专利名称：荧光假单胞杆菌、用于果蔬防病保鲜的菌剂及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及微生物菌剂，尤其是一种荧光假单胞杆菌、用于果蔬防病保鲜的菌剂及其生产工艺，即能够产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，Phl)的荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)及其菌剂、菌剂的生产工艺。
当前果品，特别是芒果、甜瓜的保鲜和采后防病，主要是借助于采后使用化学杀菌剂进行控制，常用药剂主要有苯菌灵、双胍盐、噻菌灵、联苯酚钠等。然而，长期的使用化学农药不仅会导致病菌产生抗药性，同时生产上频繁和高浓度地使用化学药剂造成的残留问题也直接威胁着人类的健康。目前一些化学制剂正面临被禁止采后使用，其中包括当今甜瓜病害防治策略中必不可少的苯菌灵。随着经济发展和人们生活水平的提高，要求无公害食品的呼声日益强烈，投资少，防效好，毒性低的天然微生物保鲜制剂正逐步受到人们的重视。
目前美国等已将两种防治水果采后病害的拮抗生物登记注册(Huang，1995)，并且也有研究表明一些荧光假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)兼有防治植物病害、促进植物生长发育及提高产量的作用，但仍未见有关拮抗生物在防治甜瓜和芒果病害上的应用。并且由于培养条件和生产工艺的影响，菌剂的工业化生产也受到一定的限制。
本发明的目的二是提供一种荧光假单胞杆菌剂，用于果蔬采摘后的防病保鲜。
本发明的目的三是提供一种荧光假单胞杆菌剂的培养基的组分，用于制成果蔬采摘后防病保鲜的菌剂。
本发明的目的四是提供一种荧光假单胞杆菌剂的生产工艺，用于制作果蔬采摘后防病保鲜的菌剂，工艺科学。
本发明的目的是这样实现的一种荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)CPF-10 CGMCC0621。
所述荧光假单胞杆菌为能够产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，Phl)的细菌。
所述菌为革兰氏阴性菌，菌体杆状，0.7-0.8×2.3-2.8微米，单极丛生鞭毛，化能异样型，专性好氧，有精氨酸双水解酶，该菌菌落在金氏培养基(KB)上为无色，或有稍许黄色，老龄菌落黄色较为明显；菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，产荧光色素，紫外灯下可观察到荧光，长时间培养产生红褐色色素。
一种荧光假单胞杆菌菌剂，所述菌剂包括荧光假单胞菌CPF-10及培养基、水和填充料。
所述荧光假单胞杆菌菌剂的培养基的组分至少包括淀粉、植物蛋白、植物脂肪、粗纤维。
所述培养基的组分为玉米粉、豆饼粉、麸皮粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、消泡剂、花生油。
所述培养基各组分的配方为玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％、麸皮粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％、KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％、消泡剂0.01-0.1％、花生油0.2-0.4％，其余为水。消泡剂0.01-0.1％、花生油0.2-0.4％，其余为水。
所述培养基的组分的最佳配方为玉米粉3.0％、豆饼粉3.0％、麦麸粉3.0％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、消泡剂0.05％、花生油0.3％。
所述填充料为凹凸棒土。
所述荧光假单胞杆菌菌剂的生产工艺，至少包括如下步骤1)培养菌株；2)制作培养基并发酵；3)加入填充料；4)加入助剂MgSO4。
所述生产工艺还包括所述步骤1)培养菌株包括培养斜面种子菌株和培养茄瓶种子菌株；2)加入填充料后搅拌、压滤；3)板框过滤；4)加入助剂MgSO4。
采用该工艺生产的菌剂含水量为40％。
具体地讲，本发明涉及的新的微生物，属于细菌的假单胞杆菌属，荧光假单胞杆菌种(Pseudomonas fluorescens)，名称为CPF-10，简称为CPF-10菌，它能够产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，Phl)，该菌株已于2001年8月28日保藏在中国微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC0621。
CPF-10菌分离自山东省小麦全蚀病自然衰退土壤，分离方法为平板稀释分离法，应用聚合酶链式反应(PCR)证明该菌能够产生一种名为2，4-二乙酰基藤黄酚的抗生素。
CPF-10菌具有如下性质1、形态特征该菌为革兰氏阴性菌，菌体杆状，0.7-0.8×2.3-2.8微米，单极丛生鞭毛，化能异样型，专性好氧，有精氨酸双水解酶。
2、菌落情况该菌菌落在金氏培养基(KB)为无色，或有稍许黄色，老龄菌落黄色较为明显；菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，产荧光色素，紫外灯下可观察到荧光，长时间培养(7天以上)产生红褐色色素。
3、培养条件最适宜的生长温度为28-32℃，最适宜的pH值为6.5-8.0，一般可在KB培养基或其它洋菜培养基上培养。
经过对30种病原菌进行测定，发现本发明的菌株在KB培养基上对85％的病原菌有抑制作用，而国外菌株只对60％的病原菌有抑制作用。
本发明的菌株与国外菌株对某些典型病原菌在抑菌谱和抑菌强度上的差异(单位抑菌带mm)本菌株 国外菌株油菜菌核病菌 8.5 1.0烟草赤星病菌 9.0 4.0棉花枯萎病菌 4.8 0本发明的菌株与国外菌株防效对比(单位％)本菌株国外菌株番茄青枯病 6436黄瓜采后腐烂病 8755沙打旺根腐病 6445本发明的菌株与国外现有菌株的不同点1分离地点不同本菌株分离自中国小麦全蚀病自然衰退土壤，国外菌株分离自烟草黑根腐病抑制土壤或棉花根际分离而来。
2防治对象不同国外现有菌株黄瓜猝倒病，烟草黑根腐病，马铃薯孢囊线虫病、小麦根腐病和褐斑病等。
本发明的CPF-10菌株蔬菜果品采后腐烂病，蔬菜细菌性青枯病、白菜软腐病、小麦全蚀病、烟草病毒病和赤星病、中药材根部腐烂病，草坪病害等。
正是由于本发明的CPF-10菌能够产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚的荧光菌，该类抗生素及产生菌的特点是拮抗性强，抑菌谱广，具有抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗蠕虫等作用，可有效地控制其它药剂不易解决的果品采后发生的炭疽腐烂病、根霉菌腐烂病、镰刀菌腐烂病、链格孢菌腐烂病等导致果品腐败变质的病害，使果品能够延长保存期并为远距离运输提供保障。对芒果、甜瓜、黄瓜、茄子等果品蔬菜的采后病害具有显著的防效，可以与常规化学农药相媲美，同时对一些土传病原菌引起的根部病害和苗期病害也有较为理想的控制作用。
因此利用该细菌制成的生物菌剂可用于果品蔬菜的采后保鲜，以及土传病害的生物防治等，使用方法为蘸果、拌种、灌根等。
本发明涉及的菌剂是上述的拮抗性荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens CPF-10)为主要成分的生物制剂，用于蔬菜瓜果采后保鲜防病。
与传统的抗生素产品和以抗生素为主的抗生菌制剂有所不同的是，该制剂并不片面地强调菌剂的抗生作用，而是从定殖、营养竞争等多方面综合作用，从多种途径控制病原菌的生长繁殖，从而起到抗病效果，由于其抗病途径多，机制复杂，病原菌难以适应，因而不易发展出对新型生物菌剂的抗药性，对人类和环境也更为安全。
本发明提出的生物保鲜防病剂可应用于需要无农药残留、长时间保存的果品，特别是甜瓜和芒果的采后保鲜防病领域。可有效地控制其它药剂不易解决的果品采后发生的炭疽腐烂病、根霉菌腐烂病、镰刀菌腐烂病、链格孢菌腐烂病等导致果品腐败变质的病害，使果品能够延长保存期并为远距离运输提供保障。为该制剂提供的生产工艺流程解决了长期存在的工业规模生产难的问题，成本低于化学农药，生产上使用方便，无污染环境及残留等问题。
本发明的生物保鲜防病剂可制成粉剂，用于果品蔬菜的采后保鲜，粉剂中活菌数大于20亿/克，使用方法为将原药稀释100-1000倍后浸果，若在生长期增加一次用药效果更佳。
本发明所述的荧光假单胞杆菌菌剂包括荧光假单胞菌CPF-10及培养基、水和填充料。
所述的培养基组分为玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％麸皮粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％消泡剂0.01-0.1％、花生油0.2-0.4％最优组成为3.0％玉米粉，3.0％豆饼粉，3.0％麦麸粉，2.15％K2HPO4，0.8％KH2PO4，0.075％MgSO4，0.05％消泡剂，0.3％花生油。
荧光假单胞杆菌菌剂的生产工艺流程斜面种子——茄瓶种子——种子罐——发酵罐——加填充料——板框过滤——加入助剂——风干——粉碎——检验——包装工艺条件种子菌株的培养是在KB(琼脂18克，蛋白胨20克，甘油10毫升，MgSO4.7H2O，1.5，K2HPO4，1.5，水1000毫升，pH7.0-7.4)培养基上，发酵罐内培养温度为26-35℃，pH保持在6.4-8.0，通风量为1∶0.5-0.8，罐压为1.5-2.0/cm2，搅拌速度为220rpm，24-30小时发酵完毕。加入的填充料为200目的凹凸棒土，然后进行压滤，加入助剂充分地混合，遮荫风干，使粉剂的含水量为30-40％时即可粉碎包装，形成含活菌为20亿/克的原菌粉。
荧光假单胞菌CPF-10菌株菌粉的工业生产实施例1、斜面种子菌株以KB培养基培养荧光假单胞菌CPF-10菌株，贮存于4℃冰箱内，使用前取出并活化两次。
2、茄瓶种子菌株以KB培养基在250毫升茄瓶中培养，培养温度为28-32℃，24小时生长良好时用灭菌生理盐水洗下，作为发酵罐的接种物。
3、发酵罐按罐体积的2/3投培养基，培养基组成为3.0％ 玉米粉，3.0％ 豆饼粉，3.0％ 麸皮粉，2.15％ K2HPO4，0.8％ KH2PO4，0.075％ MgSO4，0.05％ 消泡剂，0.3％ 花生油。起始pH7.2-8.0。
从茄瓶向发酵罐接种时，每吨发酵培养基的接种量不能少于1个茄瓶的培养物，从种子罐向生产罐接种时，接种量3-5％。
条件控制培养温度为28-35℃，pH为6.4-8.0，通风量为1∶0.5-0.8，罐压为1.5-2kg/cm2，搅拌速度为220rpm.，接种12小时后每隔2小时取样一次，以灭菌水稀释10-100倍后在显微镜下用血球计数板计数菌体细胞，并用番红染色观察菌体是否正常，是否有污染等。发酵约30小时，菌数达到100亿则可以停止发酵。
4、加填充料将发酵完毕的培养液转移到贮罐，按发酵液体积的10％边搅拌边加入200目的凹凸棒土，加毕后继续搅拌30分钟，然后进行压滤。
5、板框过滤将贮罐中的混合物边搅拌边向板框压滤机转移，进行压滤操作，压滤开始时，前4个小时内的压力不应当高于2公斤/平方厘米，视滤清液是否有好的透明度而定；压滤时间如超过4小时，压力可逐渐加大至4公斤/平方厘米。
6、加入助剂根据液体发酵液的菌数，换算为加工成标准规定的菌数时的原粉数量，据此数量的1.5％加入助剂，均匀打浆，使助剂与菌体-凹凸棒土混合物充分地混合。
7、风干将滤饼与助剂的混合物摊开在干净的光滑平台上，遮荫风干使混合物含水量达到40％，风干过程中料温不能超过30℃。
8、粉碎用对辊式粉碎机粉碎，粉碎时料温不能超过30℃。
9、检验按产品企业标准的有关规定进行各项指标的测定。
上述工艺可生产出含活菌为20亿/克的菌粉剂。
权利要求
1.一种荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)CPF-10CGMCC0621。
2.如权利要求2所述荧光假单胞杆菌，其特征在于所述荧光假单胞杆菌为能够产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，Phl)的细菌。
3.如权利要求1或2所述的荧光假单胞杆菌，其特征在于所述假单胞杆菌为革兰氏阴性菌，菌体杆状，0.7-0.8×2.3-2.8微米，单极丛生鞭毛，化能异样型，专性好氧，有精氨酸双水解酶，该菌菌落在金氏培养基(KB)上为无色，或有稍许黄色，老龄菌落黄色较为明显；菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，产荧光色素，紫外灯下可观察到荧光，长时间培养产生红褐色色素。
4.一种用于果蔬防病保鲜的荧光假单胞杆菌菌剂，其特征在于所述菌剂包括荧光假单胞菌CPF-10及培养基、水和填充料。
5.如权利要求4所述荧光假单胞杆菌菌剂，其特征在于所述培养基的组分为玉米粉、豆饼粉、麸皮粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、消泡剂、花生油。
6.如权利要求6所述荧光假单胞杆菌菌剂，其特征在于所述培养基各组分的配方为玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％、麸皮粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％、KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％、消泡剂0.01-0.1％、花生油0.2-0.4％，其余为水。
7.如权利要求6或7所述荧光假单胞杆菌菌剂，其特征在于所述培养基的组分的最佳配方为玉米粉3.0％、豆饼粉3.0％、麦麸粉3.0％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、消泡剂0.05％、花生油0.3％。
8.如权利要求4所述荧光假单胞杆菌菌剂，其特征在于所述填充料为凹凸棒土。
9.如权利要求4所述荧光假单胞杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述生产工艺包括步骤1)培养菌株，即培养斜面种子菌株和培养茄瓶种子菌株；2)制作培养基并发酵；3)加入填充料搅拌、压滤；4)板框过滤；5)加入助剂MgSO4。
10.如权利要求9所述荧光假单胞杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于采用该工艺生产的菌剂含水量为40％。
全文摘要
本发明涉及一种产生抗生素2，4－二乙酰基藤黄酚的荧光假单胞杆菌CPF－10及其荧光假单胞杆菌菌剂，该菌株于2001年8月28日保藏在中国微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC0621，该细菌分离自山东省小麦全蚀病自然衰退土壤，该菌为革兰氏阴性菌，菌体杆状，单极丛生鞭毛，化能异样型，专性好氧，有精氨酸双水解酶，菌落无色，圆形，边缘整齐，有光泽，产荧光色素，较长时间培养产生红褐色色素。该菌对多种病原真菌和病原细菌具有强烈的抑制作用，利用该细菌及组分为玉米粉、豆饼粉、麸皮粉、K
文档编号C12P7/22GK1403568SQ0114206
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月10日 优先权日2001年9月10日
发明者唐文华, 张力群, 王烨, 杨合同, 周洪友 申请人:唐文华