专利名称：一种由多菌株联合液态发酵制备氢气的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制氢技术，具体地说涉及一种由多菌株联合液态发酵制备氢气的方法。
到目前为止，利用含有碳水化合物、蛋白质等物质通过厌氧细菌进行生物制氢的研究主要采用纯菌种发酵，有文献(Fumiaki Taguchi，NaokiMizukami，et al.，Enzyme ang Microbial Technology 17147-150，1995.)报道利用纤维物质，液态培养单一厌氧菌制氢，该文献利用含有碳水化合物、蛋白质等物质通过厌氧细菌进行生物制氢的研究主要采用纯菌种发酵，同时也在采用纤维物质替代碳水化合物。
现在研究方向一方面寻找产氢量高的微生物，另一方面则致力于产氢工艺的研究，使微生物产氢技术向实用化阶段发展。这方面的报道可参阅微生学通报，1993，20(5)，259-262。
本发明采用两株厌氧菌丁酸梭菌1.209和1.335以及两株兼性需氧菌麦芽糖假丝酵母2.1376和产气肠杆菌1.2021，并以PYFG培养基为基础，添加微量元素溶液配制成种子培养基和液体发酵培养基，制备氢气的步骤如下(1)将两株兼性需氧菌分别接种于斜面培养基上，进行好氧培养；将两株厌氧菌分别接种于斜面培养基上，进行厌氧培养；(2)将步骤(1)培养的两株兼性需氧菌分别接种于液体种子培养基上好氧培养；将步骤(1)培养的厌氧菌分别接种于液体种子养基上厌氧培养；(3)将液体发酵培养基装于发酵罐中，灭菌，将上述四种菌的种子液同时加入到液体发酵培养基中，混合均匀后发酵产氢。
具体地说，本发明提供的一种由多菌株联合液态发酵制备氢气的方法如下(1)采用的菌种为两株厌氧菌丁酸梭菌1.209和1.335(Clostridium butylicum 1.209、Clostridium butylicum 1.335)；两株兼性需氧菌麦芽糖假丝酵母2.1376(Candida malota 2.1376)和产气肠杆菌1.2021(Enterobacter aerogenes 1.2021)；(2)以PYFG培养基为基础，添加微量元素制得种子培养基和液体发酵培养基，其配方如下Trypticase(BBL)10g，Yeast extract(Difco)5g，Fildes solution 40ml，Saltssolution 40ml，L-Cysteine HCL·H2O 0.5g，葡萄糖10g，微量元素溶液10ml，蒸馏水920ml，pH7.2。
其中Fildes solution的配制为生理盐水150ml，浓盐水6ml，脱纤维马血液50ml，胃蛋白酶(1∶10,000，Difco)1g，将上述成分250ml混合，55℃恒温水浴10小时保持消化，加20％氢氧化钠溶液12ml调整pH为7.6(用盐酸或氢氧化钠修正)，加2ml氯仿后4℃冷藏保存。
其中Salts solution的配制为无水CaCl20.2g，KH2PO41g，MgSO40.2g，K2HPO41g，NaCl 2g，NaHCO310g，蒸馏水100ml。先将CaCl2、MgSO4在300ml蒸馏水中溶解，然后边搅拌边添加蒸馏水至500ml，再将其他盐类加入，待完全溶解后，再添加200ml蒸馏水，混合后在4℃冷藏保存。
其中微量元素溶液的配制为在1L培养基中加入生物素0.2mg，对氨基苯甲酸2mg，维生素B12mg，维生素B12 0.2mg，泛酸钙2mg，尼克酸2mg，盐酸吡哆醛2mg，叶酸0.5mg。
(3)将两株兼性需氧菌分别接种于斜面培养基上，分别于28℃和37℃好氧培养18-24小时；将两株厌氧菌分别接种于斜面培养基上于30-37℃厌氧培养24-48小时；(4)将步骤(3)培养的两株兼性需氧菌分别接种于20-50ml液体种子培养基上于28℃和37℃好氧培养18-24小时；将步骤(3)培养的厌氧菌分别接种于20-50ml液体种子养基上于30-37℃厌氧培养20-36小时；(5)将液体发酵培养基500-2000ml装于发酵罐中，121℃灭菌20-30分钟。将上述四种菌的种子液，按总接种量5-20％同时加入到液体发酵培养基中，各菌接种比例为1-3∶1-3∶1-3∶1-3，混合均匀后于37℃连续发酵2-5天；(6)采用气相色谱仪检测氢气含量，以氩气为载气，进样量为500μl，以外标法计算氢含量，收集并测定总气体体积。
本发明具有以下优点(1)采用的四种菌株具有繁殖速度快，生长旺盛，产氢能力强等特点；(2)采用多菌种联合发酵法，利用这四种菌株间的协同作用，发酵过程中首先利用兼性需氧菌生长过程中对氧气的需要和消耗，为厌氧菌创造一个比较好的厌氧环境，同时，兼性需氧菌的代谢产物为厌氧菌的生长提供了一定的物质基础，接着包括两种严格厌氧菌在内的四种菌株开始发酵产氢；(3)四种菌株在厌氧条件下联合发酵产氢，比单一菌种发酵产氢量高；(4)四种菌株发酵代谢产生的气体只有氢气和二氧化碳，从而便于大量地分离和收集氢气。
其中Fildes solution的配制为生理盐水150ml，浓盐水6ml，脱纤维马血液50ml，胃蛋白酶(1∶10,000，Difco)1g，将上述成分250ml混合，55℃恒温水浴10小时保持消化，加20％氢氧化钠溶液12ml调整pH为7.6(用盐酸或氢氧化钠修正)，加2ml氯仿后4℃冷藏保存。
其中Salts solution的配制为无水CaCl20.2g，KH2PO41g，MgSO40.2g，K2HPO41g，NaCl 2g，NaHCO310g，蒸馏水100ml。先将CaCl2、MgSO4在300ml蒸馏水中溶解，然后边搅拌边添加蒸馏水至500ml，再将其他盐类加入，待完全溶解后，再添加200ml蒸馏水，混合后在4℃冷藏保存。
其中微量元素溶液的配制为在1L培养基中加入生物素0.2mg，对氨基苯甲酸2mg，维生素B12mg，维生素B12 0.2mg，泛酸钙2mg，尼克酸2mg，盐酸吡哆醛2mg，叶酸0.5mg。
2、配制液体发酵培养基，其成分及配制方法同种子培养基。
3、发酵工艺(1)将麦芽糖假丝酵母2.1376和产气肠杆菌1.2021分别接种于新鲜斜面培养基上，分别于28℃和37℃好氧培养24小时，将丁酸梭菌1.209和1.335分别接种于新鲜斜面培养基上于37℃厌氧培养48小时；(2)将麦芽糖假丝酵母2.1376和产气肠杆菌1.2021分别接种于20ml液体种子培养基上于28℃和37℃好氧培养18小时，将丁酸梭菌1.209和1.335分别接种于20ml液体种子养基上于37℃厌氧培养24小时；(3)将液体发酵培养基1500ml装于发酵罐中，121℃灭菌30分钟，将上述四种菌种的种子液，按总接种量10％同时加入到液体发酵培养基中，各菌接种比例为1∶1∶1∶1，混合均匀后于37℃连续发酵2天，每隔6小时取样一次，测定产氢量，收集并测定总气体体积；(4)采用GC-9790气相色谱仪检测氢气含量，以氩气为载气，进样量为50μl，以外标法计算氢含量；连续发酵时间48小时，代谢产生的气体只有氢气和二氧化碳，总共收集取得气体3.6L，其中氢气产生量约0.76L，氢气平均浓度约为21％。
实施例2发酵工艺中，四种菌种的种子液按总接种量5％同时加入到液体发酵培养基中，各菌种比例为1∶2∶2∶1，连续发酵5天，其余同实施例1。
实施例3四种菌种的种子液按总接种量20％同时加入到液体发酵培养基中，各菌种比例为3∶1∶2∶3，连续发酵3天，其余同实施例1。
比较例(1)将丁酸梭菌1.209和1.335分别接种于新鲜斜面培养基上于37℃厌氧培养48小时；(2)将丁酸梭菌1.209和1.335分别接种于20ml液体种子养基上于37℃厌氧培养24小时；(3)将液体发酵培养基1500ml装于发酵罐中，121℃灭菌30分钟，将上述菌种的种子液，按总接种量10％同时加入到液体发酵培养基中，混合均匀后于37℃连续发酵2天，每隔6小时取样一次，测定产氢量，收集并测定总气体体积；(4)采用GC-9790气相色谱仪检测氢气含量，以氩气为载气，进样量为50μl，以外标法计算氢含量；连续发酵时间48小时，代谢产生的气体只有氢气和二氧化碳，总共收集取得气体0.9L，其中氢气产生量约0.036L，氢气平均浓度约为4.0％。
权利要求
1.一种由多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，采用两株厌氧菌丁酸梭菌1.209和1.335以及两株兼性需氧菌麦芽糖假丝酵母2.1376和产气肠杆菌1.2021，并以PYFG培养基为基础，添加微量元素溶液配制成种子培养基和液体发酵培养基，其特征在于，制备氢气的步骤如下(1)将两株兼性需氧菌分别接种于斜面培养基上，进行好氧培养；将两株厌氧菌分别接种于斜面培养基上，进行厌氧培养；(2)将步骤(1)培养的两株兼性需氧菌分别接种于液体种子培养基上好氧培养；将步骤(1)培养的厌氧菌分别接种于液体种子养基上厌氧培养；(3)将液体发酵培养基装于发酵罐中，灭菌，将上述四种菌的种子液同时加入到液体发酵培养基中，混合均匀后发酵产氢。
2.根据权利要求1所述的多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，其特征在于，步骤(1)中好氧培养的条件是，培养温度分别为28℃和37℃，培养时间18-24小时；厌氧培养的条件是，培养温度为30-37℃，培养时间24-48小时。
3.根据权利要求1所述的多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，其特征在于，步骤(2)中接种的液体种子培养基的体积均为20-50ml，好氧培养的条件为，培养温度分别为28℃和37℃，培养时间18-24小时；厌氧培养的条件为，培养温度为30-37℃，培养时间20-36小时。
4.根据权利要求1所述的多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，其特征在于，步骤(3)中装于发酵罐中的液体发酵培养基的四种菌的种子液加入量为总接种量5-20％，各菌接种比例为1-3∶1-3∶1-3∶1-3，发酵温度为37℃，时间为2-5天。
5.根据权利要求1或4所述的多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，其特征在于，步骤(3)进行发酵后后采用气相色谱仪检测氢气含量。
全文摘要
一种由多菌株联合液态发酵制备氢气的方法，采用四种菌株，其中两株厌氧菌，两株兼性需氧菌；以PYFG培养基为基础，添加微量元素制得种子培养基和液体发酵培养基；将培养的四种菌株同时加入到装有液体发酵培养基的发酵罐中，连续发酵数天；采用气相色谱仪检测氢气含量，以氩气为载气，以外标法计算氢含量，收集并测定总气体体积。
文档编号C12P3/00GK1403578SQ01142019
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月6日 优先权日2001年9月6日
发明者李雪驼, 刘波, 王海岩, 徐和利, 赵静玫, 孙艳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所