专利名称：细胞因子转染基质细胞构建功能性扩散盒的制备方法
技术领域：
本发明涉及利用DNA重组技术、阳离子脂质体介导法及免疫隔离技术获得细胞因子转染基质细胞功能性扩散盒的制备方法。
基因治疗是上世纪末涌现出的一种新型治疗模式，它的出现不仅为遗传病、糖尿病、心血管疾病、肾脏病、肿瘤等许多难治性疾病的防治带来新的希望，也为现代医学的基础理论和应用研究提供了新的手段。通过基因工程技术将目的基因导入细胞系细胞，使之能表达目的蛋白，为受体提供治疗蛋白质，从而达到治疗目的。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，血液系统疾病的细胞因子基因治疗取得了可喜的成绩，但同时受到了几大障碍而阻止了其前进的步伐1.机体对转基因细胞、载体、表达蛋白的免疫排斥。2.难以对外源基因的表达进行调控。3.可能发生恶性转化的转基因细胞移出问题(安全性问题)。这些问题使以此为基础的部分基因治疗迟迟不能进入临床。而近年来发展起来的免疫隔离技术为实现细胞因子基因疗法真正进入临床提供了一条有效的途径。
“免疫隔离”是将移植的活细胞封闭在一个能允许营养物质及细胞分泌的具有生物活性的小分子物质自由通透而限制免疫球蛋白和宿主免疫细胞等生物大分子物质进入的半透膜屏障内，以使移植的活细胞免受宿主免疫系统的攻击而长期存活并发挥其功能。它最先用于异种胰岛移植并获得成功。此后，随着免疫隔离装置的改进、基因工程的不断进步以及其它相关学科和技术的飞速发展，人们已能应用免疫隔离技术成功地移植多种生物组织，一些治疗性的免疫隔离疗法也已进入了小规模的人体实验和较大动物的研究中并取得了成功。这些向人们展示了免疫隔离疗法的广阔应用前景。
要使具备了免疫隔离要求的活细胞移入体内并发挥功能，必须要有良好而实用的隔离装置才能完成。目前包囊装置技术倍受注目，在于其可有多种形式、结实耐用、容量大、移取方便、并可移入身体内任何理想的部位，因此，可满足人类的大部分治疗的需要，是用于人类疗法最实用的形式。具备免疫隔离功能的包囊有两个关键要素1.具备隔离功能的半透膜。2.具有长期高效表达目的基因的细胞系。而半透膜必须具备三个基本条件1.高度的生物相容性；2.理想的通透性；3.极大的可塑性。目前国外在包囊材料的研究方面已经取得了初步成果，而国内尚无人涉猎。移入半透膜包囊中的细胞系也必须具备三个基本条件1.较长的生存期，取得满意的治疗时间；2.高效持续地以分泌形式表达目的基因，并通透过半透膜进入机体，达到治疗目的；3.不表达对机体有害的物质。
以往的基因治疗中应用的表达载体是将目的基因与筛选基因分别置于不同启动子控制之下，在转染靶细胞后，两基因各自转录为不同的mRNA，分别翻译成各自的蛋白。但是，通过该方法转染的靶细胞经过药物筛选获得的阳性克隆并不能保证目的基因的表达，目的基因与筛选基因的表达不具有必然的相关性。在加入药物筛选后，只有5％-30％的阳性克隆表达目的蛋白，并且表达水平不一致。这样，要获得高水平的表达，就必须从大量不同表达水平的克隆中筛选出高表达克隆。这一过程费时费力。我们采用的表达载体pIRESlneo含有IRES序列，其多克隆位点与筛选基因neo分别置于IRES的上下游，同处于能在真核细胞中高效表达的人的巨细胞病毒(CMV)的调控之下，避免了上述的缺点。
将目的基因高效率地转移到靶细胞并使之稳定表达是基因转移技术的关键之一，为提高转染效率，人们将目光集中在病毒载体上，但因其有自身的缺陷而限制了它的应用。近年来，阳离子脂质体介导法以其转染效率高、操作简便、安全无毒而受到欢迎。LipofectAMINE系多聚阳离子脂质体，与DNA及靶细胞的亲和力极其强大，具有理想的转染效率。
FL和GM-CSF均是在造血调控和免疫调节中起重要作用的细胞因子，二者联合应用具有强大的协同刺激造血干/祖细胞增殖的能力。
选择适当的靶细胞并使之能高效表达目的基因是基因治疗成功的关键。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSC)是构成造血微环境的主要成分，通过与造血细胞紧密接触而维持造血干细胞的静止状态，保证其自我更新；通过合成并分泌多种造血调控因子来调节造血干细胞的增殖和分化，从而起到造血调控的作用。基质细胞生成多种细胞因子不但直接作用于造血细胞，而且作用于基质细胞本身，当基质细胞受到造血因子刺激时增殖速度加快，其细胞因子的稳定表达状态发生改变或产生新的细胞因子。大量的实验表明骨髓基质细胞不但体内分布广泛、易于分离培养、体外基因转染率高并能稳定高效表达外源基因，充分发挥其自身功能和目的基因的自分泌和旁分泌功能。骨髓基质细胞系的建立使人们能在体外研究基质细胞和造血细胞之间相互作用及其分子机制，并且骨髓基质细胞系易于体外培养和大量扩增，因而是细胞因子基因治疗的理想靶细胞。
本发明是利用DNA重组技术、阳离子脂质体介导法并结合免疫隔离技术进行基因治疗的新方法。将造血生长因子(hGM-CSF、hFL)基因转入骨髓基质细胞(HFCL)中，将导入hFL和hGM-CSF基因的人骨髓基质细胞系HFCL细胞移入具有免疫隔离作用的自制的扩散盒内使其高效表达具有较好生物活性的hGM-CSF和hFL，目的是在提供细胞因子的基因治疗中，利用扩散盒的作用保护移入的转基因细胞存活并发挥其功能、调节转基因细胞的细胞因子分泌量以及保证突变细胞的取出，为细胞因子的基因治疗进入临床提供一条有效途径。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的分离方法。
本发明的目的是发明细胞因子转染基质细胞构建功能性扩散盒的制备方法，以使得体外能高效分泌细胞因子的转基因细胞存活并具备功能，为基因治疗的临床应用奠定基础。
下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。实施例1.HGM-CSF真核表达载体的构建与鉴定一、方法1.hGM-CSF cDNA片段的获取1)提取质粒pXM-hGM-CSF。
2)限制性内切酶切载体pXM-hGM-CSF。
3)琼脂糖电泳分离、回收hGM-CSF cDNA片段。
4)补平hGM-CSF cDNA酶切片段。2.真核表达载体的准备1)提取质粒pIRESlneo。
2)限制性内切酶切质粒pIRESlneo。
3)琼脂糖电泳分离、回收酶切后的质粒pIRESlneo。3.DNA片段的连接4.重组子的转化1)制备细菌感受态。
2)转化。5.重组子的鉴定1)提取重组子质粒2)酶切重组子3)琼脂糖凝胶电泳鉴定二、结果经上述方法成功地构建了hGM-CSF和hFL真核表达载体pIRESlneo/hGM-CSF，pIRESlneo/hFL，为进一步的目的基因在人骨髓基质细胞系中的表达研究奠定了基础。实施例2.利用脂质体介导法将表达hFL和hGM-CSF的转基因人骨髓基质细胞株的建立一、方法1真核表达载体的扩增和纯化1)质粒扩增
2)提取质粒2脂质体介导重组真核表达载体转人骨髓基质细胞系HFCL3PCR鉴定靶细胞基因组DNA中目的基因的整合1)提取细胞基因组DNA2)PCR扩增3)琼脂糖凝胶电泳观测PCR产物4RT-PCR检测靶细胞中目的基因mRNA的转录1)提取细胞总RNA2)反转录(RT-PCR)反应体系。
3)PCR反应体系4)琼脂糖凝胶电泳观测RT-PCR产物。5.Northern blot检测靶细胞中目的基因mRNA的转录1)提取细胞总RNA2)制备单链DNA探针3)Norther blot分析。6.Southern blot鉴定靶细胞基因组DNA中目的基因的整合1)提取细胞基因组DNA2)酶切基因组DNA3)取上述酶切的DNA样品10ug进行琼脂糖凝胶电泳4)Southern blot分析7.Western blot检测转染细胞培养上清中的hFL/hGM-CSF蛋白1)蛋白质的聚丙酰胺凝胶电泳2)Western blot8.ELISA法定量检测转染细胞培养上清中的hFL和hGM-CSF1)定量检测hGM-CSF2)定量检测hFL9.依赖株法检测HFCL/hGM-CSF培养上清中hGM-CSF活性10.人脐血CD34+细胞增殖实验检测HFCL/hFL细胞培养上清中hFL活性1)脐血单个核的分离2)脐血CD34+细胞的分离纯化3)细胞培养4)细胞计数5)统计学处理二、结果以阳离子脂质体LipofectAMINE介导，将重组真核表达载体pIRESlneo/hGM-CSF和pIRESlneo/hFL转染成纤维样骨髓基质细胞系HFCL细胞，药物筛选得到的阳性细胞经PCR和Southern blot分析证明细胞基因组中分别整合有外源性hGM-CSF和hFL基因；RT-PCR、Northern blot、Western blot分析显示目的基因在转基因细胞中有mRNA和蛋白质水平的表达。ELISA法hGM-CSF和hFL分泌量分别为(56.9±0.7)ng.106cells-1.d-l和(60.3±0.1)ng.106cells-1.d-1，依赖株法测得hGM-CSF活性为(6.56±-0.16)×103U。106cells-1.d-1；人脐血CD34+造血干/祖细胞增殖实验检测出良好的hFL生物学活性。实施例3.转hGM-CSF和hFL基因人骨髓基质细胞在体外扩散盒中的表达一、方法1.转基因人骨髓基质细胞在体外扩散盒中的表达。
1)移入细胞种类HFCL/hGM-CSF、HFCL/hFL、HFCL/hGM-CSF+HFCL/hFL三类。
2)移入细胞量上述三种细胞移入扩散盒内，设五个等级1×105、5×105、5×106、5×106、5×107。
3)扩散盒的应用将移入上述三种细胞的扩散盒，每一等级各设三盒。
4)扩散盒内微载体的应用扩散盒引入微载体后，每一等级浓度各设三盒。
5)对照培养。2.ELISA法定量测定扩散盒培养细胞上清中的hFL、hGM-CSF。3.扩散盒培养细胞计数与形态学观察。
1)细胞形态学观察2)细胞计数4.扩散盒培养细胞上清对脐血CD34+细胞的增殖作用1)人脐血耽搁核细胞与CD34+细胞的分离2)细胞培养3)收集细胞4)细胞计数及流式细胞仪检测5)统计学处理二、结果1.在自制的扩散盒内移入转基因人骨髓基质细胞后，细胞数量在≤106时，细胞生存状态较好，hGM-CSF、hFL的分泌量随着移入细胞量的上升而升高。共移入两种细胞的分泌量是单独移入一种细胞分泌量的一半，但是其各自的分泌量却较单独移入同等细胞量的分泌量略高，可以证明两种细胞共移入时，其各自的生存和功能的发挥均不受影响。并且体外细胞因子可持续分泌。2.移入的细胞量≥5×106时，细胞生存状态较差，说明扩散盒的容积有限，通过微载体的引入可以改善这种状况，提高移入细胞量及每盒细胞因子的表达。3.对移入扩散盒被的转基因细胞数量及形态学的观察表明，在扩散盒容纳的细胞量范围内，细胞生存状态良好，细胞可不贴壁生长，而一旦有了充分的生长空间，仍能显示其贴壁生长的特性。说明应用扩散盒培养的转基因基质细胞是可行的。
权利要求
1.细胞因子转染基质细胞构建功能性扩散盒的制备方法，其特征在于利用DNA基因重组技术、阳离子脂质体介导法及免疫隔离技术制备功能性扩散盒的方法。
2.按照权利要求1的DNA基因重组技术，其特征在于将hGM-CSF和hFLcDNA片段插入到真核表达载体pIRESlneo的多克隆酶切位点中，其多克隆位点与筛选基因neo分别置于IRES的上下游，同处于能在真核细胞中高效表达的人巨细胞病毒(CMV)的调控之下。这样，目的基因与筛选基因在转录后处于同一条mRNA上，并通过IRES的作用分别翻译为各自的蛋白。这就保证了目的基因与筛选基因的共同表达。
3.按照权利要求1的阳离子脂质体介导法，其特征在于转染效率高、操作简便、安全无毒。LipofectAMINE系多聚阳离子载体，与DNA及靶细胞的亲和能力极强大，具有理想的转染效率。
4.按照权利要求1的免疫隔离技术，其特征在于利用免疫隔离装置即自制扩散盒，将转hGM-CSF和hFL基因的人骨髓基质细胞系HFCL细胞移入扩散盒内，进行体外培养、表达、分泌及功能研究。
全文摘要
本发明是利用DNA重组技术、阳离子脂质体介导法并结合免疫隔离技术进行基因治疗的新方法。将造血生长因子(hGM－CSF、hFL)基因转入骨髓基质细胞(HFCL)中,将导入hFL和hGM－CSF基因的人骨髓基质细胞系HFCL细胞移入具有免疫隔离作用的自制的扩散盒内使其高效表达具有较好生物活性的hGM－CSF和hFL,目的是:在提供细胞因子的基因治疗中,利用扩散盒的作用保护移入的转基因细胞存活并发挥其功能、调节转基因细胞的细胞因子分泌量以及保证突变细胞的取出,为细胞因子基因治疗的临床应用提供一条新的有效途径。
文档编号C12N15/87GK1341453SQ01142079
公开日2002年3月27日 申请日期2001年9月11日 优先权日2001年9月11日
发明者裴雪涛, 马俐君, 王冬梅, 白慈贤, 南雪, 张怡堃 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所