一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种适合体外基因叠加的载体及其应用。
【背景技术】
[0002]随着转基因技术的不断发展，含有多个转基因性状的转基因作物已成为未来发展的主流方向。当下，将多个转基因性状叠加到农作物品种中主要有四种方法:1，通过对含有不同转基因性状的的株系进行遗传杂交，从而将多个转基因性状聚合到同一株系中。2，通过对已有的转基因品种进行再转化(re-transformat1n)而将多个新的转基因性状整合到同一品种中。该方法中新的转基因性状是以随机的方式整合到植物染色体当中。3，通过位点特异性重组或者同源重组将多个转基因性状定点整合到已有的转基因座位上。4，将所有的转基因性状，通过打包的方式(体外基因叠加)以一段DNA的形式重新转化到植物基因组当中。
[0003]以上四种方法中，方法I和方法2会随着转基因数目的上升而增多可分离的转基因座位数。可分离的转基因座位的增加会对下游的育种工作带来不便。因为转基因育种过程中，不仅需要获得含有纯合转基因性状的株系，与此同时植物品种本身内在的优良性状也要保持纯合状态。因此对于二倍体植物或者遗传上类似于二倍的的多倍体植物，当含有三个不连锁的转基因性状时，获得纯合个体的概率为O3。若此时增加7个品种本身具有的、内在的优良性状，则获得具有纯合转基因性状和内在优良性状的株系的概率为O'这需要育种学家在至少大于1000000的后代植株中寻找唯一的一株纯合个体。相比较于方法I和方法2，方法3随着转基因性状的增加，可分离的转基因座位不会增多，因此更受转基因育种者的青睐。在方法4中，若转基因性状全部为新的的基因，则该方法较为理想。若旧的转基因性状已获得监管部门批准，再次将旧的转基因性状与新的转基因性状打包并转化到基因组另外位置上，这虽然降低了可分离的转基因座位，但是之前通过监管部门认证的旧性状很可能会需要再次接受监管部门的重新审查。
[0004]将多个基因打包到同一个DNA载体上(体外基因叠加)有很多较为流行的方法:1，通过传统的酶切链接完成。2，运用 sequence and ligat1n-1nd印endent cloning (SLIC)03，运用Gateway cloning。4，基于Cre-Λλ?重组系统的多基因叠加。
[0005]方法I会随着需要操作的DNA片段的增多而难以找到可用的限制性内切酶酶切位点，因此，不适合于多基因的体外叠加。方法2运用的同源重组和DNA单链退火技术。SLIC首先将含有5’同源序列的DNA用DNA外切酶处理，然后不同的DNA片段通过单链退火而形成一个带有缺口的瞬时环形DNA。之后将带有缺口的环形DNA转化到大肠杆菌中。大肠杆菌通过自身的DNA修复机制将瞬时环形DNA的缺口补平，从而完成链接。该方法可以一次链接多个DNA片段。方法3是基于λ位点特异性重组系统。λ位点特异性重组系统有两个序列不同的重组位点aiiiS和且成。在λ整合酶(integrase)和整合宿主因子(integrat1n host factor)的作用下，和间发生重组，从而生成两个子位点attL$\ attRo而aiiZ和aiiTi位点在λ整合酶、整合宿主因子和删除酶(excis1nase)的作用下重组，形成attB和attP。而Gateway技术运用开发了来源于a?战(? aii/的的突变位点:a?价和attPl, attB2$\ attP2。不同序号的位点之间不会发生重组反应。因此一段被<3?价和a?故狭在中间的DNA可以通过attB I a?/重组转移到含有aii/5/和attP2的载体上，同理，位于aiiZl和位于aiiZi之间的DNA可以通过attL x aiiT?重组反应转移到含有和的载体上。然而该方法受限于可用的突变的重组位点的数目。目前只研发出了 4对突变的重组位点。方法4运用了 Cre-hx位点特异性重组系统。其中Cre是重组酶，hx是它的识别位点。该体外基因叠加方法由一个含有1x位点的，基于可转化人工染色体的双元载体，和两个含有1x位点的供给载体组成。因此位于供给载体内的目的基因可通过Cre-1ox重组而共整合到双元在体内，之后不需要的DNA序列可以通过归巢核酸内切酶切除掉。因此两种归巢核酸内切酶1-SceI和P1-SceI就可以满足循环式体外基因置加。
[0006]如背景介绍第二段方法4所述，若体外叠加的基因全部为新基因，则将它们打包在一起转化是一个可取的方案，并且第三段中提到的体外基因叠加方法均可实施。然而，若将含有已通过审查部门认定的旧基因与新基因一起重新体外叠加再转化，则会增加额外的审查费用与时间。理想的方案为:若有旧的转基因性状，无需对其进行更多的修饰，只需将新的转基因进行体外叠加，然后定点整合到旧基因座位上。这样不仅旧转基因性状不需要再次经过审查部门的认证，并且还可以降低可分离的转基因座位。若无旧的转基因性状，则体外叠加的新基因可以直接通过传统方法转化到异源生物基因组中。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种体外定点基因叠加系统。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述基因叠加系统的应用。
[0009]本发明所采取的技术方案是:
一种体外基因叠加系统，该系统含有3个载体，即载体A、B、C ;
所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点Al和A2，Al与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点Al的另一端连有可逆的重组位点A’ ；
所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有BI，BI的另一端连有可逆的重组位点B’ ；
所述载体C中含有3个不可逆重组位点Cl、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有Cl，Cl的另一端连有可逆的重组位点C’ ；
所述Al、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-1 ;
所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-2 ;
所述A2、B1和Cl为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-3 ;
所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1与SEQ-2之间能够发生不可逆的位点特异性重组；
所述A’、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组；
当B3与Al位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB-;
当载体AB-中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC-;
再将载体ABC-与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC-的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。
[0010]进一步的，上述体外基因叠加系统还含有载体PZH36D，载体PZH36D为PZH36在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体PZH36内同向的1x位点间发生重组，删除同向1x位点间的碱基序列，即可获得载体PZH36D。
[0011]进一步的，上述位点A1、C2 和 C3 为 phiC31、TP901-l、λ ,BxbUphiBTl 或 TGl 不可逆重组系统中的其中一个重组位点，位点Β2和Β3则为能与A1、C2或C3产生不可逆重组的重组位点。
[0012]进一步的，上述位点A2、BI 和 Cl 为 phiC31、TP901-l、λ ,BxbUphiBTl 或 TGl 不可逆重组系统中的其中一个重组位点。
[0013]进一步的，根据位点Α2、Β1和Cl的具体重组位点，载体pZH36D中的Bxbl attP重组位点还可以换成能与A2、BI和Cl发生DNA整合的不可逆重组的重组位点。
[0014]进一步的，上述载体A中还含有筛选标记基因和复制起始位点。
[0015]进一步的，上述载体B、C中均还含筛选标记基因。
[0016]—种体外基因叠加系统的应用，所用的系统为上述所述的体外基因叠加系统，具体应用方法包括以下步骤:
1)将需要叠加的基因分别装入载体A、B、C中的外源目的基因插入区域；
2)将带有目的基因的载体A和B在对应重组酶的作用下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B3与位点Al发生重组的产物载体AB，即实现了 2个基因的叠加；
3)将载体AB在对应重组酶的作用下使可逆重组位点A’和B’发生切除重组，即将位点A’和B’间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得产物载体记为AB-;
4)将载体AB-与带有目的基因的C载体在对应重组酶的作用下使下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B2与位点C3发生重组的产物载体ABC，即实现了 3个基因的叠加；
5)同步骤3)使载体ABC中的2个可逆重组位点发生切除重组，得产物载体ABC-；
6)根据所需叠加基因的数量，交叉循环利用载体B和C依次将每个基因叠加到载体ABC-中，操作方法同上述步骤2)?5);即可获得含多个目的基因的载体；
7)将上步所得的多基因载体中所含目的基因转入对应宿主体内。
[0017]进一步的，上述当步骤7)中所述的宿主为植物时，步骤7)的具体操作为:将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或