治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义dna序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的反义DNA序列及其应用。所述单链反义DNA序列是以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因部分序列作为靶点，设计并合成的20nt的反义DNA，不带有其他化学修饰。采用脂质体介导法转染猴肾上皮Marc-145细胞，能够显著抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖，通过荧光定量RT-PCR方法和间接免疫荧光实验方法检测，发现该反义DNA序列具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用。因此本发明的反义DNA序列在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的治疗和控制中具有广泛的应用前景，对基因治疗猪繁殖与呼吸综合征具有重要价值，所述反义DNA序列来源容易，成本低廉，具有极大的市场价值。
【专利说明】治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的应用，特别是治疗和预防 猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用。 技术背景
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS)，又名蓝耳病，是世界范围内给养猪业造成巨大经济损失的重要传染病之一，由于 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus， PRRSV)存在较大的遗传变异性，时常发生由于疫苗接种失败而使PRRSV再次成为原发性病 原，给该病的预防和治疗带来很大困难。因此，如何有效地控制该病的流行是目前研究者和 生产者面临的严峻挑战和重大课题。高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控制措施研究中 的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致病的分子机制 的深入认识，使得疫苗研究处于一个瓶颈时期，因此有必要建立另外一种新的抗病毒策略。
[0003] 反义核酸（antisense oligonuleotides, AS-〇Ns)是指与革EDNA 或RNA喊基互补， 并能与之结合的一段DNA或RNA，一般AS-〇Ns长度为15?20碱基。1967年，Belikova等 提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表达的设想。1978年，Paul等利用一段 反义DNA寡聚核苷酸链成功地抑制了 Rous肉瘤病毒的复制，引起人们极大地关注。20世纪 80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，使反义核酸的研究迅速发展起来。目前，反义核酸 技术作为一种有效的研究手段正被广泛地应用于功能基因组学和药物研发。
[0004] 目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。其机制 为：（1)在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA结合，从复制与转录水平发挥反义阻止作 用，这种反义技术称为"反基因治疗"(Anti-gene therapy) ; (2)与mRNA的5'末端的SD序 列或核糖体结合位点结合，或与mRNA的SD序列上游的非编码区结合，改变mRNA的二级结 构，阻碍核糖体的结合，从而阻碍翻译；（3)作用于mRNA的poly A形成位点，阻止成熟和 转运；(4)作用于mRNA的5'末端，阻止帽子结构的形成；反义核酸与靶序列结合后激活某 些酶如RNAse H，将靶序列降解。一种反义核酸究竟通过何种途径发挥抑制功能，取决于反 义寡核苷酸的种类是DNA还是RNA，以及是否经过修饰等具体情况。
[0005] 鉴于PRRS对养猪业造成的严重危害，而以疫苗预防接种为主的防制措施存在着 种种不足：如由于弱毒疫苗接种导致该病的爆发，在接种灭活疫苗猪群中爆发非典型PRRS 流行等，使得人们对疫苗使用的安全性和效率提出了疑问。特异、高效的抗病毒药物在控制 PRRS中的应用必然是全面控制PRRSV措施的一个良好补充。基于反义核酸在医学研究领域 中的良好应用前景以及控制PRRS流行的紧迫性，特提出本项目研究的立项依据。本发明将 针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5'-非编码区，NSP9和0RF7基因的正、负链序列，运用计 算机软件设计反义寡核苷酸以靶细胞的体外培养为模型，旨在开发一种新的抗猪繁殖与呼 吸综合征病毒的药物，并为最终应用于临床兽医领域奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及 其应用。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0008] 1、用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列，其序列为下列序列中的 任意一个或组合使用：
[0009] YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3'
[0010] YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3，
[0011] YN-8:5，-TGCAGCATCCTCACAACCGT-3，
[0012] 2、本发明采用化学合成的反义DNA序列。
[0013] 3、本发明针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5' -UTR，0RF5和NSP9基因的正、负链序 列，设计多条反义DNA序列。通过显微镜观察不同处理组病毒所致细胞CPE的变化、荧光定 量RT-PCR方法和间接免疫荧光等方法，从病毒mRNA和病毒蛋白水平，评价筛选所设计的反 义DNA对PRRSV流行毒株增殖的影响。试验结果表明，本发明筛选出的反义DNA序列可抑 制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖；反义DNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的可 能作用机制在于：在分子水平上，反义DNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA基因的表达， 从而抑制病毒蛋白增殖与感染。
[0014] 本发明具有下述优点：
[0015] 1.目前尚无治疗PRRSV感染的特效药物，高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控 制措施研究中的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致 病分子机制的深入认识，使得疫苗研究处于了一个瓶颈时期，因此，寻找新的抗病毒策略， 已成为目前猪蓝耳防制研究中的热点。反义DNA具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核 蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用，体外细胞药效实验显示具有确切的抗病毒效果。
[0016] 2.本发明是关于用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列。反义DNA 序列可为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪只提供新的治疗药物，具有剂量适中，费用适 中，用药方便，疗效显著，毒副作用小等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1本发明的反义DNA片段所针对PRRSV基因位点作用示意图。
[0018] 图2本发明的反义DNA片段抑制PRRSV在Marc-145细胞增殖效果示意图。
[0019] 图3本发明的反义DNA片段抑制PRRSV mRNA基因表达抑制示意图。
[0020] 图4本发明的反义DNA片段抑制PRRSV核蛋白表达示意图。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图1-4,用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不 以此来限定本发明。
[0022] 以下实施例中所使用的技术，包括基因测序、合成、细胞转染等分子生物学技术， 以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使 用的仪器设备、试剂、细胞系等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员 通过公共途径获得。
[0023] 实施例1 :反义DNA的设计
[0024] 反义DNA的设计策略：1)完整地预测mRNA的主要二级结构和次要二级结构，这些 结构预测主要遵循自由能最小，不在折叠区。尽可能地找到单链区域、如果单链区域的长度 不够，两端可以延伸到双链区域；2)反义核酸的长度要求20nt。一般选用起始密码子（AUG) 或其附近的20个碱基序列，或是在mRNA的两端，或是颈环结构，尽可能在单链区域；3)尽 量含有CCAC，TCCC，ACTC，GCCA或CTCT碱基，这些碱基有助于增强反义核酸作用；4) CG含量 也有助于反义核酸发挥作用，控制G+C含量在40%至60%之间；5)选择RNA二级结构中不 稳定的部位作为靶点，从而使反义核酸与靶位点牢固结合。根据PRRSV毒株参照序列与运 用DNAStar Lasergene 7. 1在NCBI上下载尽可能找到的（>100条）PRRSV毒株的5' -UTR 端、0RF5、NSP9等基因进行分析，找出共有保守区，以保守区域正链和负链为靶序列，然后 使用RNA二级结构分析软件RNAStructure 5. 3对PRRSV流行毒株的5' -UTR、0RF5、NSP9 三个区域进行二级结构预测及 Overall Δ G37. 0、Break targ. Δ G37. 0、Duplex Δ G37. 0、 oligo-self AG37. 0、oligo-oligo AG37. 0等重要参数分析，在此基础上设计了反义DNA, 送上海生工合成，合成的DNA均经HPLC纯化。反义DNA分别为：
[0025] YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3'
[0026] YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3，
[0027] YN-8:5 ' -TGCAGCATCCTCACAACCGT-3 '
[0028] 2、使用的阴性及阳性对照序列分别为：
[0029] 阴性对照：
[0030] CP1 :5' -GATATACACAACACCCAATT-3'
[0031] 阳性对照：
[0032] 5UP2 :5, -CGTGGCATAGAGCCAACACC-3'
[0033] 3、图1为本发明的反义DNA片段所针对病毒基因位点作用示意图，其中YN-2和 YN-3针对PRRSV的0RF5基因，YN-8针对PRRSV的NSP9基因，阳性对照5UP2针对PRRSV的 5-UP2区域。
[0034] 实施例2 :反义DNA抑制病毒致细胞病变效应
[0035] 1、将生长良好的Marc-145细胞，用0. 25 %的猪胰蛋白酶消化后，计数，然后 1 X 104cells/孔，每孔100 μ 1，加到96孔培养板中，置于二氧化碳培养箱中待细胞长至单 层，待用。将各个实验组的反义DNA在最大无毒剂量范围（<40μΜ)内，即采取32μΜ的 反义DNA，接种25个TCID50/孔的ΥΝ-1株蓝耳病病毒，病毒孵育1. 5h后将反义DNA利用 Lipofectamine?2000转染到Marc-145细胞中，4h后换成正常培养基，在37°C，5% C02培 养箱中培养，连续培养60h，逐日观察各实验组中细胞病变程度，并与正常细胞对照组和病 毒对照组比较。
[0036] 2、结果如图2所示，将多种反义DNA及阳性、阴性对照反义DNA序列转染入已接种 PRRSV的Marc-145细胞中，连续培养60h，可见YN-2、YN-3和YN-8能够显著地抑制PRRSV 致细胞CPE。
[0037] 实施例3 :反义DNA抑制PPRSV mRNA表达水平分析
[0038] 1、将生长良好的Marc-145细胞，用0.25%的猪胰蛋白酶消化后，计数，然后按照 1 X 104个细胞每孔的密度进行培养，每孔100 μ 1，加到96孔培养板中，置于二氧化碳培养 箱中待细胞长至单层，待用。采用25个TCID5(/孔的ΥΝ-1株蓝耳病病毒接种细胞，病毒孵 育1.511后将32 4 1的各个实验组反义0嫩（无毒剂量范围内）利用1^?(^6(^&1^116"12000 转染到Marc-145细胞中，4h后换成5%的DMEM完全培养基，37°C，5% C02培养箱中连续培 养60h收取细胞，提取RNA，然后反转录成cDNA，最后采用实时荧光定量PCR的方法检测不 同浓度反义DNA对PRRSV ORF7和5'-UTR基因 mRNA表达水平的影响，数据结果根据Pfaff 1 法使用数据分析软件SPSS 11.0进行统计分析。
[0039] 2、结果如图3所示，将多种反义DNA及阳性、阴性对照反义DNA序列转染入已接种 PRRSV的Marc-145细胞中，连续培养60h，可见YN-2、YN-3和YN-8能够显著的抑制PRRSV mRNA的表达。
[0040] 实施例4 :反义DNA抑制PRRSV病毒蛋白增殖效果的检测
[0041] 1、将生长良好的Marc-145细胞，用0.25%的猪胰蛋白酶消化后，计数，然后按照 1 X 104个细胞每孔的密度进行培养，每孔100 μ 1，加到96孔培养板中，置于二氧化碳培养 箱中待细胞长至单层，待用。之后接种病毒：采用25个TCID5(/孔的ΥΝ-1株蓝耳病病毒接 种细胞，病毒孵育1. 5h后将32 μ Μ的各个实验组反义DNA采用Lip〇fectamineTM2000转染 到Marc-145细胞中，4h后换成5%的DMEM完全培养基。
[0042] 2、连续培养60h后进行间接免疫实验，具体步骤如下：
[0043] 1)用37°C预温的0. 05M/PBS (pH7. 4)漂洗细胞3遍（每次浸泡2min);向96孔中 缓慢加入1〇〇μ 1预冷的2%多聚甲醛，放入4°C冰箱中固定20-30min。
[0044] 2)固定结束后用冷的0· 05M/PBS(pH7. 4)漂洗3遍（每次浸泡2min)，然后自然 干燥；经上面步骤清洗过后，采用含0. 3% Triton X-100的PBS穿透15min，之后用冷的 0· 05M/PBS (ρΗ7· 4)漂洗3遍（每次浸泡2min)，然后自然干燥；
[0045] 3)用1 %的脱脂奶粉封闭：（96孔板中进行，PBS (pH7. 4)来配制1 %的脱脂奶粉） 每孔加入1 %的脱脂奶粉，把96孔全部浸泡即可，4°C封闭2h ;然后加入一抗处理。在96孔 中滴加终浓度为5 μ g/mL a -PRRSV -抗，每孔50 μ 1，4°C过夜，清洗、晾干，吸去一抗，用PBS 漂洗3次（每次浸泡5min)，自然干燥；
[0046] 4)在96孔中上滴加 FITC标记的羊抗鼠二抗60μ 1(浓度为5ug/mL)，37°C感作lh ; 吸取二抗后用的1 XPBS漂洗3次（每次浸泡5min)，最后在避光的条件下快速加入二抗。
[0047] 5)二抗处理完之后，每孔加入DAPI 50μ 1/孔，室温lOmiruPBS洗3遍，每次5min。 突光显微镜下观察。
[0048] 3、将多种反义DNA及阳性、阴性对照反义DNA序列转染入已接种PRRSV的 Marc-145细胞中，连续培养60h，可见YN-2、YN-3和YN-8能够显著的抑制PRRSV核蛋白的 表达，结果如图4所示。
【权利要求】
1. 一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列，其特征在于，核酸序列为下 列序列中的任意一个或组合使用： YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3' YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3， YN-8 :5' -TGCAGCATCCTCACAACCGT-3'。
2. -种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列的应用，其特征在于，所述核 酸序列可特异性地与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的特定靶序列结合。
3. 根据权利要求2所述的治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列的应用，其 特征在于，所述核酸序列用于制备治疗和/或预防猪繁殖与呼吸综合征的药物。
4. 根据权利要求3所述的治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列的应用，其 特征在于，所述治疗和/或预防繁殖与呼吸综合征的药物为抑制预防繁殖与呼吸综合征病 毒的药物。
5. 根据权利要求3所述的治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列的应用，其 特征在于，所述治疗和/或预防繁殖与呼吸综合征的药物为抑制预防繁殖与呼吸综合征病 毒蛋白合成的药物。
【文档编号】C12N15/113GK104195139SQ201410445817
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】尹革芬, 毕峻龙, 李文贵, 李想, 郑龙龙, 杨贵树 申请人:云南农业大学