涡虫染色体标本的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种涡虫染色体标本的制备方法。本发明涡虫染色体标本制备方法包括以下步骤：取材、预处理、再生组织培养、组织破碎、离心悬浆、秋水仙素阻断、KC1低渗处理、离心悬浆滴片、染色以及烤干封片。本发明制备方法使再生组织和中期细胞得到充分固定处理，染色体制片背景清晰、细胞分散良好、中期分裂相多，利于核型分析。
【专利说明】涡虫染色体标本的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及一种涡虫染色体标本的制备方法。
【背景技术】
[0002]涡虫在我国分布广泛，在动物演化史上，涡虫是首次出现两侧对称、三胚层的类群，进化地位十分重要，是发育生物学、细胞遗传学和再生生物学研究的好材料。涡虫的染色体制备是对其进行遗传学研究的基础，也是细胞及分子生物学研究的基础。
[0003]现有成熟的动物染色体标本制备方法多适用于高等脊椎动物以及人类，可以采骨髓或血液处理后制备；而涡虫只有组织液，无脊髓和血液，取样处理困难。现有技术多采用李光鹏(《动物学杂志》1992,27 (5)，30-31)的方法，但其结果不稳定，制片不清晰，不利于研究分析，存在较大改进空间。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明提出一种涡虫染色体标本的制备方法，采用本发明方法能够得到稳定而清晰的涡虫染色体标本，方便对涡虫染色体进行研究。
[0005]本发明使用的技术方案是:
一种涡虫染色体标本的制备方法，包括以下步骤:
(1)取材及预处理:选取体长:T5cm活泼健康涡虫，置于去氯自来水中，饥饿f2周至无代谢废物排出；
(2)再生组织培养:将步骤(1)处理过的涡虫置于载玻片上，待其完全伸展时，用消毒过的刀片将涡虫切成3飞段，再置于1(T15°C恒温培养箱中无菌水培养3飞天，至断面有白色再生组织长出；
(3)组织破碎及秋水仙素处理:将步骤(2)得到的涡虫再生组织分离取下，置于离心管中破碎，然后加入0.2^0.25g/L的秋水仙素水溶液0.5^1.0mL, l(Tl5°C静置2.5^3.5小时，然后80(T1000rpm离心5~6分钟，弃去上清液；
(4)KC1低渗处理:步骤(3)处理后，加入0.1~0.2g/L KCl低渗液0.5~0.8mL (即KCl水溶液)，进行低渗处理1.5~2.5小时，然后80(T1000rpm离心5~6分钟，弃上清液；
(5)组织固定及滴片:加入固定液If 1.5mL，使再生组织与固定液充分接触后，静置18~25分钟，70(T800rpm离心5飞分钟，弃去上清；加入固定液II 1-?.5mL，使再生组织与固定液充分接触后，静置18~25分钟，70(T800rpm离心5飞分钟，弃去上清；加入固定液III1-1.5mL，使再生组织与固定液充分接触后，静置18~25分钟，70(T800rpm离心5飞分钟，弃去大部分上清，留下0.1-0.2mL液体，轻微震荡得到组织混悬液，吸取上述混悬液，从5飞cm高度悬滴于载玻片上，均匀涂满载玻片后，烘干或自然晾干；
(6)染色:将步骤(5)所得制片滴加Giemsa染色液f2mL，至其能布满载玻片，平放于通风橱中静置8~12分钟后，用蒸馏水轻柔洗去染液，再置于酒精灯火焰上方2~3cm高度处均匀烤干，即得到染色体片；(7)封片:在显微镜下初步观察所得染色体片后，标记后封片保存，即得；
所述固定液I由乙醇和冰乙酸以体积比4:1组成，固定液II由乙醇和冰乙酸以体积比2:1组成，固定液III由乙醇和冰乙酸以体积比1:4组成。
[0006]对于上述的制备方法，步骤(2)所述刀片经乙醇消毒。
[0007]对于上述的制备方法，步骤(3)所述离心管为1.5^2mL离心管。
[0008]对于上述的制备方法，步骤(5)所述再生组织与固定液充分接触的方式为摇动或超声波震荡。
[0009]对于上述的制备方法，所述Giemsa染色液为甘油含量为10~20wt%的Giemsa染色液。
[0010]本发明积极有益效果:
(1)本发明再生组织破碎后加秋水仙素可更加均匀充分的接触再生组织细胞，有利于增加中期细胞的比例；
(2)本发明相对现有技术，低渗处理的力度和时间都有加强；
(3)本发明使用 三个不同梯度固定液结合离心技术进行固定，能使再生组织和中期细胞得到充分固定；使用5飞cm高度距离滴片，细胞分散及破碎效果良好。
[0011]本发明再生组织和中期细胞得到充分固定处理，染色体制片背景清晰、细胞分散良好、中期分裂相多，利于核型分析。
[0012]【专利附图】
【附图说明】:
图1为由本发明方法制得的涡虫染色体标本在电子显微镜成像图。
[0013]【具体实施方式】:
下面将结合实施例对本发明的实施方式做进一步说明。
[0014]实施例1:
本实施例涡虫染色体标本的制备方法,所用试剂如下:固定液I由乙醇和冰乙酸以体积比4:1组成，固定液II由乙醇和冰乙酸以体积比2:1组成，固定液III由乙醇和冰乙酸以体积比1:4组成，Giemsa染色液为含甘油10wt%的Giemsa研磨溶液；
本实施例主要有以下步骤:
(1)取材及预处理:选取I条体长3cm活泼健康涡虫，置于去氯自来水中，饥饿I周至无代谢废物排出；
(2)再生组织培养:将步骤(1)处理过的涡虫置于载玻片上，待其完全伸展时，用经乙醇消毒过的刀片将涡虫切成3段后，置于10°C恒温培养箱中无菌水培养3天，断面有白色再生组织长出；
(3)组织破碎及秋水仙素处理:将步骤(2)得到的涡虫再生组织用洁净刀片小心取下，置于1.5mL离心管中，小剪刀针轻微破碎，然后加入0.2g/L的秋水仙素水溶液0.5mL, 10°C条件下静置2.5小时，然后SOOrpm离心6分钟，弃去上清液；
(4)KCl低渗处理:步骤(3)处理后加入0.2g/L KCl低渗液(即是KCl水溶液)0.5mL,进行低渗处理1.5小时后，800rpm离心6分钟,弃上清液；
(5)组织固定及滴片:加固定液IlmL，摇动离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置18分钟，700 rpm离心6分钟，弃去上清；加入固定液II ImL,摇动离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置18分钟，700rpm离心6分钟，弃去上清；加入固定液III lmL，摇动尚心管使再生组织与固定液充分接触后，静置20分钟,700rpm尚心6分钟,弃去大部分上清，留下0.1mL液体，轻微震荡得组织混悬液，吸取所述混悬液，从5cm高度悬滴于载玻片上，均匀涂满载玻片后，自然晾干；
(6)染色:将所得制片滴加Giemsa染色液lmL，前后左右略微倾斜至其布满载玻片，平放于通风橱中静置8分钟后，然后用蒸馏水轻柔洗去染液，再置于酒精灯上2cm高度均匀烤干，即得到染色体片；
(7)封片:在显微镜下观察所得染色体片后，标记封片保存，即得到中期分裂相多且染色体分散良好、背景清晰的制片，参见图1。
[0015]实施例2:
本实施例涡虫染色体标本的制备方法,所用试剂如下:固定液I由乙醇和冰乙酸以体积比4:1组成，固定液II由乙醇和冰乙酸以体积比2:1组成，固定液III由乙醇和冰乙酸以体积比1:4组成；
本实施例主要有以下步骤:
(1)取材及预处理:选取I条体长5cm活泼健康涡虫，置于去氯自来水中，饥饿2周至无代谢废物排出；
(2)再生组织培养:将步骤(I)处理过的涡虫置于载玻片上，待其完全伸展时，用经乙醇消毒过的刀片将涡虫切成5段后，置于15°C恒温培养箱中无菌水培养5天，断面有白色再生组织长出；
(3)组织破碎及秋水仙素处理:将步骤(2)得到的涡虫再生组织用洁净刀片小心取下，置于2.0mL离心管中，小剪刀针轻微破碎，然后加入0.25g/L的秋水仙素水溶液1.0mL, 15°C条件下静置3.5小时，然后IOOOrpm离心5分钟，弃去上清液；
(4)KCl低渗处理:步骤(3)处理后加入0.lg/L KCl低渗液(即是KCl水溶液)0.8mL,进行低渗处理2.5小时后，IOOOrpm离心5分钟，弃上清液；
(5)组织固定及滴片:加固定液I1.5mL，超声波震荡离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置25分钟，800rpm离心5分钟，弃去上清；加入固定液II 1.5mL，超声波震荡离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置25分钟，800rpm尚心5分钟,弃去上清；加入固定液III 1.5mL，超声波震荡离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置25分钟，800rpm离心5分钟，弃去大部分上清，留下0.2mL液体，轻微震荡得组织混悬液，吸取所述混悬液，从6cm高度悬滴于载玻片上,均匀涂满载玻片后，自然晾干；
(6)染色:将所得制片滴加Giemsa染色液2mL，前后左右略微倾斜至其布满载玻片，平放于通风橱中静置12分钟后，然后用蒸馏水轻柔洗去染液，再置于酒精灯上3cm高度均匀烤干，即得到染色体片；
(7)封片:在显微镜下观察所得染色体片后，标记封片保存，即得到中期分裂相多且染色体分散良好、背景清晰的制片。
[0016]实施例3:
本实施例涡虫染色体标本的制备方法,所用试剂如下:固定液I由乙醇和冰乙酸以体积比4:1组成，固定液II由乙醇和冰乙酸以体积比2:1组成，固定液III由乙醇和冰乙酸以体积比1:4组成，Giemsa染色液为含甘油20wt%的Giemsa研磨溶液；
本实施例主要有以下步骤: (1)取材及预处理:选取I条体长4cm活泼健康涡虫，置于去氯自来水中，饥饿10天至无代谢废物排出；
(2)再生组织培养:将步骤(I)处理过的涡虫置于载玻片上，待其完全伸展时，用经乙醇消毒过的刀片将涡虫切成4段后，置于12°C恒温培养箱中无菌水培养4天，断面有白色再生组织长出；
(3)组织破碎及秋水仙素处理:将步骤(2)得到的涡虫再生组织用洁净刀片小心取下，置于1.5mL离心管中，小剪刀针轻微破碎，然后加入0.2g/L的秋水仙素水溶液0.5mL, 15°C条件下静置3小时，然后900rpm离心5分钟，弃去上清液；
(4)KC1低渗处理:步骤(3)处理后加入0.15g/L KCl低渗液(即是KCl水溶液)0.6mL，进行低渗处理2小时后，900rpm离心6分钟,弃上清液；
(5)组织固定及滴片:加固定液IlmL，摇动离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置20分钟，800rpm离心6分钟，弃去上清；加入固定液II ImL,摇动离心管使再生组织与固定液充分接触后，静置20分钟，800rpm离心6分钟，弃去上清；加入固定液III lmL，摇动尚心管使再生组织与固定液充分接触后，静置20分钟,800rpm尚心6分钟,弃去大部分上清，留下0.15mL液体，轻微震荡得组织混悬液，吸取所述混悬液，从5.5cm高度悬滴于载玻片上,均匀涂满载玻片后，自然晾干；
(6)染色:将所得制片滴加Giemsa染色液1.5mL，前后左右略微倾斜至其布满载玻片，平放于通风橱中静置10分钟后，然后用蒸馏水轻柔洗去染液，再置于酒精灯上2.5cm高度均匀烤干，即得到染色体片；
(7)封片:在显微镜下观察所得染色体片后，标记封片保存，即得到中期分裂相多且染色体分散良好、背景清晰的制片。
[0017]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种涡虫染色体标本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取材及预处理:选取体长3飞Cm活泼健康涡虫，置于去氯自来水中，饥饿f2周，至无代谢废物排出； (2)再生组织培养:将经步骤(1)处理过的涡虫置于载玻片上，待其完全伸展时，用消毒过的刀片将涡虫切成3飞段，再置于无菌水中后放入1(T15°C的恒温培养箱培养3-5天，至断面有白色再生组织长出； (3)组织破碎及秋水仙素处理:将步骤(2)得到的涡虫再生组织分离取下，置于离心管中破碎，然后加入浓度为0.2^0.25g/L的秋水仙素水溶液0.5^1.0mL，于l(Tl5°C下静置2.5~3.5小时，然后放入离心机中以80(T1000rpm的转速离心5~6分钟，弃去上清液； (4)KC1低渗处理:步骤(3)处理后，加入浓度为0.1-0.2g/L的KCl低渗液0.5^0.8mL,进行低渗处理1.5~2.5小时，然后放入离心机中以80(T1000rpm的转速离心5~6分钟，弃去上清液； (5)组织固定及滴片:加入固定液I1- 1.5mL，使再生组织与固定液充分接触后，静置18~25分钟，以70(T800rpm的转速离心5~6分钟，弃去上清；加入固定液II 1-1.5mL,使再生组织与固定液充分接触后，静置18~25分钟，以70(T800rpm的转速离心5-6分钟，弃去上清；加入固定液III 1-1.5mL，使再生组织与固定液充分接触后，静置If 25分钟，再以700-800rpm的转速离心5-6分钟，弃去大部分上清，留下0.1-0.2mL液体，轻微震荡得到组织混悬液，吸取上述混悬液，从 5-6cm高度悬滴于载玻片上,均匀涂满载玻片后，烘干或自然晾干； (6)染色:将步骤(5)所得制片滴加Giemsa染色液f2mL，至其能布满载玻片，平放于通风橱中静置8~12分钟后，用蒸馏水轻柔洗去染液，再置于酒精灯火焰上方2~3cm高度处均匀烤干，即得到染色体片； (7)封片:在显微镜下初步观察所得染色体片，标记后封片保存，即得； 所述固定液I由乙醇和冰乙酸以体积比4:1组成，固定液II由乙醇和冰乙酸以体积比2:1组成，固定液III由乙醇和冰乙酸以体积比1:4组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述刀片经乙醇消毒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述离心管为1.5~2mL离心管。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(5)所述再生组织与固定液充分接触的方式为摇动或超声波震荡。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述Giemsa染色液为甘油含量为10~20wt%的Giemsa染色液。
【文档编号】G01N1/30GK103983497SQ201410257817
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】马克世, 盛东峰, 武安泉, 王永立, 杨同文, 陈龙 申请人:周口师范学院