专利名称：植物人工染色体及其制造方法
技术领域：
本发明的领域涉及遗传转化。具体地，本发明涉及并且体现了一种用于在植物和大分子合成中转化的人工染色体(AC)的合成和用途。
曲旦冃足将在此所有的公开物通过引用结合到相同的程度，如同每个单独的公开物或专利申请明确地并且单独地是指通过引用来结合。以下描述包括在本发明的理解中可能有用的信息。这并不承认在此提供的任何信息是现有技术或与目前要求的发明相关，并且不承认所明确或隐含地引用的任何公开物是现有技术。对于植物人工染色体的简要介绍植物人工染色体被广泛认为是用于作物改进的转化载体的未来发展方向。原则上，它们可以避免与通过TDNA转化植物来制备转基因作物相关的多种主要问题。也就是说，在一个人工染色体上，新基因没有在它们可以引起新的突变处插入到基因组中，新基因具有一致的遗传背景从而它们的表达是更加均一的，并且与一次加入一个基因不同，一次可以加入多个基因。一个人工染色体通常具有三个部分-一个着丝粒，一个基因盒、以及染色体终端， 这样使得整个的人工染色体通常贯穿有丝分裂和减数分裂。任何人工染色体的一个具有挑战性的特征是着丝粒。着丝粒是非常大的并且不具有可以用于保证激活的一致的序列特征。两种现存的人工染色体方法遵循“自上而下”或“自底向上”策略用于采用着丝粒。在自上而下方法中，将一个染色体通过染色体终端截短来切削，并且向新的更小的染色体中加入位点特异性重组位点。在“自底向上” 策略中，将已知的着丝粒序列克隆到一个载体中，该载体最终被处理，更像一个质粒。这两种方法的局限性在于它们依赖于天然着丝粒，天然着丝粒在若干水平上是固有地不稳定的。这种自上而下法产生了不良地传送的染色体(Yu等人，Natl Acad Sci U S A 104(21) :8924-9(2007))并且这种自底向上策略似乎是不可预知的并且视为是质疑的 (Ananiev 等人，Chromosoma 118(2) :157-77(2009) ；Carlson et al. PLoS Genet 3(10)1965-7M2007))。或许自上而下和自底向上这两种策略的最有问题的特征是不能确定无疑地知道载体的序列。 概述一些实施方案包括一种工程化的着丝粒，该着丝粒具有一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列可以包括对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序，其中这一个或多个结合基序允许一个或多个融合蛋白的结合，这些融合蛋白包含该DNA结合蛋白以及一个动粒蛋白以激活该工程化的着丝粒。该融合蛋白可以进一步包括一个核定位信号， 例如对于PKKRKV的一个核定位信号。该融合蛋白可以进一步包括一个表位识别序列。该表位识别序列可以包括但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。在一些实施方案中，该DNA序列可以具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。一些实施方案包括具有以下DNA结合基序的一个DNA序列TetR(SEQ ID NO. 1)、CENP-B 盒(SEQ ID NO. 2)、LacO (SEQ ID NO. 3)、LexA(SEQID NO. 4)、或 GaW (SEQ ID N0.5)。一些实施方案包括具有以下DNA结合基序的组合的一个DNA序列TetR (SEQ ID NO. 1)、CENP-B 盒(SEQ ID NO. 2)、LacO (SEQ ID NO. 3)、LexA (SEQ ID NO. 4)、或 Gal4(SEQ ID N0.5)。在这一个或多个结合基序之间，该DNA序列可以具有填充核酸残基。该填充核酸残基可以是但不局限于长度大约5-50bp，或50bp或更长。一些实施方案包括具有该DNA 序列的串联重复序列的一个DNA分子，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。一些实施方案包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有SEQ ID N0. 6 中所列出的一个DNA序列的串联重复序列。在一些实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少500个串联重复序列。在其他实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少1000个串联重复序列。在一些实施方案中，该DNA结合蛋白可以包括LacI、LexA、Gal4、TetR, CENP-B、或其片段。在其他实施方案中，DNA结合蛋白可以是LaCI、LexA、Ga14、TetR、CENP-B、及其片段的组合。在一些实施方案中，可以将一个或多个动粒蛋白融合到一个或多个DNA结合蛋白上。在某些实施方案中， 这一个或多个DNA结合蛋白可以是由SEQ ID. N0. 7编码的一种多肽、由SEQ ID N0. 8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID N0. 9编码的一种多肽的氨基酸1_74、由SEQ ID NO. 10 编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO. 11编码的一种多肽的氨基酸1-205、及其组合。在一些实施方案中，这一个或多个动粒蛋白可以是CENH3、CENP-C, MIS12、CENP-H、 CENP-0/MCM21、NDC80、SPC24、CENP-A/CENH3、CENP-S, CENP-T, NNF1、NUF2、SPC25、或其片段或组合。一些实施方案包括一种激活一种人工着色粒的方法，该方法通过提供一种人工着丝粒并且使该人工着丝粒与一个或多个融合蛋白进行接触。该融合蛋白或这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白，由此这一个或多个融合蛋白的 DNA结合蛋白部分可以结合到这种工程化的着丝粒上并且形成了一个动粒。一些实施方案包括一种植物人工染色体(AC)，它包括这种工程化的着丝粒。一些实施方案包括一种转基因植物，这种转基因植物具有一种包括这种工程化的着丝粒的人工染色体(AC)。在一些实施方案中，这种转基因植物AC可以表达一个或多个融合蛋白，这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。在一些实施方案中，这种转基因植物AC可以包括能够表达一个或多个融合蛋白的一个核酸分子， 这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。一些实施方案包括一种携带这种包括工程化的着丝粒的人工染色体(AC)的种子。一些实施方案包括一种系统，该系统包括一种工程化的着色粒，这种工程化的着丝粒包括一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序以及在这一个或多个结合基序之间的一个或多个填充核酸残基、以及表达一个或多个融合蛋白的一个或多个核酸，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。这一个或多个结合基序可以允许这一个或多个融合蛋白的结合以激活这种工程化的着色粒以形成一个动粒。该融合蛋白可以进一步包括一个核定位信号， 例如对于PKKRKV的一个核定位信号。该融合蛋白可以进一步包括一个表位识别序列。该表位识别序列可以包括但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。一些实施方案包括一种系统，该系统包括一个DNA序列，该DNA序列可以具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。这些DNA结合基序可以是但不局限于 TetR (SEQ ID NO. 1)、CENP-B 盒(SEQ ID NO. 2)、LacO (SEQ IDN0. 3)、LexA (SEQ ID NO. 4)、 或GaW(SEQ ID NO. 5)。这些DNA结合基序可以是以下的DNA结合基序的组合TetR(SEQ ID NO. 1)、CENP-B 盒(SEQ IDN0. 2)、Lac0 (SEQ ID NO. 3)、LexA (SEQ ID NO. 4)、或 Gal4 (SEQ ID NO. 5)。在这一个或多个结合基序之间，该DNA序列可以具有填充核酸残基。该填充核酸残基可以是但不局限于长度大约5-50bp，或50bp或更长。一些实施方案包括具有该DNA序列的串联重复序列的一个DNA分子，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。在一些实施方案中，该系统包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有 SEQ ID N0. 6中列出的一个DNA序列的串联重复序列。在一些实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少500个串联重复序列。在其他实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少1000个串联重复序列。在一些实施方案中，该DNA结合蛋白可以包括LacI、LexA、Gal4、TetR, CENP-B、或其片段。在其他实施方案中，这些DNA结合蛋白可以是LacI、LexA、Gal4、TetR, CENP-B、及其片段的组合。在一些实施方案中，可以将一个或多个动粒蛋白融合到一个或多个DNA结合蛋白上。在某些实施方案中，这一个或多个DNA结合蛋白可以是由SEQ ID. N0. 7编码的一种多肽、由SEQ ID N0. 8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID N0. 9编码的一种多肽的氨基酸1_74、由 SEQ ID NO. 10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO. 11编码的一种多肽的氨基酸 1-205、及其组合。在一些实施方案中，这一个或多个动粒蛋白可以是CENH3、CENP-C、MIS12、 CENP-H、CENP-0/MCM21、NDC80、SPC24、CENP-A/CENH3、CENP-S, CENP-T, NNF1、NUF2、SPC25、 或其片段或组合。一些实施方案包括一种使用这种植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法。在一些实施方案中，可以合成一种人工染色体；引入一个或多个补充构建体； 并且通过共表达一个或多个融合蛋白来激活经转化的人工染色体，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。在一些实施方案中，这种人工染色体可以通过全基因合成来合成。附图简要说明在引用的附图中阐述了示例性实施方案。在此披露的实施方案和附图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。根据在此的一个实施方案，
图1描述了排列的结合位点(Arrayed Binding Sites, ABS)阵列的产生，它们成功转化到玉米中，并且证实了它们募集了与一个荧光标记融合的 DNA结合蛋白LacI。
A)ABS阵列的结构。显示了三个连续的单体。每个单体含有对于LacI、LexA和的结合位点。
B)使用重叠引物产生ABS阵列。
OABS PCR产物不进入一个琼脂糖凝胶中并且用Ndel消化。
D)通过DNA印记测定两个ABS玉米品系。HindIII在阵列中没有切割，而Ndel切割了。 ABS-ch3具有最长的阵列；ABS-ch7具有最小的。这些阵列是串联的并且是连续的。
E)在粗线期ABS-ch7的FISH分析。检测到一个单一的亮的插入点(箭头1)。在它附近的绿斑点(箭头幻展示了染色体7上的着丝粒。
F)在有丝分裂中期的ABS-ch3的FISH分析。在染色体3L上存在一个单一的插入中臂 (mid-arm)。来自红的ABS基因座(加框的区域)的信号比从主着丝粒重复序列CentC检测到的绿色信号更亮。
G)证明ABS募集了LacI。一个LacI-YFP蛋白当在ABS_ch3基因座(箭头)处系住时更亮地发荧光。
详细说明如同全部描述的，将在此所引用的所有公开物通过引用以其整体结合在此。除非另外指明，在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属于的领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3red. , J. Wiley and Sons(纽约，NY 2001) ；March,Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed. ， J. Wiley and Sons ( NY 2001) -M ^SambrookfPRussel^Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港，NY 2001)，向本领域普通技术人员提供了本申请中使用的多个术语的总体指导。在本披露的帮助下，本领域的普通技术人员将理解与在此披露的那些类似或等同的方法和材料，这些方法和材料可以用在本发明的实践中。的确，本发明决不仅限于本申请在此具体所述的那些方法、材料、应用、和目的。iMi^M (kinetochore tethering)本披露涉及一种设计人工染色体载体的方式。不是依赖于现有的着丝粒，而是采用一种完全合成的系统，该系统避免了着丝粒的不稳定性，通过实施一个遗传决定方法。这是一个双组分系统，含有工程化的着丝粒以及被设计用来激活这些着丝粒的蛋白。这些工程化的着丝粒含有长阵列的具有已知DNA结合基序的重复序列。这些DNA结合基序的例子列于表1中。这些激活蛋白是已经或可以融合到这些DNA结合蛋白上的关键的动粒蛋白，这些DNA结合蛋白结合到合成的着丝粒上。栓系的蛋白，单独的亦或组合的，募集了其余的动粒并且支持了染色体分离。这个或这些DNA结合蛋白(在此也称为结合模块)可以是但不局限于表2中列出的蛋白。这些动粒蛋白可以是但不局限于表3A和表;3B中列出的那些。 原则上，结合到一个已知基序(来自任何物种)上的任何DNA结合模块能以这种方式使用。表1. DNA结合基序.
权利要求
1.一种包括一个DNA序列的串联重复序列的工程化的着色粒，包括对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序，其中这一个或多个结合基序允许一个或多个融合蛋白的结合，这些融合蛋白包括该DNA结合蛋白和一个动粒蛋白以激活这种工程化的着色粒。
2.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该融合蛋白进一步包括一个核定位信号。
3.如权利要求2所述的工程化的着色粒，其中该核定位信号是对PKKRKV的核定位信号。
4.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该融合蛋白进一步包括一个表位识别序列。
5.如权利要求4所述的工程化的着色粒，其中该表位识别序列包括HA附加表位 YPYDVPDYA的多聚体。
6.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中这一个或多个DNA结合基序是选自下组，该组的构成为TetR(SEQ ID NO. 1)、CENP-B 盒(SEQ ID NO. 2)、LacO (SEQ ID NO. 3), LexA (SEQ ID NO. 4)、Gal4 (SEQ ID NO. 5)，及其组合。
7.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该DNA序列是SEQID NO. 6。
8.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，包括至少500个串联重复序列。
9.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，包括至少1000个串联重复序列。
10.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为LacI、LexA、Gal4、TetR, CENP-B、及其片段和组合。
11.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为由SEQ ID. NO. 7编码的一种多肽、由SEQ ID N0. 8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID N0. 9编码的一种多肽的氨基酸1_74、由SEQ ID NO. 10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO. 11编码的一种多肽的氨基酸1_205、及其组合。
12.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个动粒蛋白是选自下组，该组的构成为CENP-A/CENH3、CENP-C, MIS 12、CENP-0/MCM21、NDC80、CENP-S、CENP-T、NNFl、 NUF2、SPC25、及其片段和组合。
13.一种激活一种人工着色粒的方法，包括提供如权利要求1所述的工程化的着丝粒；并且将这种工程化的着丝粒与一个或多个融合蛋白进行接触，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白，由此这一个或多个融合蛋白的DNA结合蛋白部分结合到工程化的着丝粒上并且形成了一个动粒。
14.一种植物人工染色体(AC)，包括如权利要求1所述的工程化的着丝粒。
15.一种转基因植物，包括如权利要求14所述的人工染色体(AC)。
16.如权利要求15所述的转基因植物，其中该AC表达一个或多个融合蛋白，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。
17.如权利要求15所述的转基因植物，进一步包括一个核酸分子，该核酸分子能够表达包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白的一个或多个融合蛋白。
18.一种携带如权利要求14所述的人工染色体(AC)的种子。
19.一种系统，包括一种包括一个DNA序列的串联重复序列的人工着色粒，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序、以及表达一个或多个融合蛋白的一个或多个核酸，这些融合蛋白包括这一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白，其中这一个或多个结合基序允许这一个或多个融合蛋白的结合以激活这种工程化的着色粒以形成一个动粒。
20.如权利要求19所述的系统，其中该融合蛋白进一步包括一个核定位信号。
21.如权利要求20所述的系统，其中该核定位信号是对于PKKRKV。
22.如权利要求19所述的系统，其中该融合蛋白进一步包括一个表位识别序列。
23.如权利要求22所述的系统，其中该表位识别序列包括HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。
24.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合基序是选自下组，该组的构成为TetR(SEQ ID NO. 1)、CENP_B 盒(SEQ ID NO. 2) ,LacO(SEQ ID NO. 3) ,LexA(SEQ ID NO. 4)、Gal4 (SEQ ID NO. 5)，及其组合。
25.如权利要求19所述的系统，其中该DNA序列是SEQID N0. 6。
26.如权利要求19所述的系统，包括至少500个串联重复序列。
27.如权利要求19所述的系统，包括至少1000个串联重复序列。
28.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为LacI、LexA、Gal4、TetR, CENP-B、及其片段和组合。
29.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为由SEQ ID. NO. 7编码的一种多肽、由SEQ ID N0. 8编码的一种多肽的氨基酸1-72、 由SEQ ID N0. 9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO. 10编码的一种多肽的氨基酸 1-206、由SEQ ID NO. 11编码的一种多肽的氨基酸1_205、及其组合。
30.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个动粒蛋白是选自下组，该组的构成为CENP-A/CENH3、CENP-C, MIS 12、CENP-0/MCM21、NDC80、CENP-S, CENP-T, NNFl、NUF2、 SPC25、及其片段和组合。
31.一种使用该植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法，包括合成一个人工染色体；引入一个或多个募集构建体；并且通过共表达一个或多个融合蛋白来激活经转化的人工染色体，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。
32.如权利要求31所述的方法，其中该人工染色体是通过全基因合成来合成的。
全文摘要
在此描述了一种工程化的着色粒、以及使用这种工程化的着色粒的系统和方法。这种工程化的着色粒可以具有一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列具有结合基序以允许融合蛋白的结合，这些融合蛋白包括一个DNA结合蛋白和一个动粒蛋白以激活这种工程化的着色粒。还描述了包括这种工程化的着色粒的一种植物人工染色体、包含这种工程化的染色体的一种转基因植物、以及一种使用这种植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法。
文档编号C07H21/04GK102549006SQ201080038756
公开日2012年7月4日 申请日期2010年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者达维·R·凯利 申请人:乔治亚大学研究基金公司