甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilumoxytropis的定向分离及鉴定方法。从甘肃棘豆中分离内生真菌Undifilumoxytropis时，不可避免的会分理出其他种属的菌株，影响分离效率。本发明用蒸馏水、乙醇、无菌水和次氯酸钠依次清洗甘肃棘豆的茎和成熟种子，再将组织剪成小块置于PDA平板上，平板中充满CO2并用保鲜膜密封，光照下室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至培养基上纯化，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面冷藏；提取分离菌株的基因组DNA，在GeneBank中进行序列比对。本发明从疯草中只分离得到一种菌，减少其他种属内生真菌的干扰，方法简便易行，保存过程中菌株不易发生变异或菌株活性减低。
【专利说明】甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifi Ium oxytropis的定
向分离及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法。
【背景技术】
[0002]内生真菌(fungal endophyte)是指生活史或其中某一段时期生活在活的植物组织内，对植物组织不引起明显病害症状的真菌，包括腐生真菌、潜伏性病原真菌和菌根菌。目前研究发现，疯草毒素与疯草内生真菌关系密切。一方面疯草内生真菌协助疯草产生毒素，从而增强了疯草的毒性，减少了动物对疯草的采食；另一方面，内生真菌可以提高疯草的抗逆性，这使得疯草在干旱半干旱的草原上生命力显得极其顽强，加大了防治的难度。
[0003]最初，人们认为疯草毒素苦马豆素是疯草在生长过程中自身合成的代谢产物，但深入研究发现，苦马豆素是由疯草携带的内生真菌合成的。人们对疯草中苦马豆素的来源认识有了更新，认为疯草内苦马豆素的含量与内生真菌的种类、数量及定植部位等关系密切。现已证实，能合成苦马豆素的真菌主要有豆类丝核菌属Ieguminicola')^金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae )和埃里砖格孢属iEmbelIisia，现已更名为
尤其是内生真菌Undifilum oxytropis合成力最优。
[0004]在对疯草进行内 生真菌分离时,不仅会分离得到内生真菌Undifilum oxytropis,还会不可避免的得到其他种属的菌株，如下表1，严重影响了分离效率，造成了时间和精力上的损失。
[0005]表1分离疯草携带的内生真菌的多样性
【权利要求】
1.甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌的定向分离及鉴定方法,其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:分离: 将甘肃棘豆的茎和成熟种子用蒸馏水冲洗干净，经质量分数为75%的乙醇溶液漂洗30S、无菌水冲洗3次、有效氯的质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液漂洗3 min、无菌水冲洗3-5次后，再将组织剪成5_X 5_小块，分别置于PDA平板上，平板中充满CO2并用保鲜膜密封，在光照条件下于室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至PDA培养基上纯化2-3次，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面，4°C冰箱保存备用； 步骤二:ITS序列比对: (1)刮取新鲜菌丝80mg，用去离子水冲洗干净后，再用无菌水冲洗一次，用滤纸将菌丝表面水吸干后放入1.5mL离心管内，加入液氮迅速研磨至粉末； (2)向管内加入预热65°C的2XCTAB缓冲液500μ L，振荡混匀，置于65°C水浴锅中温育30min,中间摇晃2_3次； (3)放置至室温后，加入500μ L的萃取混合液，振荡混匀后，室温静置5min，期间持续轻摇；
(4)4°C，12000 r/min,离心 15min ； (5)吸取上清，再加入500μ L的CTAB提取液，混匀，于65°C再温育15min ； (6)加入500μ L的萃取混合液,振荡混匀，12000 r/min, 4°C离心15min ； (7)取上清加入1/10体积、pH5.2、摩尔体积浓度为3mol/L的NaAC，再加入500 μ L的异戍醇，轻摇即出现沉淀，-20°C放置30min以上；4°C, 13000 r/min,离心15min ;弃上清,用质量分数为75%的冷乙醇溶液100 μ L洗涤沉淀两次，室温下风干； (8)用ρΗ8.0的TE缓冲液或灭菌的双蒸水溶解，于4°C贮存；以真菌rDNA扩增的通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3，)为上、下游引物，扩增其核糖体rDNA-1TS保守序列； 进行扩增的 PCR反应体系为 50 μ L =TaKaRa Taq DNA聚合酶 2.5UU0XPCR Buffer 5 μ L,MgCl2 3ML、Dntp 4 μ L、ITSl 和 ITS4 引物各 2 μ L、模板 DNA 0.5 μ L,加双蒸水至 50 μ L ； 反应条件为:95°C预变性5min ； (9)95°C变性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin,30个循环；最后72°C延伸1min使其完全反应； (10)将PCR产物加入质量体积分数为15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中进行分析，真菌5.8S rDNA-1TS序列的长度一般为500-700bp，对扩增产物进行测序，将测定的5.8S rDNA-1TS序列用BLAST与GenBank中的5.8S rDNA-1TS序列进行同源性比较，应用Clustal X 1.83 vers1n和MEGA 5.0软件，分别采用邻接法和最大简约法构建系统进化树进行种属归类，自展法检测进化树，自展数据集为1000次。
2.根据权利要求1所述的甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilumoxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于: 步骤一中，所述的PDA培养基的配方如下: 马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸懼水I 000 mL。
3.根据权利要求2所述的甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于: 步骤二的(3)和(6)中，所述萃取混合液由质量比为25:24:1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合而成 。
【文档编号】C12R1/645GK104031849SQ201410318819
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】路浩, 杨晓雯, 赵宝玉, 曹丹丹, 薛瑞旭, 权海云 申请人:西北农林科技大学