]选择SNP位点并确定排除概率。此处“排除概率”是指，比如区分人或有机体方法的准确性。例如，排除概率为100亿或1000亿分之一是指:当使用选定数目的SNP位点，分别需要筛查100亿或1000亿个体才可以找到两个完全相同的个体。
[0072]选择适当的SNP寡核苷酸探针，以捕获特定的待分析靶序列，既可以通过从GenBank中筛选数据得到，也可以进行群体筛查，比如:靶基因或靶DNA片段的DNA直接测序，从而获得SNP /[目息和在群体中的频率。
[0073]从这些数据中，按照多态性频率，确定要用于指纹检测的SNP位点，并确定所选位点在这个群体中是否为突变热点，这可以通过群体中随机样本的测序来确定。确定所需要的SNP探针的数量，并计算总的杂合率以确定分析所用SNP位点的排除概率(即图9所示SNP点阵列)。
[0074]排除概率取决于在该位点上的SNP数量。例如,在一个指定的位点,如果有2个不同的碱基，例如G和A，发现在某个取样群体中各占50%。这样的概率是1/2。如果可以找到50个这样的位点(这些位点是随机分布的，在染色体上不相互连锁)，那么区分概率将是1/2的50次方。
进行SNP图谱检测(SNP点阵组合显示个体各位点相应的基因型组成)
[0075]设计合适的引物进行扩增，如上所述，筛查并确定位点后，再选择适当的SNP探针进行杂交检测。
[0076]扩增靶序列，通过导流杂交过程分析SNP图谱，方法如美国专利编号5741647所描述。
[0077]将上述获得的数据与已知序列数据比较，来评估SNP基因型鉴定分析的准确性。
[0078]优化SNP探针和测试条件，以提高SNP基因型鉴定分析的精确性。RDB SNP数据通过DNA测序进行验证。
[0079]用随机样本进行方法验证。
HPV基因型鉴定
[0080]在一个实施例中，本发明提供了一种快速鉴定人乳头状瘤病毒(HPV)基因型的方法。此处公开的发明也可以应用于筛查和检测其他的病毒、细菌、寄生虫或其它病原体。例如，本发明可用于结核病、乙型肝炎、丙型肝炎、传染性非典型肺炎和呼吸道感染病毒(单独的或组合的)的基因型鉴定。
[0081]在一个实施例中，快速检测人乳头状瘤病毒(HPV)的方法包括以下步骤:(a)获得含有核酸模板的样品；(b)用序列号116-118的引物扩增模板核酸，得到HPV LI的扩增产物；(c)HPV LI扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，探针选自序列号121-173组成的探针组，杂交结果将提示HPV病毒是否存在，其中包括高风险(HR) HPV病毒和低风险(LR) HPV病毒。在一个实施例中，引物含有一个信号标记。在另一个实施例中，引物中进一步包括了与内部对照互补的引物(例如，含有序列号为119-120的引物)。在又一个实施例中，寡核苷酸探针进一步包括能够捕获通用HPV病毒DNA的探针(例如，探针具有序列号为170-173的序列)，其中所述的探针包括锁核酸(LNA+iil)。在本发明中，使用LNA+?.-修饰的核苷酸能够增加用于HPV检测的寡核苷酸探针的热稳定性和靶特异性。
[0082]在一个实施例中，HPVLl的扩增产物与多个固定的寡核苷酸探针杂交是在一个导流过程或侧向导流过程中进行。在一个导流过程的实施例中，杂交的灵敏度取决于探针所占的面积与点阵所用膜的总面积的比率。在侧向导流过程的一个实施例中，杂交的灵敏度取决于流动方向上探针所占的横截面积与膜的总横截面积的比率。
[0083]在一个实施例中，上述方法可以检测下列的一个或多个HPV基因型:HPV6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82和8LHPV基因型可被单独检测，或者集合到一个或多个组中进行检测(例如，参见图15-18)。在一个实施例中，HPV16和18可被分别检测，而HPV31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，73，82可被集合到一个或多个组中进行检测(参见图16-18)，例如:HPV31,33，35，39可作为一组被检测，HPV45，51，52，56作为第二组，HPV58，59，73，82作为第三组。在另一个实施例中，该方法可以进一步在一个或多个组中检测HPV6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，57，61，66，70，71，72，73，81 和 84 (参见图 18 中的示例)。
[0084]本发明还提供了进行人乳头状瘤病毒(HPV)基因型鉴定的试剂盒，其中包括序列号为116-118的引物和选自序列121-173的寡核苷酸探针。在一个实施例中，引物进一步包括信号标记。在另一实施例中，引物中更进一步包括了与内部对照互补的引物(例如，含有序列号为119-120的引物)。在又一实施例中，寡核苷酸探针还进一步包括能够捕获通用HPV病毒DNA的探针(例如，探针具有序列号为170-173的序列)。在一个实施例中，该试剂盒可以检测一个或多个下列的HPV基因型:HPV6,11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82，和 84。HPV 基因型可被分别检测，或者集合到一个或多个组中进行检测(参见图15-18中示例)。
[0085]通过参考下面的实验细节，本发明将会更容易被理解。本领域的专业人员将容易理解，具体的实验细节只是用作说明的，并不意味着本发明只是局限于如下所示，这在后面的声明中会有准确解释。
[0086]本申请中引用了多种参考文献或出版物。这些参考文献或出版物的完整公开内容作为参考并入本申请中，以更加充分地描述本发明所涉及领域的状态。需要注意的是，过渡词“包含”与“包括”、“含有”或“特点在于”是同义词，是包罗广泛，没有固定限度的，并不排除额外的，没有被引用的原理或方法步骤。
实施例1 测试程序 DNA提取
[0087]推荐如下的实验方案，但也可以采用对在本【技术领域】的普通技术人员是显而易见的并同样有效的替 代方案。取有核细胞如白血细胞或组织，用PBS洗涤，离心，弃去上清。将细胞沉淀重新悬浮在200微升的PBS中。用QIAamp DNA mini试剂盒(QIAGEN)，按生产商推荐的“血液和体液离心实验方案”抽提DNA。其他市售用于分离DNA的试剂盒，也可以使用。但是，DNA的提取过程不能在最后提纯的DNA中掺杂有DNA聚合酶抑制剂，这对于确保有效的扩增至关重要。将DNA洗脱在50-200微升AE缓冲液中，并存储于_20°C备用。
PCR扩增
[0088]由于PCR扩增是极度敏感的过程，必须特别小心以防止交叉污染或假阳性结果。因此，必须遵守以下准则:PCR过程中须一直戴手术手套，最好在“前PCR”区域或干净的没有扩增产物的PCR准备台，制备PCR反应混合物；PCR反应和杂交应在不同的区域进行，例如，杂交应在“后PCR”区域进行。
[0089]使用70%乙醇和纸巾清洁工作台或工作区域。在开始PCR扩增前，用70%乙醇和纸巾清洁所有的移液器。所有移液步骤均使用过滤/无菌枪头，不重复使用枪头。
[0090]PCR只是许多可用于扩增的技术之一。其他对在本【技术领域】的普通技术人员显而易见的扩增技术也可以使用，如多种等温扩增的方法，使用适当的引物扩增靶序列，以获得足够量的靶序列(或DNA分子)，用于导流点阵检测。
[0091]PCR反应使用市场上可买到的聚合酶，例如:AmpliTaq?:'Gold聚合酶(Applied Biosystem)。五对引物(I对用于扩增DR基因，即:正向引物DRB-Fl:5’-ATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’ [序列号 97]和反向引物 DRB-Rl:5’ -GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3’ [序列号98] ;1对用于扩增DQ基因，即:正向引物 DQB-E2-F2:5’CGGTGATTCCCCGCAGAGGAT-3’ [序列号 99]和反向引物 DQB-E2-R2:5’ -CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC-3’ [序列号100] ；3对用于扩增DP基因，正向引物[序列号101-103]和反向引物[序列号[序列号104-106]在各自的5’-末端分别标记有生物素。前面描述的其他合适的标记方法也可以使用。在25微升的反应体系中，PCR预制混合试剂制备如下(这个例子是用来说明本发明的用于PCR扩增反应的一个特定程序。如果使用其他SNP的引物序列，必须优化PCR和杂交的条件):
【权利要求】
1.一种用于人乳头状瘤病毒(HPV)基因型鉴定的试剂盒，其特征在于，包括序列号为 116-118 的引物和序列号为 123-125、127-133、140-145、148-149、151-153、156-158、170-173 的寡核苷酸探针，其中序列号为 123-125、127-133、140-145、148-149、151-153 和156-158 的探针对应基因型为 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66 和 68 的HPV LI核酸序列，序列号为170-173的探针对应HPV LI核酸的共有序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括一个与内部对照互补的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述与内部对照互补的引物的序列号为 119-120。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括信号生成标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可以检测出不同的HPV基因型，所述HPV基因型包含与序列号为170-173的探针所对应的HPV LI核酸共有序列。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可以检测出的HPV基因型为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66 和 68。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述HPV基因型是分别检测，或者集合到一个或多个组中检测。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，HPV基因型为16和18的HPV基因型是分别检测，HPV基因型为31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68的HPV基因型集合到一个或多个组中进行检测。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，HPV基因型为31、33、45、52和58的HPV基因型集合到一个组中进行检测。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，HPV基因型为53、59、66和68的HPV基因型集合到一个组中进行检测。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，HPV基因型为35、39、51和56的HPV基因型集合到一个组中进行检测。
12.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是在一个导流过程或侧向导流过程中使用。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是在一个导流过程中进行，导流过程中含有不断循环的目标分析物溶液，从而增加检测的敏感度。
【文档编号】C12Q1/68GK104017908SQ201410305257
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2011年4月27日 优先权日:2010年4月29日
【发明者】谭约瑟夫荣安, 周约瑟夫国辉, 陈里斯卓宇 申请人:达雅高生物科技有限公司