专利名称：花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞遗传学制片方法，具体是涉及一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法。
背景技术：
植物染色体是细胞遗传的物质基础，染色体结构和数目的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源，根尖细胞有丝分裂中期制片为研究植物染色体提供了很好的技术手段。 然而植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难平整地分散在载玻片上。为了得到良好的植物根尖细胞有丝分裂中期的染色体制片，最初研究者用盐酸解离软化细胞壁，后来采用酶解去壁低渗的染色体制片方法，该方法能使染色体分散平整，在植物染色体上有着广泛应用。 但是，酶解去壁低渗方法在去除细胞壁的过程中，酶解时间、低渗时间不易掌握，且不同植物材料处理时间可能不同，染色体丢失较多；酸解同样存在解离时间不宜控制，不同植物材料处理时间可能不同；此外盐酸对染色体的结构影响较大，若解离时间太短，细胞压不开； 解离时间太长，则染色体破坏较为严重，试验效果均不理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种适用性强、步骤简化、易于控制的花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法。本发明的技术方案
一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法，包括以下步骤
(1)预处理选取长10-15mm、粗O. 8-1. 2 mm的新鲜花生根尖，用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理；
(2)固定将花生根尖放入卡诺氏固定液中，室温处理12-24h，放入_20°C冰箱中，待
用；
(3)醋酸压片取固定好的花生根尖，用体积浓度为45%的醋酸浸泡30-60秒，待根尖膨胀饱满后，切取分生区根尖O. 3-0. 6 mm置于载玻片上，滴一滴所述醋酸，盖上盖玻片，调整根尖至盖玻片正中位置，用双面刀片垫起盖玻片一角，用解剖针垂直在盖玻片中央敲击一下，再在盖玻片上根尖四周垂直敲击5-8次，使材料细胞分散，然后将载玻片放在酒精灯的外焰火烤解离软化细胞壁，火烤时间以盖玻片上雾状散开为宜，用滤纸垫在盖玻片上吸去多余醋酸，用拇指垂直向下压盖玻片，然后在相差显微镜下进行观察；
(4)冰冻揭片将处于有丝分裂中期、染色体平整分散细胞的制片放置于-7(T-80°C 的超低温冰箱中冰冻12-24h，用双面刀片快速揭开盖玻片，将载玻片放入无水乙醇中脱水 12-24h，最后吹干无水乙醇，待用；
(5)染色体染色分带或荧光原位杂交。所述用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理的时间为3h。所述卡诺氏固定液的成分为酒精冰醋酸的体积比为3:1。
所述处于有丝分裂中期、染色体平整分散的细胞数目为10个以上。所述染色分带是将吹干无水乙醇的载玻片在IXPBS中浸泡10分钟，同时在 995 μ L DAPI缓冲液中加入5 μ L浓度O. lmg/ml的DAPI母液，混匀，处理完毕后每片加 500 uL DAPI染液，染色2分钟，用I XPBS冲洗4-5次，滴加胶液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余的胶液；在荧光显微镜下用450 490 nm激发光波长观察，摄取图象。所述花生根尖细胞用芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄的根尖细胞来替代。本发明的积极有益效果
(I)本发明选择粗细适中的花生根尖进行压片，得到的制片细胞平整、染色体分散，且居分裂中期的细胞较多。若选择的根尖太粗，细胞壁、表皮组织过厚，则细胞压不平(图1)， 若根尖太细，分生区细胞及中期分裂相太少，制片不理想。(2)本发明通过敲击盖玻片使分散细胞后，以45% (V/V)的醋酸为介质，用酒精灯火烤，使细胞充分解离软化，然后垂直压片获得平整分散的中期染色体分裂相(图3、图4)。 该方法克服了以往采用盐酸解离造成的细胞粘连、染色体不宜散开、染色体形态不理想的缺点(图2)，还克服了不同植物间盐酸解离时间不同的问题。(3)本发明方法简化，不用酶解去除细胞壁，也不用低渗，不用盐酸解离，而用醋酸做介质直接进行压片，试剂对染色体的影响较小，整个过程易于操作控制，步骤简单，节约试剂和实验时间，能提闻制片效率。(4)本发明的方法不仅适用于花生，也适用于芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄等多种植物根尖细胞有丝分裂中期的制片。实验表明，该方法可以获得良好的染色体制片效果，适用性较强。通过冰冻后揭片，用荧光染料DAPI染色，可显示出染色体的清晰带纹， 具有良好的可操作性。
图1、10X 100倍相差显微镜下采用2 _粗的根尖醋酸压片得到的花生根尖细胞有丝分裂中期染色体制片图。可看出，图中细胞不平整，染色体不在一个平面上，表明根尖如果较粗则不利于制片。图2、10X40倍相差显微镜下经盐酸解离的花生根尖细胞有丝分裂中期染色体制片图。可看出，图中的细胞粘连，染色体没有散开，染色体形态不好，表明用盐酸解离的效果不理想。图3、10X 100倍相差显微镜下不经酒精灯烤、醋酸解离的花生根尖细胞有丝分裂中期制片图。可看出，图中的染色体不分散。图4、10X 100倍相差显微镜下本发明方法的花生根尖细胞有丝分裂中期制片图。 可看出，图中染色体平整，分散，染色体形态较好。图5、10X 100倍荧光显微镜下观察到的花生栽培种、花生野生种经本发明方法制片后，用DAPI染色的染色体带型图。其中A、花生栽培种；B、A ipaensis ;C、A. duranensis ； D> A pus ilia ； E、A corren tina ;F、A stenophylla ;G、A monticola ;其中 B、C、D、E、F、G 均为花生野生种，是用拉丁文表示的。图6U0X100倍荧光显微镜下观察到的青豆、玉米、大豆、水稻、番茄、芝麻经本发明方法制片后，用DAPI染色的染色体带型图。其中a、青豆；b、玉米；c、大豆；d、水稻；e、番茄；f、芝麻。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，并不表示对本发明的任何限制。实施例I :根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法以花生栽培种为例，具体方法如下
(1)预处理用25°C清水浸泡花生种子I天，种子露白后，把种子放在湿润吸水纸上，保持吸水纸湿润，6-8天花生长出侧根,选取长10-15 mm、粗O. 8-1. 2 mm的新鲜侧根,用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理3h ；
(2)固定将处理后的侧根转移到卡诺氏固定液中，室温处理12h，然后放入-20°C的冰箱中待用。其中卡诺氏固定液的成分为酒精冰醋酸的体积比为3:1 ;
(3)醋酸压片取固定好的根尖，用浓度为45%(V/V)的醋酸浸泡30-60秒，待根尖膨胀饱满后，切取分生区根尖O. 3-0. 6 mm置于载玻片上，滴一滴45% (V/V)的醋酸，盖上盖玻片，调整根尖至盖玻片的正中位置，用双面刀片垫起盖玻片一角，用解剖针垂直在盖玻片中央敲击一下，再在盖玻片上根尖四周垂直敲击5-8次，使材料细胞分散，然后将载玻片放在酒精灯外焰火烤解离软化细胞壁，火烤时间以盖玻片上雾状散开为宜，用滤纸垫在盖玻片上吸去多余的醋酸液体，用拇指垂直向下压盖玻片，然后在相差显微镜下进行观察；结果见图4 ；
(4)冰冻揭片将包含10个以上处于有丝分裂中期、染色体平整、分散细胞的制片放置于_80°C的超低温冰箱中冰冻12小时，用双面刀片快速揭掉盖玻片，迅速将载玻片放入无水乙醇中对材料脱水24小时，吹干无水乙醇待用；
(5)DAPI染色分带将吹干的载玻片在I XPBS中浸泡10分钟，同时在995 μ L DAPI缓冲液中加入5 μ L DAPI母液(母液浓度O. lmg/ml)混匀，片子处理完毕后每片加500 μ L DAPI染液，染色2分钟，I XPBS冲洗4-5次，滴10 μ L VECTA shield胶液，盖上20 X 20 mm 盖玻片后，用滤纸吸去多余的胶液。在Leica DMRXA型荧光显微镜下用450 490 nm激发光波长观察，用Leica MPS 60的相机摄取图象。参见图5A。实施例中的试剂配方
IXPBS =NaCl 8 g，KCl O. 2 g, Na2HPO4 I. 44 g, KH2PO4 O. 24 g，双重蒸馏水定容至 1000 ml，调PH值到6. 8-6. 85，灭菌，常温保存。DAPI母液1 mg DAPI-2HC1溶解在10 ml灭菌双重蒸馏水中，4°C保存。DAPI缓冲液柠檬酸1.8 g, Na2HPO4 29. 45 g，双重蒸馏水定容至500 ml，4°C保存。实施例2 :根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法以番茄为例，具体方法如下
(I)将番茄种子置于吸水纸培养皿上，倒水浸泡种子I天，种子露白后倒掉清水，保持吸水纸湿润，待2-3天种子根长到10-15 mm后剪根，用对二氯苯饱和水溶液浸泡处理3小时。(2)将根转到酒精冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液中，室温处理24小时后，放入-20°C冰箱待制片用。(3)醋酸压片取固定好的根尖，用45% (V/V)醋酸浸泡30-60秒，根尖膨胀饱满后，切取分生区O. 3-0. 6 mm置于载玻片上，滴一滴45% (V/V)的醋酸，盖上盖玻片，调整根尖至盖玻片正中位置，用双面刀片垫起盖玻片一角，用解剖针垂直在盖玻片中央敲一下，再在盖玻片上根尖四周垂直敲5-8次，使材料细胞分散，然后将载玻片放在酒精灯外焰火烤解离软化细胞壁，火烤时间以盖玻片上雾状散开为宜，用滤纸垫在盖玻片上吸去多余的醋酸液体，用拇指垂直向下压盖玻片，然后在相差显微镜下进行观察。(4)冰冻揭片将包含10个以上处于有丝分裂中期、染色体平整、分散细胞的制片放置在-70°C超低温冰箱冰冻24小时，用双面刀片快速揭掉盖玻片，迅速将载玻片放入无水乙醇中对材料脱水12小时，吹干待用。(5) DAPI染色分带，将吹干的载玻片在I XPBS中浸泡10分钟，同时在995 μ L DAPI缓冲液中加入5 μ L DAPI母液(母液浓度O. I mg/ml)混匀，片子处理完毕后每片加 500 μ L DAPI染液，染色2分钟，用I XPBS冲洗4_5次，滴10 μ L VECTA shield胶液，盖上20 X 20 mm盖玻片后，用滤纸吸去多余的胶液。在Leica DMRXA型荧光显微镜下用450 490 nm激发光波长观察，用Leica MPS 60摄取图象。(参见图6e)
对照例3 :同实施例I基本相同，不同之处在于
选取粗2 mm的新鲜花生侧根的根尖替代例I中粗I mm的新鲜花生侧根的根尖，进行醋酸压片实验，其他条件相同，通过对比试验得到的花生根尖细胞中期染色体制片图(见图
I)。可见图中细胞不平整，染色体不在同一个平面上，表明选用的根尖太粗，不合适。对照例4 :同实施例I基本相同，不同之处在于
步骤(3)中改用盐酸解离，选取的盐酸质量浓度为lmol/L，其他条件相同，通过对比试验得到的花生中期分裂相的制片图(见图2)。可见图中细胞粘连，染色体不易散开，染色体形态不好，表明用盐酸解离的效果不理想。
权利要求
1.一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法，其特征是该方法包括以下步骤(1)预处理选取长10-15mm、粗O. 8-1. 2 mm的新鲜花生根尖，用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理；(2)固定将花生根尖放入卡诺氏固定液中，室温处理12-24h，放入-20°C冰箱中，待用；(3)醋酸压片取固定好的花生根尖，用体积浓度为45%的醋酸浸泡30-60秒，待根尖膨胀饱满后，切取分生区根尖O. 3-0. 6 mm置于载玻片上，滴一滴所述醋酸，盖上盖玻片，调整根尖至盖玻片正中位置，用双面刀片垫起盖玻片一角，用解剖针垂直在盖玻片中央敲击一下，再在盖玻片上根尖四周垂直敲击5-8次，使材料细胞分散，然后将载玻片放在酒精灯的外焰火烤解离软化细胞壁，火烤时间以盖玻片上雾状散开为宜，用滤纸垫在盖玻片上吸去多余醋酸，用拇指垂直向下压盖玻片，然后在相差显微镜下进行观察；(4)冰冻揭片将处于有丝分裂中期、染色体平整分散细胞的制片放置于-7(T-80°C 的超低温冰箱中冰冻12-24h，用双面刀片快速揭开盖玻片，将载玻片放入无水乙醇中脱水 12-24h，最后吹干无水乙醇，待用；(5)染色体染色分带或荧光原位杂交。
2.如权利要求I所述的制片方法，其特征是所述用对二氯苯饱和水溶液室温浸泡处理的时间为3h。
3.如权利要求I所述的制片方法，其特征是所述卡诺氏固定液的成分为酒精冰醋酸的体积比为3:1。
4.如权利要求I所述的制片方法，其特征是所述处于有丝分裂中期、染色体平整分散的细胞数目为10个以上。
5.如权利要求I所述的制片方法，其特征是所述染色分带是将吹干无水乙醇的载玻片在IXPBS中浸泡10分钟，同时在995μ L DAPI缓冲液中加入5 μ L浓度O. lmg/ml的DAPI 母液，混匀，处理完毕后每片加500 μ L DAPI染液，染色2分钟，用I XPBS冲洗4_5次，滴加胶液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余的胶液；在荧光显微镜下用450 490 nm激发光波长观察，摄取图象。
6.如权利要求I所述的制片方法，其特征是所述花生根尖细胞用芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄的根尖细胞来替代。
全文摘要
本发明涉及一种花生根尖细胞染色体有丝分裂中期的制片方法，包括选取花生根尖，用对二氯苯浸泡预处理；将根尖放入卡诺氏固定液中室温处理；用醋酸浸泡，切取分生区根尖置于载玻片上，在盖玻片中央敲击使细胞分散，火烤解离软化细胞壁，用滤纸吸去多余醋酸；将处于有丝分裂中期、染色体平整分散细胞的制片冰冻，揭开盖玻片，将载玻片脱水；染色分带或荧光原位杂交。本发明得到的制片细胞平整、染色体分散，且居分裂中期的细胞较多；用醋酸介质直接压片，试剂对染色体影响小，易于操作控制，步骤简单，制片效率高。不仅适用于花生，也适用于芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆或番茄等多种植物，具有良好的可操作性。
文档编号G01N1/28GK102589943SQ201210027178
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月8日 优先权日2012年2月8日
发明者张新友, 易明林, 杜培, 汤丰收, 董文召, 黄冰艳 申请人:河南省农业科学院