专利名称：一种虾类生殖细胞染色体的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种虾类生殖细胞染色体的制备方法。
背景技术：
把生物工程的新技术用于虾类的遗传育种与品种改良，是水产养殖上的一个发展方向。经对现有技术的文献检索发现，传统的染色体压片技术所制的染色体标本，破坏了染色体的结构，无法进行更高层次的染色体实验，并且实验初期的掀片过程会损失大量的分裂相染色体，不利于后续实验的开展。钱国英，汪财生等在《实验生物学报》2005年，第38卷第5期，456-460页发表的《日本沼虾染色体制备的比较研究》一文中比较了低渗法与管渗法2种制片技术:低渗法获得的性腺染色体标本，双线期二价体居多，形态清晰，着丝点位置易分辨；管渗法制备的性腺染色体，分散程度不大，镜检困难。低渗法制备的胚胎材料，背景深，分裂相不易找，形态不易观察；管渗法制备的胚胎染色体中期分裂相多，背景浅，分散好，形态清晰，易于观察及后续实验。两种方法都存在一定的缺陷，对材料的要求较高。因此，需要一种操作简单、镜检效果好的虾类生殖细胞染色体制片法以满足虾、蟹研究的快速发展。中国专利文献CN101974627A公开了一种鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法，是取活体成熟卵巢并用生理盐水清洗；将卵巢置于含有I μ g/mi雌激素的生理盐水中且将卵巢切成小段，置于摇床上室温避光培养I 3h ;在培养皿底部涂一层1%琼脂并盛入4%冰醋酸溶液，从所培养的卵巢中取出几粒卵放入4%冰醋酸溶液中，待卵核移动到动物极后将卵核剥离出来，再将卵核周围的卵黄剥掉，将卵核放入装有预冷的卡诺固定液中冷冻过夜，所述卡诺固定液是由甲醇和冰醋酸混合而成，甲醇与冰醋酸的体积比为3:1 ;再取出冷冻过夜的3 5粒卵核于载玻片上放置10 20秒；然后再将载有卵核的载玻片放入装有染色剂的染缸中避光染色30 45min，纯水避光浸泡载玻片30min后，将盖玻片盖在载玻片上。中国专利文献CN 1828296A公开了一种码絹金龟精巢染色体制作观察方法，属于生物技术领域。本发明的技术方案是以码絹金龟(Maladera sp.)成虫精巢细胞为材料，将金龟子精巢用秋水仙素预处理6 14h，经0.4%KC1溶液低渗30min，甲醇:冰醋酸(3:1)固定30 60min,用Giemsa染色10 20min后,获得的精巢细胞染色体形态清晰,分散性较好。但是关于一种操作简单、镜检效果好的虾类生殖细胞染色体的制备方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种虾类生殖细胞染色体的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种虾类生殖细胞染色体的制备方法，包括以下步骤:秋水仙素培养精巢/卵巢；KC1低渗处理，卡诺氏固定液预固定；后固定液固定，所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸；分散精母/卵母细胞，制成细胞悬液；Giemsa磷酸盐缓冲液染色；Motic显微镜下镜检。包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾，沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，摘取精巢/卵巢，放于培养皿
内；
(2)将精巢/卵巢用秋水仙素恒温培养，去净秋水仙素；
(3)KC1室温下低渗处理，移去低渗液，随即用卡诺氏固定液混匀进行预固定，所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸；
(4)更换两次卡诺氏固定液,再用后固定液固定一次,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸；
(5)吸弃但不吸干固定液，沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜，使精母/卵母细胞解离分散，制成细胞悬液；
(6)细胞悬液滴在载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，干燥后用Giemsa磷酸盐缓冲液染色，磷酸盐缓冲液冲去染液；
(7)干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。所述的步骤(2)中将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱中恒温培养4h。所述的步骤(3)中0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min。所述的步骤(4)中间隔Ih更换卡诺氏固定液一次，共更换两次。所述的步骤(4)中采用后固定液固定一次,20min。所述的步骤(6)中采用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,其中Giemsa磷酸盐缓冲液中Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20, Giemsa磷酸盐缓冲液 PH7.2。一种虾类生殖细胞染色体的制备方法，包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾，沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，避开心脏，摘取精巢/卵巢，放于培养皿内；
(2)将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱恒温培养4h，去净秋水仙素；
(3)0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min，小心移去低渗液，随即用预冷至4度的卡诺氏固定液混匀进行预固定，所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸；
(4)卡诺氏固定液4度固定间隔Ih更换固定液一次,共更换两次,再用预冷至4度的后固定液固定I次，20min,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸；
(5)吸弃但不吸干固定液，小心沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜，用吸管轻轻吹打，使精母/卵母细胞解离分散，制成细胞悬液；
(6)细胞悬液滴在预冷的载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，在酒精灯火焰上微烤，干燥后用体积浓度为15%、pH7.2的Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min，磷酸盐缓冲液慢慢冲去染液；
(7)空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。本发明优点在于:
1、操作简单高效，缩短样本获得时间，能够批量制作染色体玻片，可以保证各处理组的同步取样同步制片；可以快速简便的获得足够的染色体样本，获得的样本分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高；也可以应用到其它虾的染色体标本的制备，为虾类染色体制备提供了一种简便易行的方法；
2、采用无毒的固定液，减少对制片操作者的伤害；
3、与传统染色体制片法相比，增加后固定，更利于细胞膨胀染色体铺散；
4、既避免石蜡切片法引起的染色体丢失或形态损坏，又克服压片法在染色体数目多的情况下容易重叠的缺陷。
附图1是克氏原螯虾精母细胞染色体40倍镜检。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1精巢生殖细胞染色体的制备
1.选取个体活泼的雄性克氏原螯虾，重量在35 40g左右，小心沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，避开心脏，摘取心脏下两肝区间白色肾形的精巢，放于培养皿内。2.将精巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱恒温培养4h，后去净秋水仙素。3.0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min，小心移去低渗液，随即用预冷至4度的卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)混匀进行预固定。4.卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)4度固定间隔Ih更换固定液一次,共更换2次，再用预冷至4度的后固定液(无水乙醇:冰乙酸=1:1)固定I次，20min。5.吸弃固定液(不吸干)小心沿精巢纵轴剪开外膜，用吸管轻轻吹打，使精母细胞解离分散，制成细胞悬液。6.细胞悬液滴在预冷的载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，在酒精灯火焰上微烤，干燥后用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2，Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20)染色30min，磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2)慢慢冲去染液。7.空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察，选择染色体分散较好、形态清晰、数目完整的精母细胞进行显微照相，以便进行核型分析。镜检效果:请参见附图1，附图1是克氏原螯虾精母细胞染色体40倍镜检照片，在40倍显微镜的情况下，有40.7%的细胞分裂相，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜，这些细胞位置分布较为均匀。经计数，克氏原螯奸染色体2η=94。实施例2卵巢生殖细胞染色体的制备
1.选取个体活泼的雌性克氏原螯虾，重量在35 40g左右，小心沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，避开心脏，摘取心脏下黄色Y形的卵巢，放于培养皿内。2.将卵巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱恒温培养4h，后去净秋水仙素。3.0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min，小心移去低渗液，随即用预冷至4度的卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)混匀进行预固定。4.卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)4度固定间隔Ih更换固定液一次,共更换2次，再用预冷至4度的后固定液(无水乙醇:冰乙酸=1:1)固定I次，20min。5.吸弃固定液(不吸干)小心沿卵巢纵轴剪开外膜，用吸管轻轻吹打，使卵母细胞解离分散，制成细胞悬液。6.细胞悬液滴在预冷的载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，在酒精灯火焰上微烤，干燥后用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2，Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20)染色30min，磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2)慢慢冲去染液。7.空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察，选择染色体分散较好、形态清晰、数目完整的卵母细胞进行显微照相，以便进行核型分析。本发明的优点:
1.本发明在取样方法上不要剥去组织外的物质，操作简单高效，缩短样本获得时间，并且能够批量制作染色体玻片，可以保证各处理组的同步取样同步制片。2.本发明可以快速简便的获得足够的染色体样本，获得的样本分散均匀，背景浅，易于观察，可直接通过光学显微镜观察。得出的染色体数目准确度高。3.本发明适当改进或不作改进，也可以应用到其它虾的染色体标本的制备，为虾类染色体制备提供了 一种简便易行的方法。4.应用本发明方法获得的染色体样本可以用于染色体分析、染色体原位杂交、染色体涂染等与染色体研究有关的染色体标本的制作。5.本发明固定液采用的是乙醇:冰乙酸(体积比3:1)，传统固定液采用的是甲醇、三氯甲烷，甲醇与三氯甲烷均有毒，对制片操作者伤害很大，采用乙醇代替，可减少伤害。6.本发明方法与传统染色体制片法相比，增加后固定，后固定液配方为乙醇:冰乙酸(体积比1:1)，冰乙酸百分比与前固定液相比增加，更利于细胞膨胀染色体铺散。7.使用本发明方法，既避免石蜡切片法引起的染色体丢失或形态损坏，又克服压片法在染色体数目多的情况下容易重叠的缺陷。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种虾类生殖细胞染色体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:秋水仙素培养精巢/卵巢；KC1低渗处理,卡诺氏固定液预固定；后固定液固定，所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸；分散精母/卵母细胞，制成细胞悬液；Giemsa磷酸盐缓冲液染色；Motic显微镜下镜检。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选取雄性/雌性虾，沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，摘取精巢/卵巢，放于培养皿 内； (2)将精巢/卵巢用秋水仙素恒温培养，去净秋水仙素； (3)KC1室温下低渗处理，移去低渗液，随即用卡诺氏固定液混匀进行预固定，所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸； (4)更换两次卡诺氏固定液,再用后固定液固定一次,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸； (5)吸弃但不吸干固定液，沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜，使精母/卵母细胞解离分散，制成细胞悬液； (6)细胞悬液滴在载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，干燥后用Giemsa磷酸盐缓冲液染色，磷酸盐缓冲液冲去染液； (7)干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱中恒温培养4h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中间隔Ih更换卡诺氏固定液一次，共更换两次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中采用后固定液固定一次，20min。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中采用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,其中Giemsa磷酸盐缓冲液中Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20，Giemsa磷酸盐缓冲液pH7.2。
8.一种虾类生殖细胞染色体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选取雄性/雌性虾，沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲，避开心脏，摘取精巢/卵巢，放于培养皿内； (2)将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16°C生化培养箱恒温培养4h，去净秋水仙素； (3)0.lmol/L KCl室温下低渗处理30min，小心移去低渗液，随即用预冷至4度的卡诺氏固定液混匀进行预固定，所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸； (4)卡诺氏固定液4度固定间隔Ih更换固定液一次,共更换两次,再用预冷至4度的后固定液固定I次，20min,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸； (5)吸弃但不吸干固定液，小心沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜，用吸管轻轻吹打，使精母/卵母细胞解离分散，制成细胞悬液； (6)细胞悬液滴在预冷的载玻片上，并轻轻吹动使细胞散开，在酒精灯火焰上微烤，干燥后用体积浓度为15%、pH7.2的Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min，磷酸盐缓冲液慢慢冲去染液； (7) 空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
全文摘要
本发明涉及一种虾类生殖细胞染色体的制备方法，包括以下步骤秋水仙素培养精巢/卵巢；KCl低渗处理，卡诺氏固定液预固定；后固定液固定，所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸；分散精母/卵母细胞，制成细胞悬液；Giemsa磷酸盐缓冲液染色；Motic显微镜下镜检。本发明优点在于操作简单高效，能够批量制作染色体玻片；可以快速简便的获得足够的染色体样本，获得的样本分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高；为虾类染色体制备提供了一种简便易行的方法；采用无毒的固定液，减少对制片操作者的伤害。
文档编号G01N1/28GK103091140SQ201310000488
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者魏华, 沙晓姣, 陈阿琴 申请人:上海海洋大学