新的人乳头状瘤病毒(hpv)蛋白构建体及其在预防hpv疾病中的用途的制作方法

专利名称：新的人乳头状瘤病毒(hpv)蛋白构建体及其在预防hpv疾病中的用途的制作方法
新的人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白构建体及其在预防HPV疾
病中的用途背景本说明书涉及人疫苗领域。更具体而言，本说明书涉及用于预防或治疗人乳头状瘤病毒(HPV)感染或疾病的药物组合物和免疫原性组合物。乳头状瘤病毒是高物种特异性的小的DNA肿瘤病毒。人乳头状瘤病毒是感染基底上皮(皮肤或粘膜)细胞的DNA病毒。已经描述了 100多种独特的人乳头状瘤病毒(HPV) 基因型。HPV —般对皮肤(例如HPV-I和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)的扁平上皮有特异性，并且通常引起持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。致癌性人乳头状瘤病毒(HPV)型的持续感染是全球女性癌症死亡第二最常见原因子宫颈癌的必然原因。国际间已有共识，即“高危”基因型，包括基因型16、18、31、33、35、 39、45、51、52、56、58、59和66，可导致子宫颈癌，并且与其它粘膜肛门生殖器癌和头颈癌有关。全世界，HPV-16和HPV-18是主要的致癌型，累计占全部侵袭性子宫颈癌病例的70-80% 以上。被称为“低危”的其它基因型感染，可引起良性或轻度子宫颈组织改变和生长在女性子宫颈、阴道、外阴和肛门以及男性阴茎、阴囊或肛门上的生殖器疣(尖锐湿疣)。它们还会引起需要外科手术的儿童和成人声带上的上皮生长(青少年呼吸道乳头状瘤病或复发性呼吸道乳头状瘤病)。两种预防性HPV疫苗目前已在许多国家得到许可。两者均使用由独特HPV型的重组Ll衣壳蛋白组成的病毒样颗粒(VLP)以预防HPV-16和HPV-18子宫颈癌前病变和癌症。Cervarix (GlaxoSmithKline Biologicals)含有使用杆状病毒表达载体系统在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞底物中产生并用免疫刺激剂3_0_脱酰基-4’ -单磷酰脂质A(MPL)和氢氧化铝盐配制的HPV-16和HPV-18VLP。Gardasi 1 (Merck)含有在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中产生并用非晶形羟基磷酸硫酸铝盐(amorphous aluminium hydroxyphosphate sulphate salt)配制的 HPV-16 禾口 HPV—18VLP。另夕卜， Gardasi 1 含有涉及75-90%生殖器疣的得自非致癌型HPV-6和HPV-Il的VLP。在随机临床试验中已证实，两种疫苗对致癌型HPV-16和HPV-18感染以及相关癌前病变有特定保护作用。造成引发子宫颈癌的致癌性HPV型的清单至少包括存在于子宫颈癌中的HPV 16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 和 73 型(Mahdavi 等，2005 ；Quint 等，2006)。现有疫苗能够提供针对由这些HPV型中的一些所致感染和/或疾病提供不同程度的特定保护。然而具有含有其它HPV型的抗原以进一步提高针对所有引起子宫颈癌的HPV 型的覆盖范围，或者可诱导针对相关和无关HPV型的广泛交叉保护的疫苗，可能具有潜在益处。具有进一步有效针对引起皮肤癌的HPV型(例如HPV 5或HPV 8或HPV 38或者这些中的两种或更多种的任何组合)的疫苗，可能具有潜在益处。除了目前已获批准的LlVLP疫苗外，在例如以下文献中提出将L2的肽用于HPV疫苗W0 2003/097673 ；WO 2004/052395 ；W02006/083984 ；WO 2009/001867 ；Kondo 等，2008JMed Virol 80，841-846 ;Kondo 等，2006Virology 358，266-272 ;Schellenbacher 等，2009 25th International Papillomavirus Conference (2009 年第二十五届乳头状瘤病毒国际会议)，5 月 8-14 日，Malmo, Sweden ；Coursaget 等，25th International Papillomavirus Conf erence(第二十五届乳头状瘤病毒国际会议)，5月8-14日，Malmo，Sweden ；Slupetzky 等，2007Vaccine 25，2001-2010 ;Xu 等，2006 Arch Virol 151，2133-2148 ;Gambhira 等， 2007 J Virol 81，13927-13931 ;Alphs等，2008 PNAS105，5850-5 ；Kawana等，2003 Vaccine 21,4256-60 ；Kawana 等，2001Vaccine 19,1496-1502。简述本说明书涉及含有抗原的针对人乳头状瘤病毒的改进疫苗，所述疫苗提供针对引发其它癌症的HPV型和/或与生殖器疣有关的低危HPV型的保护。改进的疫苗含有嵌合Ll 多肽，其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽。在本发明的一个实施方案中，提供人乳头状瘤病毒(HPV)LllS型多肽或其片段， 其包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。在一个实施方案中，所述多肽包含L2多肽的至少两个肽。在一个备选实施方案中，本发明提供人乳头状瘤病毒(HPV)Llie型多肽或其片段，其含有包含插入HPV Ll多肽内的HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。本发明的嵌合多肽可以壳粒或病毒样颗粒(VLP)提供。这类多肽、壳粒和VLP可配制成免疫原性组合物。本文描述了其制备方法，及其例如在配制用于预防HPV感染的药物中的用途。本发明还提供一种组合物，所述组合物包含(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll病毒样颗粒(VLP)；和(ii)至少一种嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP，其在Ll序列中包含L2肽。本发明还提供一种组合物，所述组合物包含两种或更多种嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP的组合，各Ll在Ll序列中包含L2肽。本发明还提供一种组合物，所述组合物包含⑴至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll病毒样颗粒(VLP)；和(ii)至少一种在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP，用于预防或治疗HPV感染相关病症。本发明还提供一种组合物，所述组合物包含两种或更多种在Ll序列中包含L2肽的嵌合人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽、壳粒或VLP的组合，用于预防或治疗HPV感染相关病症。本发明还提供以下用途⑴至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll病毒样颗粒(VLP)；和(ii)至少一种在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP在制备用于预防或治疗HPV感染相关病症的药物中的用途。本发明还提供两种或更多种在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPVLl多肽、壳粒或VLP 的组合在制备用于预防或治疗HPV感染相关病症的药物中的用途。本发明还提供在Ll序列中包含两个或更多个L2肽的嵌合HPVLl多肽、壳粒或 VLP。
在另一个方面，本发明提供用于诱导人的抗HPV抗体的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。在另一个方面，本发明提供用于诱导人的抗HPV中和抗体的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。这类方法还可诱导交叉中和抗体。在另一个方面，本发明提供用于诱导人的针对HPV的细胞免疫的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。在另一个方面，本发明提供用于诱导人的针对HPV的中和抗体和细胞免疫的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。这类方法还可诱导交叉中和抗体。本发明还提供用于预防HPV感染或与HPV感染有关的HPV疾病的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性组合物给予人。本发明还提供用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll病毒样颗粒(VLP)与(ii)至少一种在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP和(iii)药学上可接受的稀释剂或载体和任选(iv)佐剂混合， 以产生本文所述的免疫原性组合物。本发明还提供用于纯化本文所述嵌合多肽的方法，所述方法包括阴离子交换层析和羟磷灰石层析。本发明还提供用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将两种或更多种在 Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、壳粒或VLP混合。本发明还提供制备组合物的方法，所述方法包括将包含插入Ll多肽内的L2多肽的肽表位的HPV Ll多肽和药学上可接受的稀释剂或载体混合。附图简述

图1表示HPV 16和HPV 18的C端截短的Ll序列。图1 (a)禾Π (b)的HPV 16序列和HPV 18序列的氨基酸编号在本说明书全文中分别与HPV 16和HPV 18的Ll相关地使用。图2表示HPV 16和HPV 18L1的暴露环和L2肽插入Ll序列的示例性位置。图3表示在暴露环区和C端侵入臂(invading arm)区中HPV 16、18和其它型的 Ll序列的比对。最上面的序列是图1所示的HPV 16L1序列。图4表示各种不同的HPV型的L2肽。图5表示嵌合L1/L2多肽纯化的流程图。详述导言本说明书涉及用于预防和治疗人乳头状瘤病毒(HPV)感染引发的疾病的组合物和方法。更具体而言，本说明书涉及含有主要衣壳蛋白Ll和命名为L2的次要衣壳蛋白的免疫原性组分的嵌合多肽。本文公开的嵌合多肽包括其中插入至少一个L2肽的Ll多肽。 选择包含L2多肽的至少一个表位的L2肽。在一个实施方案中，Ll多肽是HPV 18型Ll多肽。因此，嵌合L1/L2多肽包括其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽的HPV 18型Ll多肽或其片段。例如，L2肽可来自18型以外的HPV型(即非HPV 18型L2肽)。有利的是，L1/L2多肽能够诱导对包含L2 多肽(从中选出肽)的天然蛋白质的免疫应答。另外，L1/L2多肽可能能够诱导对至少一种其它天然L2蛋白的免疫应答。在一个实施方案中，L2肽选自HPV L2多肽N端的氨基酸1-200，例如选自HPV L2 多肽N端的氨基酸1-150。在具体实施方案中，L2肽选自包含HPV L2多肽的氨基酸残基 17-36的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸残基56-75的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸残基 96-115的肽；以及包含HPV L2多肽的氨基酸残基108-120的肽。在不同的实施方案中，L2 肽包括由SEQ ID NO :1-31表示的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，L2肽由HPV 33 型L2的氨基酸17-36(其与HPVll型L2的氨基酸17-36相同)组成。在另一个示例性实施方案中，L2肽由HPV 58型L2的氨基酸56-75(其与HPV 6型L2的氨基酸56-75相同) 组成。更概括地讲，可选择包含与至少两种不同HPV型的L2多肽相同的至少8个连续氨基酸(也就是说两种或更多种HPV型之间的共有序列)的L2肽。在另一个实施方案中，嵌合L1/L2多肽包括其中插入包含HPV L2多肽的氨基酸 56-75的肽的HPV Ll 16型多肽或其片段。例如，L2肽可包含HPV致癌型(例如HPV 58型) 的HPV L2多肽的氨基酸56-75。在某些实施方案中，与天然L2多肽相比，插入Ll多肽以形成嵌合L1/L2多肽的L2 肽包含至少一个氨基酸插入、缺失或取代。在一个实施方案中，L2肽具有至少一个氨基酸插入、缺失或取代，其去除两个半胱氨酸之间的二硫键或去除能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。有利的是，包含具有氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能够诱导针对至少一种天然L2蛋白(或天然存在的L2多肽)的免疫应答。在一个实施方案中，HPV Ll蛋白具有一个或多个氨基酸的C端缺失。在某些实施方案中，将L2肽插入Ll多肽的暴露区。在不同的实施方案中，暴露环可以是Ll多肽的DE 环(例如介于氨基酸132-142之间)环(例如介于氨基酸172-182之间);HI环(例如介于氨基酸345-359之间)；和/或C端(例如介于氨基酸4 和445之间)。在一个实施方案中，将两个或更多个L2肽插入Ll多肽内。例如，可将两个或更多个L2肽插入相同位点(例如作为一连串的氨基酸或多联体(concatamer))，或者插入不同的位点，例如插入 Ll多肽的DE环和C端。任选在插入相同位点时，两个或更多个L2肽可通过至少一个其它氨基酸连接，例如通过包含多个氨基酸的间隔基连接。在将两个或更多个L2肽插入Ll多肽时，L2肽可相同或不同。通常，L2肽包含天然L2多肽的至少8个连续氨基酸。在某些实施方案中，将L2肽插入Ll多肽而又不缺失Ll多肽的氨基酸。在其它实施方案中，将L2肽插入Ll多肽同时缺失Ll多肽的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，嵌合L1/L2呈嵌合多肽的超分子装配体(supramolecular assembly)，例如呈多肽颗粒，例如非晶形聚集体，或者更有序的结构，例如壳粒或病毒样颗粒(VLP)或小的非VLP结构。本说明书的另一个方面涉及编码上述嵌合L1/L2多肽的核酸分子。这类核酸可存在于原核或真核表达载体中。合适的表达载体包括例如重组杆状病毒。可将重组核酸(例如表达载体)导入(例如感染、转染或转化)宿主细胞。这类宿主细胞也是本说明书的特征。可使用这些宿主细胞产生嵌合L1/L2多肽，例如通过使宿主细胞在适于表达重组多肽的条件下复制。然后可任选对多肽进行分离和/或纯化，例如在配制到免疫原性组合物中 本文公开的任何嵌合L1/L2多肽可用于医学，例如作为用于预防或治疗由HPV引起的感染或疾病的免疫原性组合物(例如疫苗)。这些组合物适用于通过将免疫原性组合物给予人受试者而诱导人的抗HPV抗体的方法。有利的是，将免疫原性组合物给予人受试者诱导预防、改善或治疗HPV感染或疾病的抗体。因此，本说明书还提供用于预防、改善或治疗HPV感染或疾病的免疫原性组合物。 这类免疫原性组合物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的上述嵌合L1/L1 多肽(例如蛋白质)、壳粒或VLP。在一些实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。合适的佐剂包括铝盐(例如氢氧化铝)和/或3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。在一个实施方案中，所述组合物包含(i)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll 多肽或其片段或者由之组成的病毒样颗粒(VLP)；和(ii)至少一种含有其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽的人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽。本文公开的任何嵌合L1/L2多肽(包括上述超分子装配体、多肽颗粒、壳粒和/或VLPQ适用于含有与嵌合L1/L2多肽组合的VLP的组合物。在一个实施方案中，用于与嵌合L1/L2多肽组合的VLP由Ll多肽或其片段组成。 在具体实施方案中，HPV LlVLP是HPV 16 Ll VLP和/或HPV 18 Ll VLP。同样，嵌合多肽还可包含HPV 16 Ll多肽或其片段和/或HPV 18 Ll多肽或其片段。在一个实施方案中，示例性实施方案中的这类组合物包含(ii)的至少一种嵌合多肽，其由L2肽插入其中的HPV 16 Ll多肽或其片段、HPV 18 Ll多肽或其片段或者L2肽插入其中的HPV 16 Ll多肽或其片段和HPV 18 Ll多肽或片段两者组成。上文公开的嵌合肽可包含Ll多肽的C端缺失一个或多个氨基酸的Ll多肽。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物包含HPV 16 Ll VLP和HPV 18 Ll VLP两者以及具有HPV 16 Ll多肽和HPV 18 Ll多肽两者的嵌合多肽。在这类实施方案中，具有HPV 16 Ll多肽的嵌合多肽和具有HPV 18多肽的嵌合多肽可包含不同的L2肽。示例性Ll片段包括没有C端34个氨基酸的HPV 16 Ll或没有C端35个氨基酸的HPV 18 Li。同样，在另一个实施方案中，免疫原性组合物可包含两种或更多种嵌合多肽的组合，所述嵌合多肽包含人乳头状瘤病毒(HPV) Ll多肽或其片段与至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。例如，所述组合可包括具有相同或不同Ll组分的嵌合多肽。 同样，组合中的嵌合多肽可包含相同或不同的L2组分。在一个具体实施方案中，嵌合多肽包含相同HPV型的Ll多肽，而L2肽不同。在示例性制剂中，免疫原性组合物包括10-50 μ g的各VLP和/或嵌合多肽/人剂量。在一个实施方案中，各VLP和/或嵌合多肽存在的量约20 μ g。可通过将至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段和至少一个插入 HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的插入肽的嵌合多肽，与至少一种其它嵌合多肽，或与至少一种人乳头状瘤病毒(HPV) Ll病毒样颗粒(VLP)以及药学上可接受的稀释剂或载体和任选佐剂混合，来制备本文所述免疫原性组合物。术语为了便于回顾本说明书的各种实施方案，提供下列术语解释。其它术语和解释可提供于本说明书的上下文中。除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语具有本说明书所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学的常见术语的定义可参见Benjamin Lewin,Genes V, Oxford University Press 出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew 等 (主编)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以及 Robert A. Meyers(主编)，Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版， 1995(ISBN 1-56081-569-8)。单数术语包括复数的对象，除非上下文另有明确规定。同样，词语“或”意指包括 “和”，除非上下文另有明确规定。术语“多种(个)”是指两种(个)或更多种(个)。还要进一步理解的是，对于核酸或多肽，给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似值，为了描述给出。另外，给出的有关物质(例如抗原)的浓度或水平的数值限制意指近似值。因此，如果指明浓度为至少(例如)200pg，则是指此浓度应理解为至少大约(或“约”或“ ”)200pg。虽然类似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于实施或检验本说明书，但下面描述了合适的方法和材料。术语“包含”是指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和各种变化应理解为表示含有规定的化合物或组合物(例如核酸、 多肽、抗原)或步骤，或一类化合物或一系列步骤，而非排除任何其它的化合物、组合物、步骤或化合物类、组合物类、系列步骤。缩写词“e.g. ”源于拉丁文exempli gratia，本文用来表示非限制性实例。因此，缩写词“e.g. ”是术语“例如”的同义词。缩写“HPV”的术语“人乳头状瘤病毒”是指能够感染人的乳头状瘤病毒属 (Papillomavirus)的成员。有两大类的HPV(生殖器类和皮肤类)，其每一类都含有按遗传相似性分类的多个病毒“型”或“株”(例如HPV16、HPV 18,HPV 33,HPV 58等)。在本说明书的情况下，术语“型，，可用来命名HPV和/或指定HPV型的多肽。在以术语“非”作为开头时，命名的HPV或多肽是所提及的HPV或多肽以外的至少一种其它或另外的HPV型。例如，“HPV 18型Ll多肽”是指HPV 18型的Ll多肽。相比之下，“非HPV 18型Ll多肽”是指HPV 18型以外的任何型的Ll多肽。术语“多肽”是指其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”意指包括任何氨基酸序列并包括修饰序列(例如糖蛋白)。 术语“多肽”具体是指涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。提及多肽时， 术语“片段”是指多肽的部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”是指保留全长参比蛋白质或多肽的至少一个主要免疫原性表位的所有多肽片段。多肽内的方向一般以N端至C端方向列举，由各个氨基酸的氨基和羧基部分的方向确定。多肽从N端或氨基端向C端或羧基端解读。术语“多核苷酸”和“核酸序列”是指核苷酸长度至少为10个碱基的聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或之一的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。所谓“分离的多核苷酸”是指不与从中得到该多核苷酸的生物的天然存在的基因组中两个与之直接邻接的编码序列(一个位于5'端，一个位于3'端)直接邻接的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。通过参照各个核苷酸单位的连接性定义核酸的5'和3'方向，并根据脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置命名。以5' -3'方向读取多核苷酸序列的信息(编码)内容。对于核酸、多肽或其它细胞组分，术语“异源”表示该组分存在于非在自然界中正常存在之处和/或它来源于不同的来源或物种。术语“天然”和“天然存在的”是指在与其天然状态相同的状态下存在的成分，例如蛋白质、多肽或核酸。也就是未经人工修饰的成分。应当理解的是，在本说明书的情况下，有许多天然/天然存在的HPV型(和HPV蛋白和多肽)，例如得自不同的天然存在的HPV型。在提及核酸或多肽(例如HPV Ll或L2核酸或多肽)时，“变体”是不同于参比核酸或多肽的核酸或多肽。通常，变体和参比核酸或参比多肽之间的差异构成与参比物相比按比例为少量的差异。变体核酸可因一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，或者因人工核苷酸类似物的取代而不同于与其进行比较的参比核酸。同样，变体多肽可因一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，或者因氨基酸类似物的取代而不同于与其进行比较的参比多肽。“抗原”是可以刺激动物产生抗体和/或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射、吸收或以其它方式引入动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。 术语“表位”或“抗原决定簇”是指B细胞和/或T细胞对之产生应答的抗原上的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是对其产生功能上重要的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的表位。因此，对于针对病原体的保护性免疫应答，优势抗原表位是当被宿主免疫系统识别时产生免遭由该病原体引起的疾病的保护的抗原部分。术语“T细胞表位”是指当与合适的MHC分子结合时被T细胞(通过T细胞受体)特异性结合的表位。“B细胞表位” 是被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。“免疫应答”是免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答。 免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体(例如抗原特异性中和抗体)的产生。免疫应答也可以是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在某些情况下，应答对特定抗原有特异性(即“抗原特异性应答”)。如果抗原来源于病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、降低病原体的感染或减少因病原体感染产生的症状(包括死亡)的免疫应答。可通过例如在噬斑减少测定或 ELISA中和测定中抑制病毒复制或噬斑形成，或者体内测定抗病原体攻击的抗性，来测定保护性免疫应答。“佐剂”是以非特异性方式增强免疫应答产生的物质。常见佐剂包括抗原吸附在其上的无机物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬浮液；乳液，包括油包水和水包油乳液(及其变化，包括复合乳液和可逆乳液)、脂糖(liposaccharide)、脂多糖、免疫刺激性核酸(例如 CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂) 和这类组分的各种组合。“免疫原性组合物”是适于给予人或动物受试者(例如在实验情况下)的能够诱导例如针对病原体(例如人乳头状瘤病毒)的特异性免疫应答的物质的组合物。因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如病毒的抗原亚基，例如其多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可包含一种或多种能够诱导或提高免疫应答的其它组分，例如赋形剂、载体和/ 或佐剂。在某些情况下，给予免疫原性组合物诱导防止受试者免遭由病原体引起的症状或病况的免疫应答。在某些情况下，在受试者暴露于病原体后，通过抑制病原体(例如人乳头状瘤病毒)的复制来预防(或治疗，例如减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。例如， 在本说明书的情况下，旨在给予受试者或受试者群以诱导针对人乳头状瘤病毒的保护性或治标性免疫应答的某些实施方案的免疫原性组合物是疫苗组合物或疫苗。
嵌合L1/L2多肽本发明涉及多肽，所述多肽可配制成疫苗组合物，并且满足对提供针对HPV感染和/或疾病的保护且不同于现有市售疫苗的安全有效的疫苗组合物的需要。具体而言，本发明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含其中插入至少一个肽的HPV Ll多肽，所述至少一个肽包含HPV L2多肽的抗原表位。本文公开的HPV Ll和L2多肽可来自HPV的任何基因型，特别包括高危的引起癌症的 HPV 型 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 或 73 和引起生殖器疣的 HPV型(例如HPV 6或11)及引起皮肤疣的型，例如HPV5型和HPV8型，甚至与普通疣有关的2型和3型，以及与良性皮肤疣有关的HPV76。例如，在一个实施方案中，本发明提供人乳头状瘤病毒(HPV)LllS型多肽或其片段，其包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。L2多肽的表位是这样的肽，即在适当提供时，其能够诱导可识别人乳头状瘤病毒(例如天然存在的人乳头状瘤病毒)的天然(例如全长)L2多肽的免疫应答。在另一个实施方案中，提供人乳头状瘤病毒(HPV)Ll 16型多肽或其片段，其包含至少一个包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。Ll多肽可以是全长Ll多肽。在某些实施方案中，Ll多肽是Ll的片段，例如通过缺失N端或C端的一个或多个氨基酸而截短的片段。因此，在某些实施方案中，Ll多肽是与天然蛋白质(即自然界存在的蛋白质)相比，从其一端或两端除去一个或多个氨基酸的截短物。在一个具体的实施方案中，Ll多肽具有C端缺失。图Ia中给出示例性的Ll HPV 16序列。图Ib中给出示例性的Ll HPV 18序列。截短的Ll蛋白也许能够自组装成例如壳粒或VLP。在电子显微镜下，病毒样颗粒通常类似于HPV病毒。病毒样颗粒通常由72个壳粒组成，而壳粒由呈五聚体单位的5个Ll 多肽组成。本文使用的至少一种Ll蛋白适宜包含截短的Ll蛋白，如果多种HPV VLP、嵌合多肽或壳粒存在，则组合物中适宜全部Ll蛋白是截短的Ll蛋白。截短适宜除去核定位信号。截短适宜为C端截短。C端截短适宜除去少于50个氨基酸，例如少于40个氨基酸。在一个具体的实施方案中，C端截短除去HPV 16的34个氨基酸和HPV 18的35个氨基酸。本文使用的截短Ll蛋白适宜为功能性Ll蛋白衍生物或变体。功能性Ll蛋白衍生物或变体能够引起免疫应答(任选在适当加入佐剂时)，所述免疫应答能够识别包含全长Ll蛋白和/或从中得到Ll蛋白的HPV型的病毒(或由全长Ll蛋白和/或从中得到Ll 蛋白的HPV型组成的VLP)。本文公开的嵌合HPV Ll多肽中的L2肽的位置很重要。在本文公开的任何实施方案中，L2肽可位于Ll蛋白的暴露环之一或C端侵入臂上。当Ll呈壳粒或病毒样颗粒形式时，存在环和侵入臂(Chen等2000 Mol Cell 5， 557-567)。在本文公开的任何实施方案中，L2肽可位于选自其中位置与图1所示HPV 16和 HPV 18 Ll参比序列有关的下列Ll序列区域的位置上，或者位于另一HPV Ll序列的等同位
置上⑴氨基酸5O-6I中的BC环(ii)氨基酸132-142(例如氨基酸132-141，特别是氨基酸137-13 中的DE环
(iii)氨基酸 172-182(例如 176-182，特别是 176-179)中的 EF 环(iv)氨基酸 271490(例如 272-275，特别是 272-273)中的 TO 环(ν)氨基酸 345-359(例如 347-350，特别是 349-350)中的 HI 环(vi)氨基酸 429-445 (例如 HPV 16 的 423-440，特别是 423_424、431_433 或 437-438 和 HPV 18 的 424-425、432-433 或 439-440)中的 C 端臂。在本文公开的任何实施方案中，可将HPV L2肽插入Ll序列而又不除去Ll氨基酸。 或者可将L2肽插入Ll序列同时在插入位置除去Ll序列的一个或多个氨基酸，例如可以在插入 L2 肽的位置除去 Ll 序列的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或 20个氨基酸。因此，L2肽可取代Ll序列的一个或多个氨基酸，例如L2肽可将相等长度的 Ll序列置换成L2肽序列。如果嵌合L1/L2多肽中存在两个或更多个L2肽，则它们可以是相同HPV型的不同 L2肽，或者它们可以是不同HPV型的肽，在这种情况下，它们可来自不同HPV型的相应区域。在一个实施方案中，将L2肽插入允许装配嵌合多肽的超分子装配体的位点，例如在多肽颗粒中，例如壳粒或病毒样颗粒(VLP)或小的非VLP样结构。例如，为了保持VLP 结构，将L2肽在这样的位点插入Ll多肽中，即不干扰参与形成参与维持壳粒间相互作用并由此维持VLP构象的二硫桥的位点。可通过电子显微镜术评价这类超分子结构，例如参见 Sadeyen 等，2003， Virology 309，32-40 ;Slupetzky 等，2007 Vaccine 25，2001-2010； Varsani 等，2003，J of Virology 77,8386-8393 ;Chen等，2000，Deschuyteneer M等，2010， Human Vaccines6 :5，407-419。通常，与天然VLP (即其中Ll蛋白是全长或截短的，但不含 L2肽的VLP)相比，嵌合VLP具有相似或相同的大小。嵌合VLP的直径可为50nm的范围。 在备选实施方案中，形成直径20-35nm的小的非VLP结构。插入L2肽的位点可允许待维持的构象依赖性中和表位的存在。可通过使用以下单克隆抗体来检测中和表位如HPV 16的V5、H16、E70和U4 (Christensen等，2001 ；Carter 等，2003，2006 ；Day等，2007)和HPV 16的J4 (Combita等，2002)。其它中和表位是本领域已知的，并且同样可使用单克隆抗体来鉴定其存在与否。然而，维持Ll多肽上的所有Ll中和表位可能不是必需的，例如，尤其在本文所述的还含有非嵌合Ll VLP的组合物中。用于插入L2肽的合适位点将L2肽暴露在Ll多肽的表面，特别是当作为VLP提供时，例如表1所示位点。表1和表2表示可提供合适的L2肽插入位点的HPV Ll暴露区(Carter等，2003 ； Bishop等，2007 ;Chen等，2000)和这些区内的超变区。适宜将L2肽插入C端侵入臂中，或者插入DE环或TO环或HI环中。适宜将L2肽插入环或C端臂的超变区中。表1所示各区为HPV 16的各区；可在其它HPV型的Ll中鉴定类似区，表2中给出了 HPV 18 L2的类似区。表IHPV 16 的 HPV Ll 暴露环
权利要求
1.一种人乳头状瘤病毒(HPV) 18型Ll多肽或其片段，其包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述L2多肽的肽是非HPV18型肽。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽能够诱导对包含L2多肽的天然蛋白质的免疫应答。
4.权利要求3的多肽，其中所述多肽能够诱导对至少一种其它天然L2蛋白的免疫应答。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述HPVLl蛋白包含一个或多个氨基酸的C端缺失。
6.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll多肽的暴露区内。
7.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll蛋白的DE环内。
8.权利要求7的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸132-142之间。
9.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll蛋白的TO环。
10.权利要求9的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸172-182之间。
11.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll蛋白的HI环中。
12.权利要求11的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸345-359之间。
13.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll多肽的C端内。
14.权利要求13的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸4 和445之间。
15.前述权利要求中任一项的多肽，其包含两个或更多个插入Ll多肽内的L2肽。
16.权利要求15的多肽，其中将两个或更多个L2肽插入不同位点。
17.权利要求16的多肽，其中将第一L2肽插入DE环，将第二 L2肽插入Ll多肽的C端。
18.权利要求15-17中任一项的多肽，其中所述两个或更多个L2肽不同。
19.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含天然L2多肽的至少8个连续氨基酸。
20.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自HPVL2多肽N端的氨基酸 1-200。
21.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自HPVL2多肽N端的氨基酸 1-150。
22.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自 包含HPV L2多肽的氨基酸残基17-36的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸残基56-75的肽； 包含HPV L2多肽的氨基酸残基96-115的肽；和包含HPV L2多肽的氨基酸残基108-120的肽。
23.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽由HPV33型L2的氨基酸17-36 组成。
24.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽由HPV58型L2的氨基酸56-75 组成。
25.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含由SEQID N0:l_31表示的氨基酸序列。
26.前述权利要求中任一项的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代。
27.权利要求沈的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的插入。
28.权利要求沈的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的缺失。
29.权利要求沈的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的取代。
30.权利要求沈-29中任一项的多肽，其中至少一个氨基酸插入、缺失或取代除去两个半胱氨酸之间的二硫键或除去能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。
31.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含两个或更多个L2肽。
32.权利要求31的多肽，其中两个或更多个L2肽是邻接的。
33.权利要求31的多肽，其中两个或更多个L2肽通过至少一个其它氨基酸连接。
34.权利要求33的多肽，其中两个或更多个L2肽通过包含多个氨基酸的间隔基连接。
35.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述L2肽包含至少8个连续氨基酸，所述至少 8个连续氨基酸包含与至少两种HPV型的L2多肽相同的序列。
36.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入Ll多肽内而又不缺失 L2多肽的氨基酸。
37.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少L2肽插入Ll多肽内同时又缺失L2多肽的一个或多个氨基酸。
38.一种多肽，其包含序列ID No. 32-45中任一个表示的氨基酸序列。
39.一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll 16型多肽或其片段，其含有插入HPV Ll多肽内的包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。
40.权利要求39的多肽，其中所述包含HPVL2多肽的氨基酸56-75的肽选自致癌HPV型。
41.权利要求39或40的多肽，其中将包含HPV58型L2多肽的氨基酸56-75的肽插入 HPV Ll多肽内。
42.前述权利要求中任一项的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含至少一个氨基酸插入、缺失或取代。
43.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的插入。
44.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的缺失。
45.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的取代。
46.权利要求42-45中任一项的多肽，其中至少一个氨基酸插入、缺失或取代除去两个半胱氨酸之间的二硫键或除去能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。
47.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含两个或更多个L2肽。
48.权利要求47的多肽，其中两个或更多个L2肽是邻接的。
49.权利要求47的多肽，其中两个或更多个L2肽通过至少一个其它氨基酸连接。
50.权利要求49的多肽，其中两个或更多个L2肽通过包含多个氨基酸的间隔基连接。
51.权利要求42-50中任一项的多肽，其中包含至少一个含有至少一个氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能够诱导对包含L2多肽的天然蛋白质的免疫应答。
52.前述权利要求中任一项的多肽，其中L2肽包含至少8个连续氨基酸，所述至少8个连续氨基酸是与至少两种HPV型的L2多肽相同的序列。
53.一种壳粒，其包含权利要求1-52中任一项的多肽。
54.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含权利要求1-52中任一项的多肽。
55.一种免疫原性组合物，其包含权利要求I-M中任一项的蛋白质、壳粒或VLP和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
56.权利要求55的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
57.权利要求56的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。
58.权利要求57的免疫原性组合物，其中所述铝盐是氢氧化铝。
59.权利要求57或58的免疫原性组合物，其还包含3D-MPL。
60.一种核酸分子，其编码权利要求0-52中任一项的多肽。
61.一种表达载体，其包含权利要求59的核酸。
62.权利要求61的表达载体，其中所述表达载体是重组杆状病毒。
63.一种用权利要求59的核酸或权利要求61的载体转化的宿主细胞。
64.用于药物的权利要求1-52中任一项的多肽。
65.一种用于产生权利要求1-52中任一项的多肽的方法，所述方法包括将权利要求61 或62的表达载体导入细胞，并在产生多肽的条件下使细胞复制。
66.一种组合物，其包含(i)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的病毒样颗粒(VLP)；和( )至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽，所述嵌合多肽包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。
67.权利要求66的组合物，其中(i)的VLP由Ll多肽或其片段组成。
68.权利要求66或67的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽是权利要求1-52中任一项的多肽、权利要求53的壳粒或权利要求M的VLP。
69.权利要求66-68中任一项的组合物，其中(i)中的HPVVLP包含HPV 16 Ll VLP和 / 或 HPV 18 Ll VLP。
70.权利要求66-69中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽包含HPV16 Ll 多肽或其片段和/或HPV 18 Ll多肽或其片段。
71.权利要求66-70中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽由HPV16 Ll 多肽或其片段、HPV 18 Ll多肽或其片段或者HPV16 Ll多肽或其片段和HPV 18 Ll多肽或其片段两者组成。
72.权利要求66-71中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽包含Ll多肽的一个或多个氨基酸的C端缺失。
73.权利要求66-72中任一项的组合物，其中(i)中的VLP包含HPV16 Ll VLP和HPV-18 Ll VLP两者，且其中(ii)的嵌合多肽包含至少一种包含HPV 16 Ll多肽的嵌合多肽和至少一种包含HPV 18 Ll多肽的嵌合多肽。
74.权利要求73的组合物，其中包含HPV16 Ll多肽的嵌合多肽和包含HPV 18多肽的嵌合多肽包含不同的L2肽。
75.—种包含两种或更多种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽的组合的组合物，所述嵌合多肽包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽。
76.权利要求75的组合物，其中所述嵌合多肽是权利要求1-52中任一项的嵌合多肽。
77.权利要求75-76的组合物，其中所述嵌合多肽包含相同HPV型的Ll多肽，而L2肽不同。
78.权利要求66-77中任一项的组合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量为 10-50 μ g/人剂量。
79.权利要求78的组合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量为约20μ g。
80.权利要求66-79中任一项的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
81.权利要求80的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
82.权利要求81的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。
83.权利要求82的免疫原性组合物，其中所述铝盐是氢氧化铝。
84.权利要求82或83的免疫原性组合物，其还包含3D-MPL。
85.一种用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将以下成分混合以产生权利要求80-84中任一项的免疫原性组合物(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)Ll病毒样颗粒(VLP)，与 ( )至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽，其包含至少一个插入HPV Ll多肽内的包含L2多肽的表位的肽，和(iii)药学上可接受的稀释剂或载体，和任选(iv)佐剂。
86.一种诱导人的抗HPV抗体的方法，所述方法包括将权利要求55-59或66-84中任一项的免疫原性组合物给予人。
87.权利要求86的方法，其中针对HPV诱导抗体预防、改善或治疗HPV感染或疾病。
88.权利要求55-59或66-84中任一项的组合物，其用于预防、改善或治疗HPV感染或疾病。
全文摘要
本说明书提供新的人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白构建体及其在预防HPV疾病中的用途。所述构建体是包含L1蛋白的嵌合蛋白，其中HPVL2肽插入L1蛋白中。可将这类嵌合蛋白质配制成免疫原性例如疫苗组合物，任选与基于HPV L1 VLP的疫苗一起配制。
文档编号C07K14/025GK102497880SQ201080038624
公开日2012年6月13日 申请日期2010年6月24日 优先权日2009年6月25日
发明者B·D·A·科劳, G·J·M·F·P·鲍多瓦, N·P·F·勒克雷尼耶, N·登杜加, S·吉安尼尼 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司