专利名称：一种梅花染色体周年性制片方法
技术领域：
本发明涉及植物染色体制片方法，具体是一种梅花染色体周年性制片方法。
背景技术：
梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)是重要的木本花丼,对梅花进行染色体层面的研究，是对其进行基因定位、构建物理图谱的重要前提。然而受限于木本植物，其染色体层面的研究极其局限。现有文献记载，梅的染色体数目据国外Okabe (1927 ，1929)报道是2n = 16,24,Oginuma等(1987,1989)发表是2n = 16。在国内，主要是黄哲(1989)首次对梅花的染色体进行了研究，黄燕文、包满珠等(1995)对野梅、果梅和花梅染色体的数目及形态进行了研究,林盛华、褚孟嫄(1999)对梅花染色体进行了研究，鉴定梅品种资源的倍数性，为梅分类起源和遗传育种提供细胞学依据。他们所采用的试验材料主要是花后新芽及冬季休眠枝条水培萌发的新芽，取材周期短，时间受限。染色体显带、荧光原位杂交等技术需要大量的重复实验对结论进行验证，而使用传统的茎尖材料进行染色体制片，取材方便，分裂相丰富，虽然能够满足染色体计数及常规核型分析的需要，但若需要进行大量重复实验，传统的取材方法无法对材料进行长期保存，无法满足大量重复实验的要求，因而严重阻碍了梅花染色体的深入研究。
发明内容
为了解决梅花染色体研究过程中染色体制片取材周期短、时间受限的问题，本发明提供一种梅花染色体周年性制片方法。本发明所述梅花染色体周年性制片方法，根据时间选取如下分生组织作为制片材料I)春季，梅花早春枝条新发茎尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚组织培养所得生长点；3)夏、秋，梅花一年生实生苗顶端生长点；4)冬季，梅花休眠枝条水培所得茎尖。其中，所述的梅花早春枝条新发茎尖，为梅花叶芽正常萌动伸长时，剥去鳞片及大叶，所取得的萌发茎尖。其中，所述的梅花未成熟胚，为授粉后25 35天，用石锤除去梅花果实的果肉，打开果核取出种子，所取的未成熟胚。其中，所述的梅花未成熟胚组织培养所得生长点，为以6-BA浓度是lmg/L、IBA浓度是0. 2mg/L的MS培养基进行梅花组织培养，暗培养一周，胚伸长时，切取的0. 5cm伸长部位作为梅花未成熟胚组织培养所得生长点。其中，所述的梅花一年生实生苗顶端生长点，为于第一年8月初对梅花种子进行2°C低温沙藏，55-65天后梅花种子发芽，播种栽培于温室，次年4月中旬移栽至大田，同时对梅花一年生实生苗进行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝条顶端生长点作为梅花一年生实生苗顶端生长点。其中，切取梅花一年生枝条顶端生长点的时间为上午9:00 11:00。其中，所述的梅花休眠枝条水培所得茎尖，为于11月中旬取一年生枝条蜡封处理，4°C低温保存一个月后水培，一周后发芽，所取的萌发茎尖。本发明所述的梅花染色体周年性制片方法，包含以下步骤(I)所取制片材料用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，作为固定后的材料待用；(2)配制纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分 含量为2. 0 2. 5%，果胶酶的重量百分含量为2. 0 2. 5% ;(3)将步骤(I)中固定后的材料用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解时间长度90 150min，作为酶解后的材料待用；(4)将酶解后的材料进行压片法制片。其中，步骤(2)所述配制纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分含量优选2. 38 %，果胶酶的重量百分含量优选2. 38 %。其中，步骤(3)所述用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解温度优选37°C，酶解时间长度优选I IOmin。本发明利用梅花不同时期的分生组织进行制片，克服了以往的梅花染色体制片取材受限于冬季及早春的时间限制，实现周年性制片。梅花染色体周年性制片方法克服了传统取材的时间限制，周期长，取材灵活，制片效果良好，有利于梅花染色体深入研究。
图I :梅花粉瓣早春枝条新发茎尖染色体100倍油镜镜检图像。图2 :梅花粉瓣未成熟胚染色体100倍油镜镜检图像。图3:梅花粉瓣未成熟胚组织培养所得生长点染色体100倍油镜镜检图像。图4:梅花粉瓣一年生实生苗顶端生长点染色体100倍油镜镜检图像。图5:梅花粉瓣休眠枝条水培所得茎尖染色体100倍油镜镜检图像。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I早春枝条新发茎尖染色体制片梅花品种粉瓣的萌动叶芽于2012年3月上旬采自北京鹫峰森林公园梅花温室。当叶芽萌动伸长时，剥去鳞片及大叶，取下萌发茎尖。将取得的茎尖直接用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。取纤维素酶0. 20g、果胶酶0. 20g、蒸懼水9. 60g配制成纤维素酶和果胶酶的酶溶液。将固定后的茎尖放入酶溶液中，37°C酶解150min，酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。切取胚顶端，置于载玻片上，用解剖针捣碎，平摊面积尽量大，滴加卡宝品红染色液，染色lOmin，加盖玻片用力压片。
光学显微镜镜检效果(图I) :100倍油镜镜检，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜。经计数，梅花染色体2n = 16。实施例2未成熟胚染色体制片梅花品种粉瓣未成熟果实于2011年5月初(授粉后25 35天)取于青岛梅园。用石锤除去果肉，打开果核，取出种子，将未成熟胚取出。将取得的未成熟胚直接使用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。取纤维素酶0. 25g、果胶酶0. 25g、蒸懼水9. 50g配制成纤维素酶和果胶酶的酶溶 液。将固定后的未成熟胚放入酶溶液中，37°C酶解90min，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。切取未成熟胚顶端，置于载玻片上，用解剖针捣碎，平摊面积尽量大，滴加卡宝品红染色液，染色lOmin，用力压片。光学显微镜镜检效果(图2) :100倍油镜镜检，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜。经计数，梅花染色体2n = 16。实施例3未成熟胚组织培养所得生长点染色体制片进行梅花品种粉瓣的未成熟胚组织培养，培养基配方为MS+6-BA (lmg/L)+IBA(0. 2mg/L)。将子叶切去一半后进行接种。暗培养一周，胚出现伸长时，切取伸长部位0. 5cm ( 一周后取材，则组织膨大，不便于操作)。将取得的材料直接使用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。取纤维素酶0. 25g、果胶酶0. 25g、蒸懼水IOg配制成纤维素酶和果胶酶的酶溶液。将固定后的材料放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。切取胚顶端，置于载玻片上，用解剖针捣碎，平摊面积尽量大，滴加卡宝品红染色液，染色lOmin，用力压片。光学显微镜镜检效果(图3) :100倍油镜镜检，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜。经计数，梅花染色体2n = 16。实施例4 一年生实生苗顶端生长点染色体制片于2010年8月初对梅花品种粉瓣种子进行2°C低温沙藏，60天后梅花种子发芽，播种栽培于温室。2011年4月中旬移栽至大田，同时对梅花一年生实生苗进行修剪。待分枝后，于上午9:00 11:00切取梅花一年生枝条顶端生长点。将所取一年生实生苗顶端生长点直接使用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。取纤维素酶0. 25g、果胶酶0. 25g、蒸馏水IOg配制成纤维素酶和果胶酶的酶溶液。将固定后的一年生实生苗顶端生长点放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。切取胚顶端，置于载玻片上，用解剖针捣碎，平摊面积尽量大，滴加卡宝品红染色液，染色lOmin，用力压片。光学显微镜镜检效果(图4) :100倍油镜镜检，染色体分散良好，便于计数，长度适宜。经计数，梅花染色体2n = 16。实施例5冬季休眠枝条水培所得茎尖染色体制片于2011年11月中旬取梅花品种粉瓣一年生枝条，同时进行蜡封处理。4°C低温保存一个月后瓶插水培，一周后陆续发芽，取萌发茎尖。将所取茎尖直接使用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。取纤维素酶0. 25g、果胶酶0. 25g、蒸懼水IOg配制成纤维素酶和果胶酶的酶溶液。将固定后的茎尖放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶 解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干。切取胚顶端，置于载玻片上，用解剖针捣碎，平摊面积尽量大，滴加卡宝品红染色液，染色lOmin，用力压片。光学显微镜镜检效果(图5) :100倍油镜镜检，染色体分散好，便于计数，长度适宜。经计数，梅花染色体2n = 16。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种梅花染色体周年性制片方法，其特征在于，根据时间选取如下分生组织作为制片材料 I)春季，梅花早春枝条新发茎尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚组织培养所得生长点；3)夏、秋，梅花一年生实生苗顶端生长点；4)冬季，梅花休眠枝条水培所得茎尖。
2.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花早春枝条新发茎尖，为梅花叶芽正常萌动伸长时，剥去鳞片及大叶，所取得的萌发茎尖。
3.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花未成熟胚，为授粉后25 35天，用石锤除去梅花果实的果肉，打开果核取出种子，所取的未成熟胚。
4.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花未成熟胚组织培养所得生长点，为以6-BA浓度是lmg/L、IBA浓度是O. 2mg/L的MS培养基进行梅花组织培养，暗培养一周，胚伸长时，切取的O. 5cm伸长部位作为梅花未成熟胚组织培养所得生长点。
5.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花一年生实生苗顶端生长点，为于第一年8月初对梅花种子进行2°C低温沙藏，55-65天后梅花种子发芽，播种栽培于温室，次年4月中旬移栽至大田，同时对梅花一年生实生苗进行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝条顶端生长点作为梅花一年生实生苗顶端生长点。
6.根据权利要求5所述的制片方法，其特征在于，切取梅花一年生枝条顶端生长点的时间为上午9:00 11:00。
7.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花休眠枝条水培所得茎尖，为于11月中旬取一年生枝条蜡封处理，4°c低温保存一个月后水培，一周后发芽，所取的萌发茎尖。
8.根据权利要求1-7所述的制片方法，其特征在于，包含以下步骤 (1)所取制片材料用卡诺固定液低温4°C固定20h以上，作为固定后的材料待用； (2)配制纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分含量为2.O 2. 5%，果胶酶的重量百分含量为2. O 2. 5% ; (3)将步骤(I)中固定后的材料用步骤(2)配制的纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解时间长度90 150min，作为酶解后的材料待用； (4)将酶解后的材料进行染色压片法制片。
9.根据权利要求8所述的制片方法，其特征在于，步骤(2)所述的纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分含量为2. 38%，果胶酶的重量百分含量为2. 38%。
10.根据权利要求8所述的制片方法，其特征在于，步骤(3)所述用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解温度为37°C，酶解时间长度为llOmin。
全文摘要
本发明提供了一种梅花染色体周年性制片方法，该方法根据时间选取如下分生组织作为制片材料1)春季，早春枝条新发茎尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及未成熟胚组织培养所得生长点；3)夏、秋，梅花一年生实生苗顶端生长点；4)冬季，梅花休眠枝条水培所得茎尖。以上述的制片材料进行染色体制片，依次进行低温固定、酶解、染色压片，均可获得分散良好、清晰的染色体图像。本发明解决了梅花染色体研究过程中染色体制片取材周期短、时间受限的问题。
文档编号G01N1/28GK102768131SQ201210146739
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者孙丽丹, 张启翔, 杨炜茹, 陈晶鑫 申请人:北京林业大学