真菌基因文库的双分裂标记物整合的制作方法

真菌基因文库的双分裂标记物整合的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性染色体整合的方法以及适用于此目的的多核苷酸构建体。
【专利说明】真菌基因文库的双分裂标记物整合
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及若干已知特征和技术的组合，当如在此所示一起应用时，其提供一种 用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性染色体整合的改进方法以及适用 于此目的的多核苷酸构建体。
[0004] 发明背景
[0005] 常染色体复制质粒已经被用来成功地转化真菌宿主细胞，既作为预形成的环状质 粒又作为线性化质粒与PCR片段一起共转化，用于在转化的宿主细胞内进行体内重组的目 的。真菌复制质粒配备有自主复制序列，例如熟知的最初从构巢曲霉分离的AMA1序列或其 已知的功能衍生物之一(参见例如，阿莱克森科(Aleksenko)和克拉特巴克(Clutterbuck)， 分子微生物学(Mol Microbiol ·) 1996年2月；19(3): 565-74) 〇
[0006] 例如由尼尔森(Nielsen)等人(针对构巢曲霉的有效的基于PCR的用可再循环标记 物进行的基因革巴向（Efficient PCR-based gene targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans)，真菌遗传学和生物学（Fungal Genetics and Biology)43 (2006)54-64)披露了丝状真菌宿主中的位点特异性分裂标记物（split-marker)或双分 (bi-part ite)染色体整合。

【发明内容】

[0007] 众所周知，常染色体复制质粒的使用改进在丝状真菌宿主细胞中的转化效率，并 且提供一致的表达水平，以使得当所述质粒被引入宿主细胞中时，能够比较自包括在其中 的基因文库表达的蛋白质。然而，本申请的诸位发明人已经发现用自主复制载体对丝状真 菌宿主细胞进行转化，随后进行包括在所述载体中的编码脂肪酶的基因的位点特异性分裂 标记物染色体整合，提供了优越的转化效率加上脂肪酶表达水平的出人意料的增加，如通 过SDS-PAGE评估的（参见图3)。
[0008] 因此，在第一方面，本发明涉及用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点 特异性染色体整合的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] a)提供一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包括自主复制序列和整合盒，所 述盒包括基因文库和第一选择性标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部 分并且在另一侧侧接第三选择性标记的非功能性部分；
[0010] b)提供一种丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞在其染色体中包括第二选择 性标记的非功能性部分以及第三选择性标记的非功能性部分，其中第二和第三选择性标记 的染色体非功能性部分与多核苷酸构建体中的对应的非功能性部分之间的正确重组将产 生第二和第三功能性染色体选择性标记；
[0011] c)用多核苷酸构建体转化宿主细胞并且针对第一选择性标记在该宿主细胞中的 存在进行选择，由此分离出被成功转化的宿主细胞;并且然后
[0012] d)针对第二和第三功能性选择性标记的存在进行选择，由此获得具有基因文库的 正确位点特异性染色体整合的宿主细胞。
[0013] 在第二方面，本发明涉及用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性 染色体整合的多核苷酸构建体，所述构建体包括自主复制序列和整合盒，所述盒包括基因 文库和第一选择性标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部分并且在另一 侧侧接第三选择性标记的非功能性部分。
[0014] 定义
[0015] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列 的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并 且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组 合。
[0016] 控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同 基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少， 控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多 肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个 接头。
[0017] 表达:术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0018] 表达载体:术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核 苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
[0019]宿主细胞:术语"宿主细胞"意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表 达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变 而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0020] 分离的：术语"分离的"意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有 天然存在的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过 增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，宿主细胞中的 重组体产生;编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启 动子强的启动子）。
[0021] 核酸构建体：术语"核酸构建体"或"多核苷酸构建体"意指单链或双链的核酸分 子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰 成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
[0022] 可操作地连接:术语"可操作地连接"意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核 苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0023] 序列一致性:用参数"序列一致性"来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列 之间的相关性。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件 套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet ·) 16:276-277)(优选5 · 0 · 0版或更 新版本)的尼德尔(如6(116)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(如6(1161]^11-￥11118〇11)算法(尼德 尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,分子生物学杂志（J.Mol .Biol .)48:443-453)来确 定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分 0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输 出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0024](一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0025]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯等人，2000,同上）（优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施 算法(尼德尔曼和翁施，1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所 使用的参数是空位开放罚分1 〇，空位延伸罚分〇 . 5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS 版)取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得)被用作百分比 一致性，并且计算如下：
[0026](一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0027]变体:术语"变体"意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插 入和/或缺失）的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据一个位置的氨基酸;缺失意指去 除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加 一个氨基酸。
[0028]附图简要说明
[0029] 图1示出了在实例1中构建的质粒pBAC3155。
[0030] 图2示出了在实例1中构建的质粒pBGMH0021。
[0031]图3示出了 SDS-PAGE的照片；泳道卜3示出了通过具有携带在附加型基于AMA1质粒 上的表达盒的菌株(BGMH1000)表达的脂肪酶条带（由箭头指示），然而泳道4-6示出了通过 具有整合到宿主菌株(BGMH1001;C0LS1300)的染色体中的表达盒的菌株表达的显著更粗的 脂肪酶条带，如在此的实例2中概述的。
[0032] 发明详述
[0033] 本发明的第一方面涉及用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性 染色体整合的方法，所述方法包括以下步骤：
[0034] a)提供一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包括自主复制序列和整合盒，所 述盒包括基因文库和第一选择性标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部 分并且在另一侧侧接第三选择性标记的非功能性部分；
[0035] b)提供一种丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞在其染色体中包括该第二选 择性标记的非功能性部分以及该第三选择性标记的非功能性部分，其中该第二和第三选择 性标记的染色体非功能性部分与该多核苷酸构建体中的对应的非功能性部分之间的正确 重组将产生第二和第三功能性染色体选择性标记；
[0036] c)用多核苷酸构建体转化宿主细胞并且针对第一选择性标记在该宿主细胞中的 存在进行选择，由此分离出被成功转化的宿主细胞;并且然后
[0037]针对第二和第三功能性选择性标记的存在进行选择，由此获得具有基因文库的正 确位点特异性染色体整合的宿主细胞。
[0038] 在第二方面，本发明涉及用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性 染色体整合的多核苷酸构建体，所述构建体包括自主复制序列和整合盒，所述盒包括基因 文库和第一选择性标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部分并且在另一 侧侧接第三选择性标记的非功能性部分。
[0039] 在本发明的一个优选实施例中，该基因文库包括编码感兴趣的亲本多肽的基因的 修饰的、突变的或变体版本或由其组成;优选地，该感兴趣的亲本多肽是一种酶;更优选地， 其是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、 糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移 酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 变位酶(mutanase )、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酸氧化酶、蛋白水解酶、核 糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0040] 本发明的丝状真菌宿主细胞优选地是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属 (Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐 球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、 毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃 壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂裙菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓 菌属(Trametes)或木霉属细胞;更优选地，该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲 霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟錯菌 (Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟錯菌（Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟錯菌 (Ceriporiopsis gilvescens) Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟錯 菌（Ceriporiopsis rivu lo sa)、微红拟錯菌（Ceripori ops is subrufa)、虫拟錯菌 (Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金抱子菌（Chrysosporium inops)、嗜角质金抱子 菌（Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、奠状金抱子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌（Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢 子菌（Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞、毛革盖菌（Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢 (Fusarium bactridioides)、谷类镜抱（Fusarium cerealis)、库威镜抱（Fusarium crookwellense)、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木 镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰 抱(Fusarium torulosum)、拟丝抱镜抱(Fusarium trichothecioides)、镶片镜抱、特异腐 质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌 (Phlebia radiata)、刺序侧耳（Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长绒毛栓菌 (Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、 里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0041]优选的是本发明的丝状真菌宿主细胞具有增加的同源重组与非同源重组（HR/ NHR)比率；优选地，非同源末端连接(NHEJ)途径的一种或多种组分被抑制或者同源重组 (HR)途径的一种或多种组分被过表达;最优选地，酵母KU70基因的等效物被失活。
[0042]在一个优选实施例中，本发明的自主复制序列是来自构巢曲霉的AMA1序列或其功 能衍生物。
[0043] 本发明的选择性标记优选地是pyrG、ni iA和niaD。
[0044] 核酸构建体
[0045] 本发明还涉及核酸构建体或多核苷酸构建体，这些构建体包含可操作地连接至一 个或多个控制序列的本发明的基因文库，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导 编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
[0046] 该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在多核 苷酸序列插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必要的。用于利用重组DNA方法 修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0047] 该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷 酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导该多肽的表达。该启动 子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启 动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
[0048] 在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实 例是获得自以下各项的基因的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉酸 稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(W0 96/00787)、镶片镰孢菌淀 粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚）（W0 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn (奎恩）（W0 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、 里氏木霉内切葡聚糖酶Π 、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉 木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶Π 、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏 木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启 动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的 前导子;非限制性实例包括来自编码中性淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已 经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的 前导子）；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6，011，147中描 述。
[0049] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地 连接至编码该多肽的多核苷酸的3'_末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用 于本发明中。
[0050] 用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得:构巢曲霉乙酰胺 酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α_葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉 酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉 纤维二糖水解酶Π 、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡 聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木聚糖酶III、里氏木霉木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
[0051] 该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域， 它增加该基因的表达。
[0052] 该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译重要的非翻译mRNA区域。该前 导子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'_末端。可以使用在宿主细胞中起作用的 任何前导子。
[0053] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷 酸异构酶的基因获得。
[0054] 控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3'-末端并且 当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用 在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
[0055] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得:构巢曲 霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰 抱膜蛋白酶样蛋白酶。
[0056] 控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的 信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'_端可以固有地包含在翻译阅读框中与 编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'_端可 以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编 码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地 替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入 宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0057] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号 肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维 素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0058] 控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽 被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常 是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。 前肽编码序列可以从以下各项的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆 菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(W0 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及 酿酒酵母因子。
[0059] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的Ν-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的Ν-末端。
[0060] 还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽 的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存 在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA 淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏 木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统 中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增 的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
[0061 ] 表达载体
[0062]本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载 体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽 的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建 体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这 样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0063] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA程 序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体 的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
[0064] 该载体包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的 选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、 重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
[0065]用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰 氨基咪唑-琥珀羧胺合酶）、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶）、amdS(乙酰胺酶）、argB(鸟氨 酸氨甲酰基转移酶）、bar(草丁膦乙酰转移酶）、hph(潮霉素磷酸转移酶）、niaD(硝酸还原 酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶）、sC(硫酸腺苷基转移酶）、以及trpC(邻氨基苯甲酸 合酶），连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以 及吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是 adeA、adeB、amdS、hph 以及pyrG基因。
[0066] 选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面， 双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
[0067] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或 用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载 体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的 一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合 元件应包含足够数量的核酸，例如100至10，〇〇〇个碱基对、400至10，000个碱基对、以及800 至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的 可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些 整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组 整合到宿主细胞的基因组中。
[0068] 对于自主复制，该载体包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制 起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语"复制起点 (origin of replication)"或"质粒复制子(plasmid replicator)"意指使得质粒或载体 可在体内复制的多核苷酸。
[0069]在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI (格姆斯（Gems)等人， 1991，基因（Gene)98:61-67;卡伦(Cullen)等人，1987,核酸研究（Nucleic Acids Res. )15: 9163-9175;W0 00/24883)^1^1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披 露于W0 00/24883中的方法来完成。
[0070]可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷 酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当 的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，以 及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0071] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普 通技术人员熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989,同上）。
[0072] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法 以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023， 约尔顿(Yelton)等人，1984,美国国家科学院院刊（Proc.Natl .Acad. Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988,生物/技术(Bio/Technology )6:1419-1422 中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989,基因（Gene)78: 147-156和W0 96/00787描述。
[0073]生产方法
[0074]本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽 的条件下培养本发明的重组宿主细胞;并且可任选地，（b)回收该多肽。
[0075]这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中 培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行 摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批 补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基 中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根 据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。如果多肽分泌到该营养 培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中 进行回收。
[0076]可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法 包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定 来确定该多肽的活性。
[0077]可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但 不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一方面，回 收包含该多肽的发酵液。
[0078]可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程 序包括但不限于:色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺 寸排阻色谱）、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦）、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE、或提取（参见例如，蛋白质纯化（Protein Purification)，詹森（Janson)和赖登 (Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
[0079] 在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞 用作该多肽的来源。
[0080] 发酵液配制品或细胞组合物
[0081] 本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一 步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因 的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽）、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或 发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎 片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
[0082]如在此使用的术语"发酵液"是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收 和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质 合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可 以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分 级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后 存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的 和/或无活力的微生物细胞。
[0083]在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少 一种1-5碳的有机酸和/或其盐）以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸 和/或其盐）。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两 种或更多种的混合物;并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、 其盐，或前述两种或更多种的混合物。
[0084] 在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞 和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细 胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
[0085] 这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑 菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
[0086] 该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分 级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细 胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细 胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和 杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培 养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
[0087] 如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分， 例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以 除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
[0088] 可以通过W0 90/15861或W0 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制 品和细胞组合物。
[0089] 实例
[0090] 在此我们使用常染色体复制质粒将大基因文库转化到丝状真菌中并且然后使用 双分裂标记物系统确保该文库被位点特异性整合到该真菌的染色体中，由此提供稳定的且 可比较的表达产量，甚至在富生长培养基中。
[0091] 来自构巢曲霉的熟知的AMA1 (自主维持)序列使得质粒在真菌细胞核中以附加型 复制成为可能。我们使用的质粒包含ΑΜΑ序列以及包括基因文库和具有启动子与终止子的 全长pyrG基因的整合盒，所述盒在每一侧分别侧接niiA和niaD基因的非功能性部分，SP两 个基因的5'端和启动子。
[0092] 将该质粒文库转化到pyrG、niiA、niaD负型米曲霉宿主菌株(Colsl392)中并且首 先在具有尿素的基本培养基中进行筛选。这意味着仅针对pyrG的存在（即单独成功的转化） 进行选择，因为当该菌株使用尿素作为氮源时，不需要功能性niiA和niaD基因。经转化的质 粒将很可能以附加型存在，随着真菌细胞生长具有从细胞核中丢失的倾向。
[0093]当鉴定出阳性转化子时，将大量的孢子涂布至补充有NaN03的基本培养基的板上。 在整合盒已经成功地重组到宿主细胞的染色体中并在该过程中重构niiA和niaD位点的情 况下，仅孢子可以发芽和存活。
[0094]基因组位点特异性整合确保这些转化子是稳定的并提供更高的且更一致的表达 水平，其进而允许从基因文库中选择感兴趣的单个基因。
[0095]实例1.基于ΑΜΑ的整合质粒的构建
[0096] 如下制备保留ΑΜΑ序列和允许整合到米曲霉(C01sl392)的染色体中的niiA和niaD 中的区域两者的质粒。
[0097] 将ΑΜΑ区域插入pBGMH14中从而产生pBAC3155。
[0098] 在PCR反应中，使用pENI4286(即ρΕΝΙ1298的衍生物（披露于W0 2008138835中））作 为模板以及寡核苷酸291012J4和291012J5将ΑΜΑ序列分离为PCR片段：
[0099] 291012jvi4：gccgcaattgtggctgcaggtcgaccatgccg(SEQ ID N0:1)
[0100] 291012jvi5：gccgcaattgaatgataccacagtctagttgac(SEQ ID N0:2)
[0101] 将该AM序列PCR片段使用商业克隆试剂盒进行克隆并且然后转化到ToplO大肠杆 菌细胞中。制备DNA制剂用于克隆并且用Mfel限制性内切酶切割。也将载体pBGMH14(W0 2013/119302)用Mfel切割并且用小牛肠磷酸酶处理。将切割载体和包含ΑΜΑ的片段从琼脂 糖凝胶纯化并连接过夜。将该连接混合物转化到大肠杆菌DHlOb中，并且DNA制剂由所得的 大肠杆菌克隆构成。将DNA制剂进行测序并用限制性内切酶EcoRV切割以鉴别正确的克隆。 将所得的质粒命名为PBAC3155，参见图1。
[0102] 将脂肪酶基因插入PBAC3155中从而产生pBGMH0021。
[0103] 质粒pBAC3155包含PacI/Nt.BbvCI尿嘧啶特异性切除试剂或USER?盒（汉森 (Hansen)等人，2011，应用与环境微生物学(Appl .Environ.Microbiol · )77(9) :3044-51)， 该盒在一侧侧接米曲霉niaD基因的一部分并且在另一侧侧接米曲霉niiA基因的一部分 (USER?商标属于新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，美国）。尿嘧啶特异性切除 酶在尿嘧啶位置处产生单核苷酸缺口。该酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂 解酶内切核酸酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切除，从而形成无碱基(无嘧啶）位 点，而保持磷酸二酯骨架的完整。内切核酸酶VIII的裂解酶活性在无碱基位点的3'和5'侧 破坏磷酸二酯骨架，这样使得释放无碱基的脱氧核糖。可以用PacI和Nt.BbvCI使PPacI/ Nt.BbvCI USER?盒线性化;然后具有相容的突出端的PCR产物可以克隆到这个位点。
[0104] 我们将包含来自米曲霉的N A 2 t p i启动子、编码疏棉状嗜热丝孢菌 (T. lanuginosus)脂肪酶的基因以及转录终止子的片段克隆到Pac Ι/Nt.BbvCI USER?盒 中。使用两种包含尿嘧啶的引物BGMH155和BGMH156将该片段从作为模板的pENI4286 (pENI 1298的衍生物)进行PCR扩增。
[0105] BGMH155：ggacttaauagcgagagagttgaacctggacg(SEQ ID NO:3)
[0106] BGMH156:gggtttaaucagatggcccgagaggactattccga(SEQ ID N0:4)
[0107] 将加下划线的序列用于USER?辅助克隆到PBAC315 5中的Pac I /Nt. BbvC I USER?盒 中。
[0108] 最终体积为50μ1的扩增反应由以下组成：100ng的每种引物、模板DNA(10ng PENI4286)、1ΧΡ/^Τηγ/)〇_? C、反应缓冲液、2.5μ1 的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的共混物（各以 10mM)以及2.5单位的P/wrwr/)〇_?Cx热启动DNA聚合酶。将PCR反应编程为：1个循环，在95°C 下持续2分钟;40个循环，每个循环在95°C下持续30秒、55°C下持续30秒、以及72°C下持续4 分钟；以及最终延长，在72 °C下持续10分钟。
[0109] 在PCR扩增之后，添加5μ1的10X NEBuffer 4和20单位的Dpn I并且在37°C下孵育1 小时。在80°C下持续20分钟使Dpn I失活。将PCR产物进行凝胶纯化，并且将50ng的PCR产物、 10ng的PacI/Nt.BbvCI消化的pBAC3155以及1单位的USER?酶以10μ1的总体积在37°C下孵育 20分钟，随后在25°C下孵育20分钟。接着将10μ1转化到0NESHOT?T0P10感受态细胞中。将 所得的质粒命名为pBGMHOO 21，参见图2。
[0110] 实例2.用pBGMH0021对丝状真菌菌株C0LS1392进行转化
[0111] 将质粒PBGMH0021转化到⑶LS1392中，将其涂布在10mM尿素板上;选择转化子，即 菌株BGMH1000,其中pBGMH0021作为附加型质粒存在。
[0112] 将多个转化子转移到具有10mM尿素的新板上，并且六天后，通过向每个板中添加 l〇ml的水来收获孢子。将lml孢子(孢子量/ml:约l，5x 107个)转移到含有NaN03的板上。将这 些板在37°C下孵育六天，从而提供10-100个菌落/板。
[0113] 因为当没有尿苷存在于这些板中时，pyrG、niiA和niaD对于菌株在作为仅有的氮 源的NaN03上生长而言都需要是功能性的，所以出现的菌落必须已经修复了niiA与niaD两 者并且已经引入了pyrG基因。要想让这成为可能，同源重组必须已经在niiA与niaD两者中 发生，在该过程中重构两个基因座。将一个菌株选择为BGMH1001。
[0?14]最后，在包含尿苷的板上选择pyrG-突变型菌株，即Cols 1300。
[0115]
[0116] 实例3.来自附加型与整合型表达盒的脂肪酶产量的比较
[0117] 使在实例2中构建的菌株在200μ1 YPM-培养基(+尿素）中的MTP中在34°C下生长3 天。将来自附加型基于AMA1质粒携带的表达盒(菌株BGMH1000)和来自染色体位点特异性整 合的表达盒(菌株BGMH1001/C0LS1300)的柔毛腐质霉脂肪酶的表达水平通过SDS-PAGE进行 比较。
[0118] SDS-PAGE凝胶的照片示于图3中。通过箭头指示脂肪酶条带；泳道1-3示出了附加 型基于AMA1质粒的表达，然而泳道4-6示出了通过根据本发明的染色体整合盒表达的显著 更粗的脂肪酶条带。
【主权项】
1. 一种用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性染色体整合的方法，该 方法包括以下步骤： a) 提供一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包括自主复制序列和整合盒，所述盒 包括该基因文库和第一选择性标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部分 并且在另一侧侧接第三选择性标记的非功能性部分； b) 提供一种丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞在其染色体中包括该第二选择性 标记的非功能性部分以及该第三选择性标记的非功能性部分，其中该第二和第三选择性标 记的染色体非功能性部分与该多核苷酸构建体中的对应的非功能性部分之间的正确重组 将产生第二和第三功能性染色体选择性标记； c) 用该多核苷酸构建体转化该宿主细胞并且针对该第一选择性标记在该宿主细胞中 的存在进行选择，由此分离出被成功转化的宿主细胞;并且然后 d) 针对第二和第三功能性选择性标记的存在进行选择，由此获得具有该基因文库的正 确位点特异性染色体整合的宿主细胞。2. 如权利要求1所述的方法，其中该基因文库包括编码感兴趣的亲本多肽的基因的修 饰的、突变的或变体版本或由其组成;优选地，该感兴趣的亲本多肽是一种酶;更优选地，其 是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖 酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移 酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、 转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗 霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、 腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌 属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉 属、栓菌属或木霉属细胞。4. 如权利要求3所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日 本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘 诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克 诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子 菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、 异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰 孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁 丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长绒毛栓菌、 变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞具有增加的同源重 组与非同源重组(HR/NHR)比率;优选地，非同源末端连接(NHEJ)途径的一种或多种组分被 抑制或者同源重组(HR)途径的一种或多种组分被过表达;最优选地，酵母KU70基因的等效 物被失活。6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该自主复制序列是来自构巢曲霉的AMA1 序列或其功能衍生物。7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中这些选择性标记是pyrG、niiA和niaD。8. -种用于在丝状真菌宿主细胞中对基因文库进行位点特异性染色体整合的多核苷 酸构建体，所述构建体包括自主复制序列和整合盒，所述盒包括该基因文库和第一选择性 标记，其中该盒在一侧侧接第二选择性标记的非功能性部分并且在另一侧侧接第三选择性 标记的非功能性部分。9. 如权利要求8所述的多核苷酸构建体，其中该基因文库包括编码感兴趣的亲本多肽 的基因的修饰的、突变的或变体版本或由其组成;优选地，该感兴趣的亲本多肽是一种酶； 更优选地，其是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊 精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。10. 如权利要求8或9所述的多核苷酸构建体，其中该自主复制序列是来自构巢曲霉的 ΑΜΑ1序列或其功能衍生物。11. 如权利要求8-10中任一项所述的多核苷酸构建体，其中这些选择性标记是pyrG、 niiA和niaD〇
【文档编号】C12N15/90GK105992821SQ201480065689
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年12月3日
【发明人】B·G·汉森, C·L·奥尔森, J·维恩
【申请人】诺维信公司