CCGAGCGGCGAACTAA (SEQ ID NO:27)，h: AAGCGTTCTCACCATTGTCTTG (SEQ ID NO:28)，h2:GCAAGGCGATTAAGTTGGGT (SEQ ID NO:29)，i:TGCTGGAGTTCGTGACCG (SEQ ID NO:30)，j:TGCTGCTCTTGCCTCTGTAAT (SEQ ID NO:31)，p: CCGCCACCACCTGTTCCT (SEQ ID NO:32)，w:CCGATGATAAGCTGCCAAAC (SEQ ID NO:33)，
X:GACAAGCAGAAGAACGGCATCA (SEQ ID NO:34)，y:GAGCACGGAAAGACGATGAC (SEQ ID NO:35)，z:GGTGCTACGCCTGAATAAGTGA (SEQ ID NO:36)，o: ACTGATGGGCTGCCTGTA (SEQ ID NO:37)，r: CCAGCCAGTCATACAACC (SEQ ID NO:38)，q: CTCTAGCCAATACGCAAAC (SEQ ID NO:39)，p1: TAGCATTCGCCATTCAGG (SEQ ID NO:40)。
[0065]实施例4体外基因叠加转基因在拟南芥中的表达
按照实施例3中所述的方法将体外叠加的目的基因通过农杆菌介导的方法转化到拟南芥基因组中。体外叠加载体转化拟南芥后，通过除草剂抗性筛选到50株转基因植株。其中43株中通过PCR扩增了到bar基因。我们通过半定量反转录PCR检验了其中21株转基因植株中转基因的表达。由于gfp和yfp在序列上有超过90%的同源性，我们通过Pstl酶切定量反转录PCR产物来区分gfp和yfp的mRNA。半定量反转录PCR显示21株转基因植株中，一株没有表达yfp，另外一株没有表达gfp和DsRed，有四株没有表达gfp和yfp，还有一株没有表达gfp、yfp和DsRed。综上所述:14/21株检测的转基因植株表达了所有的体外叠加基因。另外，19/21株检测的植株中均通过PCR的方法扩增到了 yfp下游的Bxbl attB位点。选取2个有代表性的PCR产物测序证明其含有完整的Bxbl attB位点。该位点的存在为之后通过运用含有Bxbl attP载体进行植物体内基因叠加奠定了基础。
[0066]实施例5体外基因置加载体定点置加到含有目标位点的转基因水稻中
将AB⑶E-分子与一个表达Bxbl重组酶的载体通过基因枪的方法共转含有目标位点的转基因水稻愈伤组织(该水稻株系的基因组中含有BxblattP重组位点)。通过抗除草剂抗性筛选转化后的愈伤组织。在81个愈伤组织中，用引物wq2f+wq2r和wq3f+wq3r在其中30个愈伤组织中扩增到了至少一个目的DNA片段。该实验证明了体外基因叠加大分子DNA可以通过重组酶介导的体内基因叠加方法定点叠加到含有目标位点的转基因水稻中。
[0067]上述提到的引物序列为:
wq2f: 5’ - TCTAGGGTTCACAAGTCTGCCTAT-3’ (SEQ ID NO:41)，wq2r: 5’ -GCTCGAATGTAACTGTGATTCCAA-3’ (SEQ ID NO:42)，wq3f: 5’ - GTGCTCCACCATGTTATCACATC-3’ (SEQ ID NO:43)，wq3r: 5’ - TTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3’ (SEQ ID NO:44)。
[0068]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种体外基因叠加系统，其特征在于:该系统含有3个载体，即载体A、B、C ; 所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点Al和A2，Al与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点Al的另一端连有可逆的重组位点A’ ； 所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有BI，BI的另一端连有可逆的重组位点B’ ； 所述载体C中含有3个不可逆重组位点Cl、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有Cl，Cl的另一端连有可逆的重组位点C’ ； 所述Al、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-1 ; 所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-2 ; 所述A2、B1和Cl为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-3 ; 所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1与SEQ-2之间能够发生不可逆的位点特异性重组； 所述A’、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组； 当B3与Al位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB-; 当载体AB-中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC-; 再将载体ABC-与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC-的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。2.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于:该系统还含有载体PZH36D，载体pZH36D为pZH36在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体pZH36内同向的1x位点间发生重组，删除同向1x位点间的碱基序列，即可获得载体PZH36D。3.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于:所述位点Al、C2和C3为phiC31、TP901-l、λ、BxbUphiBTl或TGl不可逆重组系统中的其中一个重组位点，位点Β2和Β3则为能与Al、C2或C3产生不可逆重组的重组位点。4.根据权利要求1所述的一种体外定点基因叠加系统，其特征在于:所述位点Α2、BI和Cl为phiC31、TP901-l、λ、Bxbl、phiBTl或TGl不可逆重组系统中的其中一个重组位点。5.根据权利要求2或4所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于:根据位点A2、BI和Cl的具体重组位点，载体pZH36D中的Bxbl attP重组位点还可以换成能与A2、B1和Cl发生DNA整合的不可逆重组的重组位点。6.根据权利要求1所述的一种体外定点基因叠加系统，其特征在于:所述载体A中还含有筛选标记基因和复制起始位点。7.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于:所述载体B、C中均还含筛选标记基因。8.—种体外基因叠加系统的应用，其特征在于:所用的系统为权利要求1?7任一所述的体外基因叠加系统，具体应用方法包括以下步骤: 1)将需要叠加的基因分别装入载体A、B、C中的外源目的基因插入区域； 2)将带有目的基因的载体A和B在对应重组酶的作用下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B3与位点Al发生重组的产物载体AB，即实现了 2个基因的叠加； 3)将载体AB在对应重组酶的作用下使可逆重组位点A’和B’发生切除重组，即将位点A’和B’间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得产物载体记为AB-; 4)将载体AB-与带有目的基因的C载体在对应重组酶的作用下使下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B2与位点C3发生重组的产物载体ABC，即实现了 3个基因的叠加； 5)同步骤3)使载体ABC中的2个可逆重组位点发生切除重组，得产物载体ABC-； 6)根据所需叠加基因的数量，交叉循环利用载体B和C依次将每个基因叠加到载体ABC-中，操作方法同上述步骤2)?5);即可获得含多个目的基因的载体； 7)将上步所得的多基因载体中所含目的基因转入对应宿主体内。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:当步骤7)中所述的宿主为植物时，步骤7)的具体操作为:将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到植物基因组特定的座位上。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述的双元载体为pZH36D，体外叠加好的多基因载体与载体PZH36D在对应重组酶的作用下进行重组反应，筛选出载体PZH36D中不可逆重组位点与A2位点发生重组的产物载体，记为pStack ;然后利用农杆菌介导转化法将载体PStack中的多个目的基因插入植物基因组中。
【专利摘要】本发明公开了一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用。本
【发明内容】
包括体外基因叠加系列载体的元件组成及体外基因叠加方法，该方法首先利用一个非可逆的位点特异性重组系统进行两个DNA分子间的共整合，然后利用一个可逆的位点特异性重组系统将不需要的DNA序列删除，最后利用第二个不可逆的位点特异性系统将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到基因组特定的座位上本发明既满足了体外基因叠加的需要，同时又可与体内重组酶介导的基因叠加系统相兼容。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/82
【公开号】CN105112440
【申请号】CN201510496864
【发明人】区永祥, 陈伟强
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月13日